nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris (l ex fr ) mới nhập nội ở việt nam

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng đến sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 1 .... Nghiên cứu ảnh hưởng c

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS ĐOÀN VĂN LƯ

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn là công trình của tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này là trung thực Mọi nguồn thông tin sử dụng trong Luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, Ngày… tháng … năm 2015

ỦY VIÊN THƯ KÝ HỘI ĐỒNG

TS Trần Anh Tuấn

TÁC GIẢ

Trần Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận được sự động viên và giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp Lãnh đạo, các tập thể và cá nhân

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đoàn Văn Lư - Bộ môn Rau - Hoa - Quả - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luân văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Lãnh đạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam, tập thể các thầy cô trong Ban Đào tạo sau đại học, các thầy cô bộ môn Rau - Hoa

- Quả đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ, tạo mọi điều kiện của Ban Giám đốc Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật và tập thể cán bộ nhân viên trong Trung tâm đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn

Tự đáy lòng mình, tôi luôn biết ơn Gia đình và bạn bè đã động viên và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, Ngày… tháng … năm 2015

Tác giả

Trần Thu Hà

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Danh mục đồ thị ix

Danh mục chữ viết tắt x

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

3 Yêu cầu của đề tài 2

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Sơ lược về nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 3

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 3

1.1.2 Sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 3

1.1.3 Giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 5

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 9

1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể 12

1.2.1 Khái niệm công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể 12

1.2.2 Điều kiện nhân giống nấm dạng dịch thể 13

1.2.3 Tính ưu việt của công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể 14

1.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên thế giới và ở Việt Nam 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo trên Thế giới 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam 27

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 33

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 33

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 34

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 34

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 34

2.3 Nội dung nghiên cứu 34

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4.1 Thiết kế thí nghiệm 34

2.4.2 Bố trí thí nghiệm 43

2.4.3 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi 43

2.5 Quy trình chuẩn bị thí nghiệm 45

2.5.1 Nhân giống cấp 1 nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 45

2.5.2 Nhân giống cấp 2 nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris dạng dịch thể 46

2.5.3 Nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 46

2.6 Phương pháp xử lý số liệu: 47

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng đến sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 1 48

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 1 48

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 1 50

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường, nguồn dinh dưỡng cacbon, nguồn dinh dưỡng nito, cường độ lắc, tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 52

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trưởng đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 52

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 55

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nito tới sinh trưởng,

phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 58

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ lắc tới sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 61

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dịch thể 65

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon, dinh dưỡng nitơ, nhiệt độ, cường độ ánh sáng đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nuôi trồng 68

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon đến sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nuôi trồng 68

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nito đến sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nuôi trồng 73

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hình thành, phát triển quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nuôi trồng 78

3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ ánh sáng đến hình thành, phát triển quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trong giai đoạn nuôi trồng 80

3.4 Xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris mới nhập nội ở Việt Nam 83

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85

1 Kết luận 85

2 Kiến nghị 86

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 88

PHỤ LỤC 94

DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang

1.1 Thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris 8

3.1 Sinh trưởng của hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp

1 ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau 49

3.2 Sinh trưởng của hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp

1 ở các điều kiện ánh sáng khác nhau 51

3.3 Sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps

militaris tại các giá trị pH khác nhau 53

3.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm

Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 56

3.5 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nito tới sinh trưởng, phát triển hệ sợi

nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 59

3.6 Ảnh hưởng của chế độ lắc tới sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 62

3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm

Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 65

3.8 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh trưởng hệ sợi nấm Đông trùng hạ

thảo Cordyceps militaris 69

3.9 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hình thành, phát triển quả thể nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris 71

3.10 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon đến đặc điểm quả thể và

năng suất sinh vật học của Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 72

3.11 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ tới sinh trưởng, phát triển hệ

sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 74

3.12 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nitơ đến hình thành, phát triển quả

thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 75

3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hình thành, phát triển quả thể nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris 78

3.14 Ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới hình thành và phát triển quả

thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 81

DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang

1.1 Hình thái quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 5

1.2 Hợp chất Cordycepin, adenosine trong nấm Đông trùng hạ thảo 7

3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris 50

3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng tới sinh trưởng hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris 52

3.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm

Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 55

3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon tới sinh trưởng, phát tiển hệ

sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 58

3.5 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng nito đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi

nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 60

3.6 Ảnh hưởng của cường độ lắc tới sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 64

3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đông trùng

hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 67

3.8 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon đến hệ sợi nấm Đông trùng hạ

thảo Cordyceps militaris sau 7 ngày cấy giống 70

3.9 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon đến số lượng mầm quả thể

nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 73

3.10 Hình thái quả thể Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên các

nguồn dinh dưỡng nitơ khác nhau 77

3.11 Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên các nguồn dinh dưỡng nitơ

khác nhau 77

3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành quả thể nấm Đông trùng hạ

thảo Cordyceps militaris 80

3.13 Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tới sự hình thành quả thể nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris 83

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Tên đồ thị Trang

1.1 Sản lượng nấm trên Thế giới từ năm 2000 - 2013 26

1.2 Năng suất nấm của một số quốc gia trên Thế giới năm 2013 26

1.3 Sản lượng nấm Việt Nam từ năm 2000 - 2013 31

3.1 Ảnh hưởng của chế độ lắc tới sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 63

3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris cấp 2 dịch thể 66

Czapek Yeast Extract aga

Đông trùng hạ thảo

Tổ chức Nông lương Liên hợp Quốc Khuẩn lạc cầu

Oxygen Dissolve Potatose dextrose Aga

Severe acute respiratory syndrome

Sabouraud Maltose aga plus Yeast Extract Sabouraud Dextrose aga plus Yeast Extract Volume/Volume/Minute (Thể tích không khí/thể tích dịch/phút) Yeast Magnessium Kali

Yeast Potatose Dextrose Agar

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Đông trùng hạ thảo (ĐTHT) (Cordyceps militaris) là một loài nấm ký sinh

trên côn trùng, từ lâu đã được biết đến như một loại thảo dược quý hiếm và có nhiều tác dụng trong y học cũng như bồi bổ cơ thể Trong các sách y học cổ của Trung Hoa và Tây Tạng, ĐTHT được xem là có sự cân bằng tuyệt vời giữa âm, dương và có thể chữa được nhiều loại bệnh hiểm nghèo như ung thư, thận và tăng cường hệ miễn dịch của con người

Trước đây, ĐTHT chỉ có thể thu thập trong môi trường tự nhiên ở những điều kiện và thời điểm nhất định Tuy nhiên,với sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ trong lĩnh vực nông nghiệp thời gian qua, nhiều quốc gia đã thành công trong việc nuôi trồng nhân tạo ĐTHT nhằm hạ giá thành và cung cấp đa dạng các sản phẩm tốt cho sức khỏe con người nhiều hơn Từ những năm đầu của thể kỷ

20 Trung Quốc, Hàn Quốc đã bắt đầu xây dựng và phát triển công nghệ nuôi trồng ĐTHT và hiện nay đang là những nước dẫn đầu thế giới về nuôi trồng nhân tạo loài nấm này

Ở Việt Nam, ĐTHT là sản phẩm nấm dược liệu được người tiêu dùng ưa chuộng và tìm mua với giá thành cao, lên đến hàng chục triệu đồng/1kg Công nghệ nuôi trồng loại nấm này cũng đã bắt đầu hình thành và phát triển ở Việt Nam Tuy nhiên, chúng hiện mới chỉ phát triển nhỏ lẻ, tự phát, với rất nhiều các phương pháp khác nhau, rất ít các công trình nghiên cứu được triển khai một cách khoa học

và bài bản Các công nghệ này đang gặp phải rất nhiều rất nhiều vấn đề, trong đó cơ chất và các điều kiện nhân giống, nuôi trồng không đảm bảm, năng suất và chất lượng ĐTHT không đạt được như mong muốn, sản phẩm có bề ngoài không bắt mắt, giá trị dược liệu thấp khiến cho sản phẩm của chúng ta không thể so sánh được với các nước khác Hầu hết các sản phẩm nấm ĐTHT trên thị trường Việt Nam hiện nay đều có nguồn gốc từ nước ngoài, chủ yếu là Trung Quốc, Hàn Quốc

Để giải quyết được những vấn đề tồn tại trên việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.ex Fr.) mới nhập nội ở Việt Nam” là việc làm rất cần

thiết Kết quả của đề tài không những giải quyết được các vấn đề trong công nghệ nuôi trồng ĐTHT hiện nay mà còn góp phần làm phong phú, đa dạng sản phẩm ngành sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Xây dựng được quy trình kỹ thuật nhân giống nấm ĐTHT Cordyceps militaris mới nhập nội đạt năng suất và hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện sản xuất ở Việt Nam

3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được sự ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng tới đặc điểm sinh trưởng, phát triển hệ sợi giống nấm ĐTHT trong giai đoạn nhân giống cấp 1

- Xác định được sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon, nguồn dinh dưỡng nitơ, pH môi trường dinh dưỡng, cường độ lắc giống, tỷ lệ giống cấy đến đặc điểm sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm ĐTHT trong giai đoạn nhân giống cấp 2 dạng dịch thể

