NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT VÀ SỬ DỤNG CẤU TỬ 2 – AP (2 – Acetyl – 1 – pyrroline) TRONG LÁ DỨA (Pandanus Amaryllifolius) NHƯ LÀ CHẤT CHUẨN ĐỂ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG 2 – AP TRONG GẠO THƠM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HÓA HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT VÀ SỬ DỤNG CẤU TỬ – AP (2 – Acetyl – – pyrroline) TRONG LÁ DỨA (Pandanus Amaryllifolius) NHƯ LÀ CHẤT CHUẨN ĐỂ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG – AP TRONG GẠO THƠM Họ tên sinh viên: Phạm Duy Quang Ngành: Cơng nghệ hóa học Niên khóa: 2006 – 2010 Tp.HCM, tháng 9/2010 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT VÀ SỬ DỤNG CẤU TỬ – AP (2 – Acetyl – – pyrroline) TRONG LÁ DỨA (Pandanus Amaryllifolius) NHƯ LÀ CHẤT CHUẨN ĐỂ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG – AP TRONG GẠO THƠM Tác giả PHẠM DUY QUANG GVHD: TS Phan Phước Hiền KS Trương Thị Bích Liễu Tp.HCM, tháng 9/2010 i LỜI CÁM ƠN Tơi xin chân thành cám ơn: - Ban giám hiệu trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh - Ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ hóa học q thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho kiến thức khoa học vô quý báu suốt thời gian học tập trường - TS Phan Phước Hiền KS Trương Thị Bích Liễu tận tình hướng dẫn tơi hồn tất khóa luận tốt nghiệp với tất tinh thần, trách nhiệm lòng nhiệt thành - Ban Lãnh đạo, tập thể Anh Chị Viện Công nghệ sinh học – Môi trường tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp thời gian vừa qua - Các bạn sinh viên lớp động viên giúp đỡ tơi q trình học tập thời gian thực đề tài - Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cha mẹ động viên tạo điều kiện thuận lợi để theo học trường - Chân thành cảm ơn Tháng năm 2010 Phạm Duy Quang ii TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chiết xuất sử dụng cấu tử – AP (2 – Acetyl – – pyrroline) dứa (Pandanus Amaryllifolius) chất chuẩn để phân tích định lượng – AP gạo thơm” tiến hành nhằm phân tích hàm lượng – AP dứa sử dụng cấu tử – AP chất chuẩn để phân tích định lượng – AP gạo thơm Trong dân gian, người ta thường xác định gạo thơm phương pháp truyền thống, gạo nấu chín sau người ta ngửi để nhận biết gạo có thơm hay khơng Việc xác định xác gạo có hàm lượng – AP thấp, sau nấu chín cho mùi thơm đặc trưng Nhưng để xác định hàm lượng chất thơm gạo cách thuyết phục hơn, nên thực đề tài với mục đích định lượng chất thơm gạo dựa vào cấu tử – AP dứa Điều đánh giá chất lượng loại gạo thơm Kết thu được: - Định tính – AP dứa sử dụng phương pháp SDE kết với sắc ký khí khối phổ GC – MS - Xác định hàm lượng – AP loại dứa già, non, bánh tẻ sử dụng chất ngoại chuẩn collidine phương pháp SDE kết hợp với GC - Bước đầu xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) phương pháp.Ngồi ra, chúng tơi cịn sử dụng cấu tử – AP chất chuẩn để thử nghiệm đánh giá hàm lượng chất thơm mẫu gạo Nanh chồn (lấy Viện Khoa học kĩ thuật nông nghiệp miền Nam) iii SUMMARY “Study for building process of extraction and using – AP constituent (2 – Acetyl – – pyrroline) in Pandanus leaves (Pandanus Amaryllifolius) as standard for quantitating – AP in aromatic rices” In popular, people often identify aromatic rices by traditional methods, in wich rice was cooked and then was smelled to identify that it’s scent or not This is quite exact because just need a little – AP content also impart a special “scent” But quantitating – AP need to be more convincible so that we carried out this essay to quantify – AP content in aromatic rices based on – AP constituent in pandanus leaves This can also evaluate quality of current aromatic rices Results observed: • Identified qualitative of – AP in pandanus leaves by using SDE method combined gas chromatography mass spectrum GC – MS • Determinated – AP content in three kinds of pandanus leaves, LOD and LOQ • Using – AP constituent in pandanus leave as a standard for testing and evaluating – AP content in aromatic rices iv MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN ii TÓM TẮT iii SUMMARY iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung 2.1.1 Giới thiệu sơ lược dứa 2.1.2 Giới thiệu sơ lược gạo thơm 2.1.2.1 Sơ lược lúa 2.1.2.2 Sơ lược gạo Sản xuất lúa gạo Việt Nam Sãn xuất lúa gạo giới 2.1.2.3 Sơ lược gạo thơm 2.2 Các nghiên cứu – Acetyl – – pyrroline (2 – AP) 2.2.1 Giới thiệu – AP 2.2.2 Các nghiên cứu – AP v 2.3 Phương pháp chiết xuất SDE (Simultaneous Distillation Extraction) 10 2.3.1 Nguyên lí hoạt động 10 2.3.2 Ứng dụng 10 2.4 Sắc ký khí khối phổ ( GC – MS Gas Chromatography – Mass Spectrum) 11 2.4.1 Sắc ký khí (GC Gas Chromatography) .11 2.4.2 Sắc ký khí khối phổ (GC – MS Gas Chromatography – Mass Spectrum) 13 2.4.3 Ứng dụng sắc ký khí 15 