- Xác định được sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon, nguồn dinh dưỡng nitơ, nhiệt độ, cường độ chiếu sáng đến sinh trưởng, phát triển nấm ĐTHT trong giai đoạn nuôi trồng

4 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Việc xác định được một số đặc điểm sinh học như đặc điểm hệ sợi, đặc điểm quả thể nấm ĐTHT ở các cấp giống sẽ là cơ sở khoa học phục vụ cho những nghiên cứu về nấm ĐTHT tiếp theo

- Việc đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến khả năng phát triển của hệ sợi, sự hình thành và phát triển quả thể nấm ĐTHT là cơ sở để nghiên cứu và xây dựng kỹ thuật công nghệ nhân giống và nuôi trồng nấm ĐTHT tiếp theo

5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài có ý nghĩa to lớn trong việc phát triển công nghệ nhân giống nấm ĐTHT và công nghệ nuôi trồng nấm ĐTHT ở Việt Nam nói riêng, đồng thời góp phần cho sự phát triển hơn nữa của ngành nấm nói chung

Chương 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Sơ lược về nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

1.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

Theo tạp chí STINFO (2015) Đông trùng hạ thảo là tên gọi chung cho

nhóm nấm ký sinh thuộc chi nấm Cordyceps gây bệnh trên côn trùng Ngoài tên

gọi Đông trùng hạ thảo nó còn được biết với cái tên là Nhộng trùng thảo, Trùng thảo, Bắc đông trùng hạ thảo

Chi nấm Cordyceps được xác định có khoảng 400 loài khác nhau ở các vùng khác nhau trên toàn thế giới (Sung et al., 2007), trong đó ĐTHT Cordyceps militaris là một trong những loài phổ biến nhất ĐTHT có phạm vi phân bố trên toàn thế giới với độ cao từ 0 - trên 2000m so với mực nước biển (Shrestha and

Sung, 2005; Ma et al., 2007) và tập chung chủ yếu ở các vùng Đông Á thường là

các cao nguyên có độ cao 4000 - 5000 m so với mực nước biển như Thanh Hải,

Tứ Xuyên, Tây Tạng, Cam Túc, Vân Nam - Trung Quốc

Hệ thống phân loại nấm ĐTHT Cordyceps militaris (L.ex) Fr (1818)

Giới (Kingdom) : Fungi

1.1.2 Sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

1.1.2.1 Chu kỳ sinh trưởng phát triển nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên

Trong hệ thống phát sinh loài, ĐTHT Cordyceps militaris được xem là loài có đặc điểm tiến hóa nhất của chi Cordyceps trong họ Cordycipitaceae (Sung et al., 2007) Nó là một dạng kí sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng

thành của một số loài con trùng thuộc họ ngài đêm

Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris là một loài sinh sản vô tính, sau khi

hệ sợi phát triển thành thục có thể hình thành các bào tử (Basidiomyces) Vào mùa đông các bào tử nấm ĐTHT sẽ phát tán khắp nơi nhờ gió Nếu rơi xuống môi trường

cơ chất thích hợp, đặc biệt là ấu trùng chúng bắt đầu nảy mầm hình thành các sợi nấm sơ cấp Các sợi nấm sơ cấp một mặt không ngừng phát triển, một mặt tiếp tục xâm nhập sâu vào cơ thể côn trùng, sử dụng nguồn dinh dưỡng trong cơ thể côn trùng làm vật chất và năng lượng để sinh trưởng phát dục, cuối cùng nó phân giải toàn thể cơ thể côn trùng

Đến mùa hè, khi kết thúc giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng Cordyceps militaris chuyển sang giai đoạn sinh trưởng sinh thực hình thành quả thể nấm Quả thể nấm được mọc ra từ phần đầu, ngực, đuôi của ấu trùng

Hình 1.1 Chu kỳ sinh trưởng, phát triển nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên

1.1.2.2 Đặc trưng về hình thái nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

Nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên gồm có 2 phần chính: Phần ấu trùng

bị ký sinh và phần quả thể nấm

* Phần ấu trùng bị kí sinh:Ấu trùng kí sinh thường có hình ovan, thân có 09 vạch ngang, thân có màu tím sẫm, dài khoảng 15 - 20mm, dày từ 5 - 9 mm

* Phần quả thể nấm: Sau khi hệ sợi phát triển thành thục thì hình thành quả thể nấm nhô lên khỏi mặt đất Quả thể nấm có màu vàng cam hoặc cam hồng, dài khoảng tử 20 - 80mm; phần đầu có hình ovan dài từ 1-2 mm, dày từ 2 - 9 mm; phần thân dài từ 15 - 35 mm, dày từ 1 - 3 mm có màu vàng nhạt

Hình 1.2 Hình thái quả thể nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris 1.1.3 Giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

Đông trùng hạ thảo là một loại nấm dược liệu cổ truyền của Trung Quốc

có giá trị từ hàng ngàn năm nay Nó có tác dụng phòng chống và chữa trị thành công một số bệnh nan y như lipit máu, viêm phế quản mạn, hen phế quản, viêm thận mạn tính, suy thận, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mạn tính, ung thư phổi và thiểu năng sinh dục

Tạp chí STINFO (2015) đã trích dẫn những nhận định Bác sĩ Trần Văn Năm - Phó viện trưởng Viện Y dược học Thành Phố Hồ Chí Minh về tác dụng của nấm ĐTHT của như sau:

- Kháng viêm: Đông trùng hạ thảo có khả năng ngăn chặn các hoạt chất có khả năng gây viêm, gây sốt và gây sốc

- Kháng tế bào ung thư: Dịch chiết của nấm Đông trùng hạ thảo có tác

dụng chống tăng sinh của các loại tế bào ung thư như hạch, gan, đại tràng, tuyến tiền liệt và vú

- Chống mệt mỏi và stress: Dịch chiết của Đông trùng hạ thảo có tác dụng

chống mệt mỏi và stress trên chuột

- Tác dụng lên hệ hô hấp: Ức chế sự tăng sinh của tế bào dịch phế quản,

phế nang làm bít tắc lòng phế quản

- Chống sợi hóa gan: Đông trùng hạ thảo giảm đáng kể sợi lão hóa ở gan

trên mô hình chuột

- Chống sợi hóa phổi: Nhóm bệnh nhân SARS sử dụng sản phẩm Đông

trùng hạ thảo có dấu hiệu cải thiện tốt trên phổi so với nhóm không sử dụng

- Kích thích hệ miễn dịch: Các polysacharide từ dịch chiết Đông trùng hạ

thảo có khả năng điều hòa hệ thống miễn dịch

Hai thành phần dược liệu chính trong nấm ĐTHT là hợp chất adenosine (C10H13N5O4) và cordycepin (3′-deoxyadenosine, C10H13N5O3) - một chất tương

tự như nucleoside (Khan et al., 2010)

1.1.3.1 Hợp chất Cordycepin

Chất Cordycepin lần đầu tiên được tách ra từ Cordyceps militaris năm

1950 do Cunningham và cộng sự thực hiện, sau đó chúng cũng được tìm

thấy ở Cordyceps sinensis và Cordyceps kyushuensis Hàm lượng cordycepin có trong nấm Cordyceps ngoài tự vào khoảng 0,006 - 6,36 mg/g

(Phùng Mỹ Trung, vncreatures.net)

Theo Khan et al.(2010) hợp chất codycepin trong nấm ĐTHT có khả năng ức

chế sự phát triển của khối u, kéo dài thời gian sống cho những con chuột được cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư ở những con chuột Dịch chiết từ nấm ĐTHT ức chế sự phát triển của tế bào máu từ cuống rốn (human umbilical vein endothelial cells - HUVEC), dòng tế bào mô mềm Sarcoma gây ung thư ác tính HT1080 Dịch chiết của nấm này cũng giảm metalloproteinase 2(mmp2) biểu hiện gen trong tế bào HT1080 Mới đây người ta cũng đã phát hiện ra

một emzym phân giải protein từ các quả thể khô của Cordyceps militaris có khả

năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và ung thư bàng quang

Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại quá

trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư Trong một nghiên cứu Park

et al. (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng trưởng tế bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của tế bào hoặc làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự chết của tế bào) Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào

của nước chiết nấm Cordyceps militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594 (Thakur et al., 2011)

1.1.3.2 Hợp chất Adenosine

Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và được cho là phong phú ở

hầu hết các loài nấm Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 - 14,15 mg/g Adenosine được cho là có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch Hàm lượng chất adenosine trong quả thể nấm Cordyceps thu thập trong tự nhiên là 2,45±0,03mg/g và ở nấm Cordyceps militaris có hàm lượng adenosine cao hơn Cordyceps sinensis Hàm lượng adenosine ở Cordyceps sinensis là 1,643±0,03 mg/g, trong khi đó hàm lượng trong sợi nấm Cordyceps militaris lên men là 1,592±0,03 mg/g gần tương tự Cordyceps sinensis trong tự nhiên (Phùng Mỹ Trung, vncreatures.net)

Hình 1.3 Hợp chất Cordycepin, adenosine trong nấm Đông trùng hạ thảo

Tác giả Hur (2008) cũng công bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa

học của nấm ĐTHT Cordyceps militaris như sau:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển của nấm Đông trùng

hạ thảo Cordyceps militaris

1.1.4.1 Yếu tố giống

Bản chất của giống sẽ quyết định đến khả năng sinh trưởng phát triển của giống Một giống khỏe sẽ sinh trưởng hệ sợi thuận lợi trên các nguồn cơ chất khác nhau và khả năng hình thành và phát triển quả thể tốt Mỗi 1 giống lại được xác định 1 thời gian sử dụng nhất định Vượt qua thời gian này giá trị sử dụng của giống sẽ giảm, sức sinh trưởng của giống sẽ giảm, giống bị suy thoái Thoái hóa giống đang được xác định là một trong những vấn đề tồn tại lớn nhất trong nuôi trồng ĐTHT hiện nay Một số dấu hiệu của các giống ĐTHT bị thoái hóa gồm: Giảm tỷ lệ sinh trưởng, mật độ sợi thấp, thay đổi màu sắc quả thể, năng suất thấp, hình dạng và kích thước của quả thể bị biến dạng

Nghiên cứu của Sung et al (2006) cho thấy sự thoái hóa về màu sắc quả thể

của các chủng ĐTHT đã được quan sát rõ ràng sau khi cấy chuyển nhiều lần Các chủng ĐTHT thoái hóa có hoạt tính dehydrogenase bị giảm, quả thể thay đổi sắc tố nhưng không thay đổi kiểu gép cặp hoặc dsRNA Thêm vào đó, các chủng ĐTHT thoái hóa có thể hình thành quả đảm (synnemata) màu trắng trong khi nuôi trồng

(Wang et al., 2009)

Bản chất của thoái hóa ở các chủng ĐTHT nói riêng và nấm nói chung là do

đột biến DNA (Li et al., 2003) Càng nuôi trồng qua nhiều thế hệ tần số đột biến

DNA càng lớn dẫn đến các tình trạng giống bị thoái hóa và cho tới bây giờ những

gen liên quan đến thoái hóa ĐTHT vẫn chưa được xác định (Zheng et al., 2011)

Ngoài ra hiện tượng thoái hóa giống còn liên quan đến phương pháp phân lập Có 3 phương pháp phân lập được sử dụng rộng rãi là phân lập mô tế bào, phân lập đơn bào tử, phân lập bào tử phức Nếu các chủng được tạo ra từ bào tử phức (multi-spores) hoặc mô tế bào, thời gian bị thoái hóa nhanh hơn, có thể sau 1 đến 2

lần cấy chuyển (Shrestha et al., 2004) Để hạn chế quá trình thoái hóa giống nấm ĐTHT người ta sử dụng các chủng nuôi cấy phân lập từ đơn bào tử Một vài nghiên

cứu khác cũng chỉ ra rằng thời gian bảo quản giống quá dài cũng là một trong những

nguyên nhân gây nên suy thoái đặc tính sinh trưởng của giống Sung et al (2006)

chỉ ra thời gian có thể bảo quản các chủng ĐTHT Cordyceps militaris ở 4 - 10°C tối

đa là 6 tháng

Ngoài ra, vật liệu giống sử dụng khi nuôi trồng nấm ĐTHT cũng có ảnh hưởng mạnh tới sự sinh trưởng và phát triển của nấm trên cơ chất Có 2 loại giống được sử dụng là giống dạng rắn và giống dạng dịch thể Nuôi trồng nấm

ĐTHT Cordyceps militaris sử dụng giống nấm dạng dịch thể là công cụ mang lại hiệu quả cao nhất Shrestha et al (2006) cho biết giống nấm ĐTHT nuôi cấy trên

cơ chất rắn thường có xu hướng chuyển sang màu vàng, giống trong môi trường lỏng không có sự thay đổi về màu sắc

Chất lượng giống dịch thể sử dụng cũng có ảnh hưởng tới năng suất nấm ĐTHT Các tác giả cũng khẳng định sản phẩm của giống dịch thể bao gồm pellets (khuẩn lạc cầu), bào tử đính (conidial), sợi nấm (hyphal) Trong đó pellets được xem

là không phù hợp cho cấy giống với 03 lí do: (1) Lí do đầu tiên và quan trọng là pellets (khuẩn lạc cầu) không sinh trưởng nhanh như bào tử đính (conidial) hoặc dung dịch huyền phù sợi (hyphal suspensions) trên cơ chất nuôi trồng (2) Thứ hai, pellets (khuẩn lạc cầu) thường không cảm ứng hình thành được mầm quả thể (3) Thứ ba, pellets (khuẩn lạc cầu) khó để định lượng thể tích giống cấy

1.1.4.2 Yếu tố dinh dưỡng

a Nguồn dinh dưỡng cacbon

Nấm yêu cầu một lượng lớn cacbon trong quá trình sinh trưởng và phát dục Dinh dưỡng cacbon cung cấp vật chất cho các quá trình sinh tổng hợp các chất cung cấp năng lượng cho các hoạt động của tế bào Hàm lượng cacbon chiếm khoảng 50% trọng lượng khô của quả thể nấm Nguồn cacbon thích hợp cho sợi nấm phát triển gồm các monosacharide và polysacharide….Nấm có sự phân biệt khác nhau rất lớn trong khả năng sử dụng các nguồn cacbon (Trịnh Tam Kiệt, 2012)

Những nghiên cứu đã công bố cho thấy những nguồn cacbon có thể sử dụng để nuôi trồng nấm ĐTHT là các loại đường, tinh bột… trong đó thích hợp

nhất là những loại có cấu trúc phân tử nhỏ (Shrestha et al., 2012)

b Nguồn dinh dưỡng nito

Nito là nguyên tố bắt buộc để tổng hợp acid nucleic và protein cấu trúc

nên tế bào Dinh dưỡng nito có thể được lấy từ nguồn nito hữu cơ tự nhiên, nguồn nito tổng hợp, nguồn nitơ vô cơ là các muối nitrat hay muối amoni

Gao et al (2000) cho biết nấm Cordyceps militaris yêu cầu hàm lượng nito

tương đối thấp Nếu hàm lượng nitơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể Trong giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng, tỷ lệ C/N vào khoảng 4/1 - 6/1 là thích hợp, giai đoạn sinh trưởng sinh thực tỷ lệ thích hợp từ 10/1 - 15/1 Điều đó lý giải vì sao sản lượng ĐTHT trên côn trùng thấp hơn trên ngũ cốc

c Nguồn dinh dưỡng khoáng

Một số muối khoáng như K+, Mg2+ và Ca2+ ở nồng độ 0,1 g/l có thể làm tăng năng suất quả thể Một vài nguyên tố có thể làm tăng hoạt chất sinh học của

Cordyceps militaris (Dong et al., 2012)

d Vitamin

Vitamin có vai trò trong chu kỳ phát dục của Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Tuy nhiên ĐTHT không có khả năng tổng hợp vitamin cần thiết, vì vậy trong nuôi trồng người ta thường bổ sung thêm một hàm lượng vitamin nhất định

e Hormon

Hormones tác động tới hình thái di truyền và sự phát triển trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật Hormon được xác định là nhân tố môi trường làm thay đổi giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng đến giai đoạn sinh sản của nấm Một số hormones thực vật như 2, 4-D, citric acid triamine, colchicines và các hormones khác có thể

làm tăng kích thích quá trình hình thành quả thể của ĐTHT (Wang et al., 2010;

Nhiệt độ là điều kiện quan trọng để nấm ĐTHT sinh trưởng và phát dục

Nấm ĐTHT thích hợp với các vùng có nhiệt độ trung bình Nhiệt độ thích hợp

cho sinh trưởng hệ sợi và sinh tổng hợp cordycepin là 18 - 20oC và ở nhiệt độ trên 30oC cả tăng trưởng của hệ sợi nấm và sản xuất cordycepin đều ngừng lại

(Hung et al., 2009)

b Độ ẩm và sự trao đổi không khí

Độ ẩm cao 70 - 90% phù hợp cho hình thành quả thể nấm ĐTHT Độ ẩm thấp là nguyên nhân dẫn đến môi trường nuôi cấy khô nhanh Sự trao đổi khí cao trong môi trường nuôi cấy phù hợp cho sự sinh trưởng sợi, hình thành mầm quả

thể và năng suất sinh khối (Zhang et al., 2010)

c Ánh sáng

Theo Trịnh Tam Kiệt (2012) ánh sáng có ảnh hưởng tới sinh trưởng

phát triển của hầu hết các loại nấm Đối với nấm Cordyceps militaris, ánh

sáng có những ảnh hưởng đặc biệt quyết định đến chu kỳ sinh trưởng, khả năng hình thành và phát triển quả thể nấm Ánh sáng ảnh hưởng tới chu kỳ phát triển của nấm ĐTHT thảo ở các mặt: Thời gian chiếu sáng, cường độ chiếu sáng và loại ánh sáng

Nghiên cứu của Chen et al (2011) cho thấy ánh sáng thích hợp nhất cho

sự phát triển của quả thể nấm ĐTHT là 12 giờ chiếu sáng/12 giờ tối với cường độ chiếu sáng 600 ± 20 lux Thời gian chiếu sáng dài không có lợi cho sự phát triển

của Cordyceps militaris và giảm hàm lượng cordycepin

1.2 Cơ sở khoa học của công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể

Theo Liu et al (2010) giống dạng dịch thể là giống được nuôi trong môi

trường lỏng, ở đó nấm được đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh để có thể sinh trưởng phát triển mạnh cho sinh khối lớn nhất

1.2.1 Nhân tố vật lý

1.2.2.1 Nhiệt độ

Một trong những nhân tố vật lý ảnh hưởng lớn đến sinh khối và sản phẩm đích tạo ra là nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng tới tốc độ phản ứng và độ hòa tan oxy của cơ chất trong quá trình lên men Nhiệt độ liên quan chặt chẽ tới sự

ichuyển hóa của hệ sợi và chất sinh ra trong quá trình chuyển hóa Các giống nấm khác nhau hoặc cùng loài sẽ phát triển ở các ngưỡng nhiệt độ nhất định Tác

giả Lin et al.(2006) cho biết quá trình tổng hợp sinh khối gần như tối ưu ở dãy

nhiệt độ từ 25 - 28oC và giảm nhanh ở ngoài khoảng nhiệt độ này, khả năng sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào là tối ưu ở dãy nhiệt độ 23 - 28°C đối với

nấm Antrodia cinnamomea Khả năng sinh tổng hợp polysaccharide và tỷ lệ sinh trưởng của sợi Ganoderma lucidum là từ 30°C - 35°C (Yang and Liau, 1999) 1.2.2.2 Cường độ lắc và tốc độ sục khí

Cường độ lắc và tốc độ sục khí là những nhân tố quan trọng trong sản xuất sinh khối nấm và các hoạt chất sinh học Quá trình lắc giúp hòa tan oxi vào dịch lên men giúp thúc đẩy quá trình chuyển hóa cơ chất, kích thích sự phát triển của

hệ sợi nấm Tốc độ sục khí ảnh hưởng tới đặc điểm hình thái của các khuẩn lạc

cầu (Lee et al., 2004)

1.2.2 Nhân tố hóa học

1.2.2.1 pH môi trường

Một trong những nhân tố chính xác định tiềm năng sinh tổng hợp là pH của môi trường pH có thể ảnh hưởng đến chức năng của tế bào, sự hấp phụ các chất dinh dưỡng, hình thái và cấu trúc tế bào, độ tan của muối và trạng thái ion của cơ chất, hoạt động của enzyme và sinh tổng hợp

Theo Hui and Yang (2006), pH môi trường ban đầu tối ưu để nuôi sợi nấm phụ thuộc vào loại môi trường nuôi cấy và loài nấm Đa số các giống nấm sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện pH từ 5 - 7

1.2.2.2 Nguồn đường

Nguồn carbon là một thành phần chủ yếu trong môi trường dinh dưỡng, đảm bảo sự sinh trưởng của vi sinh vật cũng như khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học của sinh vật trong môi trường dịch thể Nguồn cacbon thường được sử dụng trong nhân giống dịch thể là các loại đường và glucose là nguồn carbon tốt nhất để tổng hợp các polysaccharide ngoại bào, polysaccharide nội bào (Pokhrel and Ohga, 2007)

1.2.2.2 Nguồn nito

Nito là nhân tố cần thiết trong sinh tổng hợp enzyme nấm trong cả quá trình chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp Các nguồn nito thường được sử dụng trong quá trình nhân giống dạng dịch thể là ammonium, ion Na+ hoặc dạng hữu cơ như amoni acid, protein

1.2.3 Tính ưu việt của công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể

1.2.3.1 Ưu điểm của sản xuất giống sử dụng công nghệ nhân giống dạng dịch thể Kawai et al (1995) sử dụng giống dịch thể để nghiên cứu thời gian hình thành quả thể nấm Hương (Lentinus edodes) Kết quả nghiên cứu cho thấy sử

dụng giống dịch thể cho phép rút ngắn được thời gian ươm sợi và thời gian hình

thành quả thể nấm từ 120 ngày xuống còn 90 ngày Kwon et al (2009) cũng

khẳng định trong môi trường lỏng, sợi nấm sinh trưởng mạnh, nhanh chóng cho sinh khối sợi với chất lượng phù hợp

Liu et al (2010) khẳng định phương pháp nhân giống dạng dịch thể khác

với phương pháp nuôi cấy giống truyền thống Nuôi cấy trên môi trường rắn, sử dụng các nguyên liệu có chứa nhiều lignocellulose, quá trình thường mất từ 2 - 3 tháng mới cho quả thể nấm Nuôi cấy trên môi trường lỏng cho tiềm năng năng suất cao hơn trong một thời gian ngắn hơn và tỷ lệ nhiễm bệnh thấp hơn

ThS Cồ Thị Thùy Vân (2014) trong báo cáo tổng kết kết quả nghiên cứu quy trình nhân giống nấm ăn và nấm dược liệu dạng dịch thể cũng khẳng định giống dịch thể so với giống trên cơ chất rắn (mùn cưa, bông hạt, lõi ngô, đại mạch, kê, thóc…) có chu kỳ phát triển nhanh hơn, tuổi giống đồng đều, thao tác

cấy giống vào nguyên liệu nuôi trồng đơn giản, khi cấy giống vào giá thể nuôi trồng sợi nấm khôi phục nhanh, khả năng hấp thụ dinh dưỡng và tốc độ lan sợi mạnh Trong điều kiện thuận lợi thì nuôi sợi trong môi trường lỏng khoảng 7 ngày là có thể sử dụng được, khi cấy sang nguyên liệu nuôi trồng có thể rút ngắn được 1/2 đến 2/3 thời gian ươm sợi, giá thành chủng giống thấp Hơn nữa sản xuất nấm sử dụng công nghệ nhân giống dịch thể tạo điều kiện cho việc mở rộng quy mô sản xuất do hệ số nhân giống lớn, trang thiết bị sẩn xuất đồng bộ với quy

mô 100, 200 hoặc 500 lít

1.2.3.2 Một số hạn chế của sản xuất giống dạng dịch thể

- Sản xuất giống dịch thể không áp dụng được một cách đại trà cho tất cả loại nấm và ở mọi cơ sở nuôi trồng nấm Bởi:

+Sản xuất giống dịch thể yêu cầu đầu tư cơ sở vậ chất, trang thiết bị hiện đại và đồng bộ

+ Giống dịch thể phải được sản xuất và sử dụng trong một hệ thống khép kín từ khâu sản xuất giống tới khâu nuôi trồng mới

+ Công tác bảo quản, vận chuyển giống dịch thể khó khăn do giống trong môi trường dịch

+Yêu cầu nguồn nhân lực có trình độ quản lý và trình độ kỹ thuật cao do phải vận hành dây chuyền sản xuất lớn

1.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo trên Thế giới

1.3.1.1 Tình hình nghiên cứu về nhân giống, nuôi trồng nấm nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

a Tình hình nghiên cứu về nhân giống nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên môi trường cơ bản

Môi trường cơ bản là môi trường thạch được sử dụng để nhân giống gốc

hoặc giống cấp 1 (mother spawn) Những nghiên cứu về nhân giống Cordyceps militaris trên môi trường cơ bản là các nghiên cứu về dinh dưỡng, các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát triển của hệ sợi nấm

Shrestha et al (2006) nghiên cứu sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên rất nhiều loại môi trường khác nhau (môi trường nghèo dinh dưỡng, môi trường trung bình và môi trường giàu dinh dưỡng) ở chế độ ánh sáng và thời gian nuôi giống khác nhau Ánh sáng được xác định là yếu tố quan

trọng nhất trong việc xác định mật độ, cấu trúc và sắc tố hệ sợi nấm Cordyceps militaris, hệ sợi nấm không có sắc tố và phát triển tốt hơn trong điều kiện tối

Môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris là SDAY, SMAY và CZYA

Nghiên cứu của Pathania et al (2015) về đặc điểm hình thái và cấu trúc phân tử của loài nấm Cordyceps militaris được thu thập từ vùng núi Himalayas -

Ấn Độ cho thấy giống nấm này sinh trưởng thuận lợi trên môi trường YPDA (cao nấm men, khoai tây, đường dextrose, aga), hệ sợi sinh trưởng nhanh nhất ở nhiệt

độ 25oC, pH từ 5,5 đến 7,5 và trong điều kiện tối hoàn toàn

b Tình hình nghiên cứu về nhân giống nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris dạng dịch thể

Nhằm mục đích nâng cao hiệu quả nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris các nhà khoa học đã sử dụng nguồn giống Cordyceps militaris dạng dịch thể để phục vụ nuôi trồng Nuôi trống nấm Cordyceps militaris sử dụng

giống dịch thể có thể tăng sản lượng nấm, tăng sinh tổng hợp các chất trong thời gian ngắn với mục đích giảm tỷ lệ nhiễm

* Nghiên cứu về thành phần môi trường nhân giống:

Có rất nhiều công trình nghiên cứu về công nghệ nhân giống nấm ĐTHT dạng dịch thể với mục đích tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, đặc biệt là tối ưu hóa môi trường nuôi dưỡng Cacbon và nito được xác định là 2 nguồn dinh dưỡng

chủ yếu trong nhân giống dịch thể ĐTHT Cordyceps militaris

(1) Nguồn dinh dưỡng cacbon

Để xác định nguồn dinh dưỡng cacbon thích hợp cho sinh trưởng của nấm

ĐTHT Park et al (2001) đã thí nghiệm nuôi cấy giống ĐTHT trên 08 loại

đường khác nhau (sucrose, glucose, fructose, maltose, glactose, xylose, starch, inulin) Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình sinh tổng hợp các hợp chất

polysacharide ngoại bào của nấm ĐTHT diễn ra mạnh nhất trên môi trường có

bổ sung đường sucrose (0,95 g/l), glucose là 0,8 g/l, thấp nhất ở Inulin 0,17 g/l

Park et al (2001) còn so sánh về tốc độ tăng trưởng hệ sợi nấm và khả năng sinh tổng hợp các hợp chất ngoại bào của nấm Cordyceps militaris trên các

nguồn cacbon vô cơ (sucrose) và nguồn cacbon hữu cơ (cám ngô) với nhau Sinh khối sợi và hàm lượng các hợp chất ngoại bào đạt cao nhất khi nồng độ đường sucrose trong dung dịch đạt 40g/l, trong khi chỉ cần sử dụng 10 g/l cám ngô sinh khối sợi nấm và quá trình sinh tổng hợp các chất đạt chỉ số lớn nhất và cao hơn

so với nguồn sucrose

Cùng với đó, Mao et al (2005) cũng tiến hành nuôi cấy Cordyceps militaris

trong môi trường dịch thể có bổ sung các nguồn đường khác nhau (lactose, sucrose, glucose, fructose, galactose, maltose và xylose) Các chỉ tiêu như mật độ

tế bào, sự hấp thụ đường và khả năng tổng hợp cordycepin đã được tác giả và nhóm nghiên cứu theo dõi Số liệu ghi chép cho biết mật độ tế bào đạt cực đại, trọng lượng tế bào và tốc độ tăng trưởng đạt giá trị cực đại trong công thức có bổ sung galactose sau 9 ngày nuôi cấy (trọng lượng tế bào khô: 19,27 g/l) Trong môi trường có lactose sinh khối sợi nấm thấp (8,0g/l) và khi kết thúc quá trình sinh trưởng trong môi trường nhân giống vẫn còn dư đường Về khả năng tổng hợp cordycepin, glucose cho hiệu quả tổng hợp cao nhất 262,7g/ml Từ những kết quả đó tác giả đã chọn glucose là nguồn cung cấp cacbon chính cho nhân

giống Cordyceps militaris dịch thể

Mao et al (2005) tiếp tục nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của nồng độ

glucose ban đầu tới sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Thí nghiệm được tiến hành với 03 công thức với 3 nồng độ glucose khác nhau (30 g/l, 40 g/l và 50 g/l) Kết quả thu được rằng sự phát triển của tế bào tăng khi nồng độ glucose tăng, tuy nhiên thì hàm lượng cordycepin lại giảm khi nồng độ đường vượt quá 40 g/l

(2) Nguồn dinh dưỡng nitơ

Tương tự như cacbon, để xác định nguồn dinh dưỡng nito thích hợp cho

nhân giống dịch thể Cordyceps militaris các nhà nghiên cứu cũng tiến hành các

thí nghiệm nuôi cấy Cordyceps militaris trên các môi trường có bổ sung nguồn

Masuda et al (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng tới khả năng tổng hợp Cordycepine của nấm ĐTHT Cordyceps militaris Kết quả cho thấy nguồn dinh dưỡng nito thích hợp cho nấm Cordyceps militaris là hỗn hợp

peptone và cao nấm men và tỷ lệ tối thích nhất là 75% cao nấm men

(3) Tỷ lệ cacbon /nito (C/N)

Ngoài việc cung cấp đủ hàm lượng cacbon hay nito thì việc xác định tỷ lệ

C/N trong nhân giống dịch thể nấm Cordyceps militaris là yếu tố khá quan trọng

Tỷ lệ C/N tối ưu cho phát triển hệ sợi và tổng hợp exopolysacharide của

Cordyceps militaris là 2/1 khi sử dụng glucose làm nguồn cung cấp carbon

(Masuda et al., 2006) hoặc 42g glucose/l với 15,8 g peptone/l (Mao et al., 2004)

(4) Chất khoáng và vitamin

Nguyên tố khoáng cũng đóng vao trò thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của sợi nấm dịch thể Ion kim loại đóng vai trò là coenzyme thiết yếu cho phản ứng xúc tác của enzyme, đặc biệt là enzyme sử dụng ATP và tổng hợp DNA và RNA Nhóm hỗn hợp chứa KH2PO4 0,5 g/L và MgSO4.7H2O 0,5g/l, được xác định là hỗn

hợp tối ưu cho sợi nấm sinh trưởng (Park et al., 2001)

Dong and Yao (2005) tiến hành 2 thí nghiệm so sánh sự sinh trưởng của hệ

sợi nấm Cordyceps trên các công thức môi trường có bổ sung các nguyên tố trung

lượng như canxi, kali, magie và natri với công thức đối chứng không bổ sung khoáng và so sánh các công thức môi trường có bổ sung các nguyên tố kim loại đánh dấu (Fe, Cu) Kết quả thí nghiệm cho thấy canxi có một số ảnh hưởng nhất

định đến hệ sợi nấm Cordyceps trong môi trường dịch thể Kẽm là nguyên tố không

thể thiếu cho sự sinh trưởng của nấm Cordyceps do Kẽm có mặt trong thành phần

cấu trúc của một số enzym tham gia vào quá trình tổng hợp DNA và RNA Sợi nấm

Cordyceps có thể phát triển tốt trên môi trường không có sắt và đồng

Nghiên cứu của Dong and Yao (2005) về ảnh hưởng của vitamin tới hệ sợi

nấm Cordyceps trong môi trường dịch thể nói vitamin có vai trò tăng tốc độ của các

phản ứng sinh hóa và biotin được xác định là phù hợp nhất với tăng trưởng sợi nấm

và tăng cường tổng hợp acid citric

* Nghiên cứu về chế độ nuôi giống

Hung et al (2009) cho biết sự phát triển của sợi nấm Cordyceps militaris

cao nhất ở 20oC và thấp nhất ở 30oC Ở nhiệt độ cao (lớn hơn 30oC sợ nấm chìm trong dịch dinh dưỡng không có khả năng phát triển lên bề mặt) Đồng thời các

chủng Cordyceps militaris có khả năng tổng hợp chất cordycepin cao nhất ở

nhiệt độ 25oC Giá trị pH tối ưu là hơi acid từ 6 đến 8 (Shrestha et al., 2012)

Cường độ lắc cũng là một thông số quan trọng, ảnh hưởng đến cơ chất, nhiệt

độ và hàm lượng oxi không hòa tan (OD), nó có thể làm thay đổi hình thái sợi nấm Sinh khối sợi nấm ĐTHT sẽ thu được nhiều nhất (40,6g/l) ở cường độ 200

vòng/phút (Kwon et al., 2009) Theo thời gian nuôi cấy càng tăng thì khuẩn lạc cầu

sẽ tăng về kích thước (Han et al., 2009)

Park et al (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống

cấy đến sinh khối sợi và khả năng đồng hóa các chất của nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps militaris Kết quả nghiên cứu cho thấy, tuổi giống và tỷ lệ giống cấy dường như không hoặc ít có hảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp các polysacharide ngoại bào và sinh khối sợi nấm ĐTHT

Xiao et al 2004 cũng công bố kết quả nghiên cứu về sự ảnh hưởng của tỷ

lệ giống cấy tới sự sinh trưởng hệ sợi nấm ĐTHT trong môi trường dịch thể rằng

tỷ lệ giống cấy từ 2,5% - 7,5% là thích hợp cho nhân giống, tỷ lệ 10% sinh khối sợi nấm sẽ giảm

c Tình hình nghiên cứu về nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Với những đặc tính sinh học và chu khì sống, Cordyceps militaris có rất ít

trong tự nhiên do kí chủ tương đối hiếm, quá trình sinh trưởng diễn ra chậm, sự

sinh trưởng bị giới hạn ở một vùng nhất định, kích thước quả thể nhỏ Chính vì

vậy, để tìm kiếm và sử dụng Cordyceps militaris làm dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng là một vấn đề không khả thi (Hong et al., 2010) Kết quả của những nghiên cứu gần đây cho thấy mật độ của Cordyceps militaris trong tự nhiên ngày

càng giảm Chính vì vậy, nghiên cứu về khả năng hình thành và sinh trưởng của

quả thể Cordyceps militaris trên môi trường nhân tạo là một vấn đề cần thiết để

phục vụ cho nhu cầu của con người

* Nghiên cứu về thành phần cơ chất nuôi trồng

Đã có rất nhiều nghiên cứu về thành phần cơ chất nuôi trồng nấm ĐTHT Cordyceps militaris được thực hiện ở phòng thí nghiệm Những nghiên cứu ban đầu được thực hiện với mục đích đánh giá ảnh hưởng của giai đoạn ấu trùng và giai đoạn

nhộng trong chu kỳ sống của tằm Bombyx mori đến hình thành quả thể của nấm Cordyceps militaris (Hong et al., 2010) Kết quả đã xác định được 3 giống tằm được xem là phù hợp nhất cho sự hình thành quả thể của Cordyceps militaris đó là: Daeseungjam, Baegokjam và Keumokjam Giống Daeseungjam và nhộng có tuổi từ

9 đến 11 ngày tuổi, có tỷ lệ nấm xâm nhiễm 100%, trong khi nhộng có tuổi từ 7 đến

8 ngày tuổi, tỷ lệ xâm nhiễm chỉ đạt 80 % và 76,7%, tương ứng

Trước thực tế nhu cầu sử dụng nấm ĐTHT tăng cao, cộng với việc nuôi trồng nấm ĐTHT trên con nhộng không mang lại hiệu quả do tỷ lệ nhiễm cao và năng suất thấp thì chất hữu cơ được các nhà nghiên cứu đã nghĩ tới như một giải

pháp thay thế hữu hiệu trong nuôi trồng Cordyceps militaris Theo Shrestha et al

(2012) hạt ngũ cốc là một chất hữu cơ khác được chứng minh là thay thế tốt nhất cho côn trùng và gạo được sử dụng như một thành phần chủ yếu cung cấp dinh

dưỡng cho sự sinh trưởng phát dục hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris Wen et al (2008) đã nghiên cứu nuôi trồng nấm Cordyceps militaris trên

các loại gạo khác nhau và cho thấy năng suất nuôi quả thể lớn nhất thu được khi

sử dụng gạo nâu không trơn bóng Bên cạnh đó một số chất hữu cơ khác cũng có

thể được sử dụng để nuôi trồng Cordyceps militaris bao gồm: bột đậu tương, hạt

ngô, vỏ bông, lúa mì, hoa hướng dương (Wei and Huang, 2009)

Để bổ sung thêm dinh dưỡng nito cho Cordyceps militaris, các nhà nghiên

cứu đã sử dụng hỗ hợp gạo trộn với bột nhộng tằm và chúng được chứng minh là

cơ chất tốt nhất cho nuôi trồng nấm Cordyceps militaris (Shrestha et al., 2004)

Môi trường chứa aga cũng được xác định là không phù hợp với sự hình thành

quả thể nấm Cordyceps militaris (Yahagi et al., 2004)

* Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh

Du et al (2010) nghiên cứu về nhiệt độ tối ưu cho sự hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris Khoảng nhiệt độ tối ưu nhất được xác định là 18 - 22oC Ngưỡng nhiệt độ thấp hơn 14 - 17oC vẫn có khả năng hình thành hình thành quả thể nấm nhưng thời gian nuôi trồng kéo dài hơn Sato and Shimazu (2002) cũng

cho rằng giai đoạn sinh trưởng của quả thể Cordyceps militaris nuôi trồng ở nhiệt

độ 25oC ngắn hơn quả thể nuôi trồng ở 20oC

Ánh sáng là được xác định là nhân tố quan trọng bậc nhất trong nuôi trồng

Cordyceps militaris (Shrestha et al., 2012) Ánh sáng thúc đẩy mạnh quá trình hình thành mầm và phát triển quả thể Theo Kim et al (2010) dưới điều kiện ánh

sáng trắng, quá trình hình thành quả thể diễn ra mạnh mẽ

Hong et al.(2010) báo cáo về sự ảnh hưởng của cường độ ánh sáng tới hình

thành và phát triển mầm quả thể nấm ĐTHT như sau: Tại cường độ ánh sáng 100 lux mầm quả thể hình thành ở tất cả các công thức thí nghiệm, trung bình 6,1 mầm/cá thể nhộng, chiều dài quả thể ngắn (37,7mm), đường kính quả thể nhỏ (2,51mm) Trong điều kiện ánh sáng 500 lux, quá thể được hình thành dài hơn và dày hơn, chiều dài từ 69,5 ± 3,95 mm, đường kính quả thể 3,10 ± 0,63 mm Cường

độ ánh sáng 1000 lux, mức độ biến động về số lượng mầm quả thể cao hơn (từ 1 -

10 mầm/nhộng), quả thể dài hơn nhưng đường kính quả thể nấm giảm Phần lớn những nghiên cứu thu được khoảng cường độ ánh sáng tối thích để hình thành thể

nền là 500 -1000 lux (Du et al., 2010)

Thời gian chiếu sáng cũng là một yếu tố được các nhà khoa học quan tâm

nghiên cứu đến Theo Mu et al (2010) ở cường độ ánh sáng 200 lux, thời gian

chiếu sáng 18h phù hợp cho hình thành mầm và sắc tố, 10h phù hợp cho sự sinh trưởng của quả thể và cho năng suất cao nhất hay chiếu sáng 12h sáng/tối 500 -

1,000 lux (Chen et al., 2011) Hong et al 2010, trong điều kiện chiếu sáng liên

tục (không tối) quá trình cảm ứng và phát triển quả thể vẫn diễn ra và trong điều kiện tối liên tục không diễn ra quá trình hình thành quả thể

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu công nghệ nhân giống dịch thể trên Thế giới

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp đã và đang là vấn đề được thế giới quan tâm nhiều Công nghệ lên men đã được ứng dụng trong việc tạo ra các sản phẩm trao đổi chất với quy mô lớn, đặc biệt là trong công nghệ nhân giống nấm ăn - nấm dược liệu với mục đích rút ngắn thời gian,

diện tích và chi phí trong sản xuất (Diamantopoulou et al., 2012)

Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản là những nước đi đầu trong việc ứng dụng công nghệ nhân giống dịch thể trong sản xuất nấm Việc nuôi trồng nấm ăn

và nấm dược liệu sử dụng giống dịch thể đã đạt được thành công với nhiều giống nấm khác nhau Các kết quả nghiên cứu cho thấy đại đa số hệ sợi của các loài

nấm đều phát triển tốt trong môi trường dịch thể thích hợp (Hasan et al., 2012) Yan et al (2003) nuôi cấy nấm Kim Châm (Flammunila velutipes) trong

các môi trường dịch thể khác nhau Kết quả thu được nấm Kim Châm sinh trưởng tốt trên môi trường bao gồm: Bột ngô 5% + đường maltose 1% + Cao nấm men 0,5% + đường gluose 2% + KH2PO4 0,1% + MgSO4 0,05% + CaCO3 0,2% + vitamin B1 1mg, nuôi ở điều kiện nhiệt độ 25oC, chế độ lắc 180 vòng/phút, thơi

gian nuôi cấy là 6 - 7 ngày Tác giả Liu et al (2010) cũng nghiên cứu tối ưu hóa

được môi trường dịch thể tối ưu cho giống nấm Kim châm LP03 với peptone, bột ngô, MgSO4 .7H2O, KH2PO4 và B1, nhiệt độ 25±3oC, chế độ lắc 160 vòng/phút cho kích thước khuẩn lạc cầu đồng đều, sinh khối sợi lớn

Fan et al (2007) tối ưu hóa các điều kiện dinh dưỡng, hóa học để sản xuất nấm Mỡ Agaricus brasiliensis trong môi trường dịch thể Các nghiên cứu bổ

sung nguồn dinh dưỡng cacbon, nito khác nhau vào môi trường nuôi cấy đã được tiến hành Tác giả chứng minh sucrose, cao nấm men là hai nguồn dinh dưỡng phù hợp nhất cho sự tổng hợp các hợp chất polysacharide ngoại bào của nấm Tác giả đưa ra công thức môi trường tối ưu nhất gồm 10g sucrose + 3 g cao nấm men + 0,6 g K2HPO4 0,3 g MgSO4, pH môi trường = 6 và nuôi ở nhiệt độ 30oC

Mikiashvili et al (2006) nghiên cứu ảnh hưởng của 8 nguồn nito đến hoạt động của enzym trong nấm sò Pleurotus ostreatus Nguồn nito hữu cơ (pepton) cho

hiệu quả hoạt động của các enzym cao nhất, sinh khối sợi thu được 9,7 g/l

Nồng độ đường và đạm trong môi trường cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm cũng như tổng hợp hoạt chất sinh học Sự ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường đã được kiểm tra Nhìn chung, khi hàm lượng glucose cao giúp làm tăng sinh khối và polysaccharide ngoại bào Tuy nhiên, tăng nồng độ glucose từ 10 g/l đến 20 g/l giúp làm tăng mức sản sinh sinh khối từ 1,2 đến 1,7 lần và 1,6 đến 3 lần với các polysaccharide ngoại bào Tăng hàm lượng glucose 40g/l không làm tăng các sản phẩm mong muốn tạo thành

Theo Zhong et al (2004) sự sinh trưởng của tế bào bị ức chế bởi áp suất

thẩm thấu cao trong môi trường Cùng một thời gian, sản lượng polysaccharide ngoại bào và nội bào tăng khi nồng độ glucose hoặc lactose ban đầu tăng Mức độ

tăng polysaccharide nội bào và ngoại bào cao nhất của nấm Linh chi Ganoderma lucidum khi nồng độ glucose trong môi trường là 50g/l và nồng độ lactose là 65g/l Nồng độ đường ban đầu có ảnh hưởng đến kích thước của pellets Đường kính pellets nhỏ hơn 1,2 mm khi nồng độ glucose ban đầu trong khi đường kính pellets lớn hơn 1,6 mm thu được khi nồng độ glucose ban đầu là 20g/l

Lin et al (2011) về ảnh hưởng của vitamin đến sinh khối vàpolysaccharide ngoại bào khi nuôi cấy nấm Múa Grifola frondosa cho thấy riboflavin là nguồn

vitamin tốt nhất cho sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào (1,39g/l), tiếp theo là biotin (1,19g/l), acid nicotinic (0,94 g/l) Trong 5 nguồn vitamin, thì thiamine và riboflavin giúp tăng sinh khối sợi; các nguồn acid nicotic, acid ascorbic, và biotin

ít ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của sợi hơn so với các nguồn vitamin khác

Một trong những nhân tố vật lý ảnh hưởng lớn đến sinh khối và sản phẩm đích tạo ra là nhiệt độ Tuy nhiên, ảnh hưởng của nhiệt độ chưa được nghiên cứu

một cách có hệ hống Nghiên cứu của Cho et al (2006) về đặc điểm sinh trưởng trong môi trường dịch thể của nấm Ngân Nhĩ (Tremella fuccifomis) cho biết sợi

nấm Ngân nhĩ sinh trưởng thuận lợi nhất ở nhiệt độ 28oC (sinh khối sợi nấm thu được là 4,5g/l môi trường) Ở nhiệt độ cao hơn 34oC, sợi nấm sinh trưởng chậm hơn, sinh khối sợi nấm giảm hẳn (sinh khối sợi nấm 1,8 g/l) Quá trình tổng hợp các exopolysacharide cũng thích hợp với khoảng nhiệt độ từ 25 - 30oC Nhiệt độ cao hơn quá trình sinh tổng hợp giảm dần

Các nghiên cứu về ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm trong nuôi cấy lỏng cho rằng pH tối ưu phụ thuộc vào từng chủng giống

Đa số các giống nấm sinh trưởng tốt trong môi trường pH từ 5 - 7 Fang and

Zhong (2002) đã nuôi cấy nấm Linh chi Ganoderma lucidumin trong môi trường

35 g/l glucose +5 g/l peptone + 5 g/l yeast extract và các dãy pH khác nhau từ 3,5 đến 7,0 Sinh khối cao nhất thu được khi môi trường có pH khởi đầu là 6,5, hàm lượng acid ganoderic là 5,5 - 6,5 g/l, polysaccharide nội bào là 5,5 - 7,0 g/l và polysaccharide ngoại bào là 3,5 - 4,5 g/l

Cường độ lắc và tốc độ sục khí là những nhân tố quan trọng trong nhân

giống nấm dược liệu dạng dịch thể Nó có vai trò cung cấp oxy thúc đẩy quá trình trao đổi và chuyển hóa cơ chất Yang and Liau (1999) đã kiểm tra cường

độ lắc từ 50 đến 250 vòng/phút, kết quả thu được mật độ sinh khối cao nhất ở cường độ100 vòng/phút, nhưng sản lượng polysaccharide ngoại bào cao nhất ở cường độ 150 vòng/phút Kết quả cho thấy với khả năng làm hạn chế quá trình bám của polysaccharides ngoại bào trên thành tế bào, cường độ lắc cao hơn thích hợp cho sự hình thành polysaccharide ngoại

Lee et al (2004) nghiên cứu sự hình thái khuẩn lạc cầu ở các điều kiện lắc

giống khác nhau Nuôi giống trong điều kiện sục khí là 0,5 V/V/M, cường độ lắc

100 vòng/phút thì khuẩn lạc cầu không có tua ngắn Nuôi trong điều kiện sục khí 0,5 V/V/M, cường độ lắc 250 vòng/phút khuẩn lạc cầu có viên tròn hơn, không

có tua gai Nuôi trong điều kiện sục khí là 1,16 V/V/M, cường độ lắc 166 vòng/phút khuẩn lạc cầu có tua dài

Sự sinh trưởng của hệ sợi trong môi trường dịch lỏng còn chịu ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy Tỷ lệ giống cấy liên quan tới độ nhớt của môi trường trong quá trình lên men Tỷ lệ càng cao gây ra sự khó khăn cho việc lưu thông dòng

chảy, hạn chế sự hấp thụ dinh dưỡng và trao đổi oxy (Hwang et al., 2004)

1.3.1.3 Tình hình sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris trên Thế giới

Không chỉ là món ăn ngon bổ dưỡng, nấm còn là bài thuốc tăng cường sức

khỏe, sức đề kháng cho con người, sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu đang phát triển với tốc độ nhanh, xu thế ngày càng phát triển về quy mô, phương thức, nguyên liệu sản xuất Nấm được trồng trên 100 quốc gia trên thế giới, tập trung chủ yếu ở các nước Châu á, chiếm 69,9% tổng sản lượng nấm Thế giới, châu Âu 21,9%, châu Mỹ 7,2%, châu Phi 0,2%, châu Đại dương 0,8%

Theo FAO (2015) tổng sản lượng nấm của thế giới có xu hướng tăng dần qua các năm, đặc biệt tăng cao trong các năm 2010 đến năm 2013.Ước tính sản lượng nấm của cả Thế giới vào khoảng 4,2 triệu tấn (năm 2000), 5,2 triệu tấn (năm 2005), 7,3 triệu tấn (năm 2010) và 9,9 triệu tấn (năm 2013) Năm nước có sản lượng nấm cao nhất thế giới từ năm 200 đến năm 2013 là Trung Quốc, Mỹ,

Ý, Nerthelands và Newzealand Trung Quốc là nước đứng đầu về sản lượng nấm với 7,0 triệu tấn nấm (năm 2013), chiếm 70,7% tổng sản lượng nấm Thế giới; Nerthelands là nước có năng suất nấm cao nhất với năng suất nấm trung bình năm 2013 là 4.614 tấn/ha, Trung Quốc đại lục 294 tấn/ha

Nấm Đông trùng hạ thảo với những hiểu biết ngày càng nhiều về giá trị

dược liệu của nó nên việc sử dụng Cordyceps militaris và các sản phẩm được chế biến từ Cordyceps militaris ngày một tăng cao Năm 1994 Trung Quốc chính

thức xếp ĐTHT là một loại dược phẩm và được sử dụng rất rộng rãi Năm 2003,

sự xuất hiện của dịch bệnh SARS, đã làm tăng giá trị của các sản phẩm ĐTHT Năm 2004 giá 1 kg nấm ĐTHT ở mức 10.000 USD/1kg tại Trung Quốc đã tăng lên 100.000 USD/kg năm 2013 Giá của sản phẩm này năm 2008 tại Mỹ cũng đạt 75.000 USD/kg (STINFO, 2015)

Tại Trung Quốc, năm 2004 giá trị sản xuất các mặt hàng thực phẩm chữa bệnh đạt 70 tỷ nhân dân tệ Nhật bản đạt mỗi năm 3,6 tỷ USD trong những năm

1990 Mỹ đạt mỗi năm 3,5 tỷ USD trong những năm 1990 Các sản phẩm thực

phẩm chức năng và thuốc từ Cordyceps militaris chiếm thị phần lớn Một số ví

dụ về giá sản phẩm được sản xuất từ nguồn nguyên liệu Cordyceps militaris như sau: sản phẩm viên nang Ultraceps được sản xuất từ Cordyceps của công ty

Zeolite với giá 41,95 USD/lọ, 90 viên/lọ, 650 mg/viên, Cordygen 5 với giá 19,95 USD/lọ 90 viên (Hoàng Tiến Công, 2010)

Đồ thị 1.1 Sản lượng nấm trên Thế giới từ năm 2000 – 2013

Đồ thị 1.2 Năng suất nấm của một số quốc gia trên Thế giới năm 2013

( Nguồn, FAOSTAT, 2015)

1.3.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

1.3.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

a Nghiên cứu về thành phần loài

Tác giả Trịnh Tam Kiệt (2001) đã công bố danh sách các loài nấm thuộc chi

Cordyceps có ở vệt Nam Đó là: Cordyceps martialis Speg., Cordyceps sinensis (Berk) Sacc và loài Cordyceps sobolifera (Hill) Berk & Br Phân bố chủ yếu ở các

tỉnh như Lào cai, Lai Châu, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quang Ninh, Hà Nội

Phạm Quang Thu và cs (2009b) phát hiện thêm hai loài thuộc chi Cordyceps mới ở Bắc Giang và Vĩnh Phúc là Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii

Phạm Quang Thu và cs (2010) phát hiện thêm loài nấm Đông trùng hạ thảo

nữa là Cordyceps talaomontana, đưa tổng số loài nấm ĐTHT được phát hiện ở

Việt Nam lên 06 loài

Phạm Thị Thùy và cs (2010) đã tiến hành thu thập 05 nguồn nấm Cordyceps spp tại một số vườn quốc gia ở Việt Nam, trong đo đã xác định Cordyceps militaris

có giá trị dược liệu, có khả năng làm thực phẩm chức năng cho người Việt Nam Hoàng Tiến Công (2010) nghiên cứu thành phần loài của nấm ĐTHT thuộc khu bảo tổn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang đã thu thập được 13

loài nấm ĐTHT, trong đó có 05 thuộc chi Cordyceps Thành phần các loài nấm

ĐTHT được phân bố theo nhiều loại hình rừng và độ cao khác nhau Đặc biệt 05

loài nấm thuộc chi Cordyceps thu thập được có sự đa dạng cao về giá trị dược liệu

Trần Văn Tú (2011) nghiên cứu về thành phần loài của nấm ĐTHT tại vườn quốc gia Hoàng Liên - Sapa - Lào Cai Tác giả đã phát hiện, thu hái, giám định và

phân lập được 8 loài nấm ĐTHT ký sinh trên 3 bộ côn trùng khác nhau: Cordyceps militaris, Cordyceps nutans, Cordyceps crinalis, Cordyceps formosana, Cordyceps pseudomilitaris

b Nghiên cứu về nhân giống nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

Phạm Quang Thu và cs (2009a) tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nấm ĐTHT trong môi trường nuôi cấy thuần khiết đã chỉ ra rằng 8 chủng nấm ĐTHT ở Việt Nam, 3 chủng nhập nội từ Nhật Bản, 1 chủng từ Trung Quốc, tất cả

đều sinh trưởng bình thường trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo Môi trường thích hợp là môi trường PDA có bổ sung thêm 10% nhộng tằm, nhiệt độ không khí thích hợp nhất là 20 - 25oC, một số chủng sinh trưởng ở nhiệt độ thấp 15oC, độ ẩm không khí 80 - 85% và môi trường pH là acid 4,5 - 6,5

Trần Thúy Hường (2010) nghiên cứu môi trường nuôi cấy nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris đã kết luận rằng: Môi trường bao gồm đường

sacarose, maltose, peptone, cao nấm men là tối ưu cho sinh trưởng hệ sợi nấm Đông trùng hạ thảo Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng hệ sợi của nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris là 26,2oC

Trần Văn Tú (2011) nghiên cứu xác định được một số đặc điểm sinh

trưởng của giống nấm Cordyceps militaris Nhiệt độ không khí khoảng 25oC là

độ ẩm thích hợp nhất cho nấm sinh trưởng và phát triển, độ ẩm không khí 80%, 85% sinh trưởng hệ sợi nấm nhanh hơn, môi trường pH 5-6 tốc độ sinh trưởng hệ sợi đạt 71,8-75,9 µm/h

Trong Hội nghị nấm học tổ chức tại Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh (11/2014) tác giả Vũ Xuân Tạo và cộng sự đã công bố kết quả

nghiên cứu về các yếu tố môi trường ảnh hưởng sự sinh trưởng của Cordyceps militaris và kết quả nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Cordyceps pseudomilitaris của Võ Thị Xuyến và cộng sự (STINFO, 2015)

c Nghiên cứu về nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

Trần Văn Mão (2002) nêu sơ bộ về môi trường nhân giống, kỹ thuật nuôi

trồng thể quả và nuôi cấy sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps sinensis Tuy nhiên,

những thông tin này đều tập hợp từ các nguồn tài liệu tham khảo của Trung Quốc

Phạm Quang Thu và cs (2015) tiến hành nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Đông trùng hạ thảo trong phòng thí nghiệm Thí nghiệm với nhiều loại giá thể khác nhau để tìm ra được công thức hiệu quả nhất để có thể nhân rộng việc nuôi cấy nhân tạo loài nấm này tại Việt Nam

Lê Thị Diệu Trang và cs (2013) đã báo cáo về công trình nghiên cứu sản

xuất nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sp quy mô phòng thí nghiệm Nhóm tác

giả này cũng đã công bố kết quả xây dựng quy trình nuôi cấy Cordyceps sinensis, đánh giá tính kháng oxy hóa và hàm lượng Adenosine trong Cordyceps sinensis

ThS Phạm Văn Nhạ - Trung tâm đấu tranh sinh học - Viện Bảo vệ Thực vật (2014) đã trở thành người đầu tiên ở Việt Nam nuôi trồng thành công nấm ĐTHT

Cordyceps militaris trên lý chủ nhộng tằm với giá bán 100 - 120 triệu đồng/1kg với sản phẩm trên con ký chủ và 7 triệu đồng/kg trên môi trường nhân tạo

1.3.2.2 Tình hình nghiên cứu công nghệ nhân giống dịch thể ở Việt Nam

Nước ta bắt đầu sản xuất nấm từ những năm 80 của thế kỷ 19, nhưng việc tiếp cận các cộng nghệ sản xuất tiên tiến, hiện đại của ngành nấm nước ta còn rất nhiều hạn chế Nghiên cứu và sản xuất nấm bằng công nghệ dịch thể với những

ưu điểm của mình đã và đang được thế giới phát triển mạnh Tuy nhiên vấn đề này ở Việt Nam có rất ít các công trình nghiên cứu liên quan Các công trình nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu thành phân môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho một số loại nấm nhất định

Lê Thị Hoàng Yến và cs (2003) đã thử nghiệm nhân giống nấm Vân Chi

(Trametes versicolo) trên môi trường lỏng cho kết quả thu được nấm Vân Chi sinh trưởng tốt trên môi trường 20 gam bột đậu tượng; 20 gam đường saccarose; 2,5 gam (NH4)2SO4; 2 gam CaCO3; 1 gam MgSO4; sinh khối sợi 16,68 g/lít

Vũ Thị Hằng (2012) nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ nhân giống

nấm Kim châm Flammulina velutipes dạng dịch thể Kết quả bước đầu cho thấy nấm Kim châm Flammulina velutipes sinh trưởng tốt nhất trong môi trường có

chứa 1g/l pepton 1g + 2g/l cao nấm men + 0,5g/l MgSO4.7H2O + 150 g/l nấm

sò tươi + 20 g/l cám ngô + 20 g/l glucose, nhiệt độ nuôi giống 22±1oC, tốc độ lắc

140 vòng/phút, thời gian nuôi giống từ 5 - 7 ngày

Nguyễn Thị Bích Thùy (2013) nghiên cứu công nghệ nhân giống nấm Sò

Vua (Pleurotus eryngii) và nấm Vân Chi (Tremates versicolo) dạng dịch thể Kết

quả đã xác định điều kiện tối ưu để nhân giống cấp 1 dạng dịch thể cho 2 loại nấm

này Nấm Sò Vua (Pleurotus eryngii) thích hợp với môi trường nhân giống 2,5 gam

Cao nấm men + 2,5 gam pepton + 0,5 gam MgSO4 7H2O + 1 gam KH2PO4 + 100 gam nấm tươi + 15 gam đường glucose, chế độ lắc 160 vòng/phút, tỷ lệ giống gốc

sử dụng là 30% ống giống gốc/200ml môi trường, thời gian nuôi là 96 giờ Giống

nấm Vân Chi thích hợp với môi trường nhân giống 2 gam cao nấm men + 0,2 gam MgSO4.7H2O + 1 gam KH2PO4 + 1,5 mg Thiamin + 15 gam đường glucose, chế độ lắc 140 vòng/phút, tỷ lệ giống gốc 30%, thời gian nuôi giống 84 giờ

Dự án sản xuất thử nghiệm nấm Ngọc Châm (Hypsizigus mamoreus) và nấm Chân Dài (Clytocybe maxima) theo quy mô công nghiệp giai đoạn từ 2012

đến 2014 do Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật thực hiện đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống cấp 1, cấp 2 (cấp trung gian) và quy trình nuôi trồng nấm Ngọc Châm và nấm Chân Dài dạng dịch thể Dự án đã xác định được điều kiện thích hợp để nhân giống nấm Ngọc Châm và nấm Chân Dài dạng dịch thể Song song với dự án sản xuất thử nghiệm, năm 2012 - năm 2014, Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp thực hiện đề tài Nghiên cứu công nghệ nhân giống dịch thể nấm ăn và nấm dược liệu Đề tài đã xây dựng công nghệ nhân giống nấm dạng dịch thể từ cấp 200 ml đến 5000 ml và công nghệ nhân giống nấm dịch thể trong hệ thống nồi lên mem với thể tích 120 lít cho đối tượng là 7 loại nấm ăn và nấm dược liệu khác nhau

1.3.2.3 Tình hình sản xuất nấm ở Việt Nam

Nước ta nghề trồng nấm được bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ 19 Hiện nay, Việt nam đang phát triển 6 loại Nấm chủ lực đó là: nấm rơm, mộc nhĩ, nấm hương, nấm mỡ, nấm sò, nấm dược liệu (Linh chi ,Vân chi, Đầu khỉ) Với những thuận lợi về điều kiện tự nhiên, nguồn nguyên vật liệu, nghề trồng nấm ở nước ta đã đạt được nhiều kết quả khả quan Tổng sản lượng nấm tăng bình quân qua các năm khoảng 7 - 10%/năm, cao nhất năm 2011 đạt 21,9 nghìn tấn, năm

2012 giảm xuống còn 20 nghìn tấn và năm 2013 có xu hướng phát triển trở lại với tổng sản lượng đạt 21 nghìn tấn (FAO, 2015)

Về thị trường, trong những mặt hàng rau xuất khẩu năm 2009 thì kim ngạch xuất khẩu nấm luôn đạt cao nhất Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, kim ngạch xuất khẩu nấm 11 tháng năm 2009 đạt 17 triệu USD, tăng 26,7% so với cùng kỳ 2008 Có 31 thị trường nhập khẩu nấm của Việt Nam, trong đó thị trường Hoa Kỳ đạt kim ngạch cao nhất với 7,7 triệu USD, tăng 29,7% so với cùng kỳ 2008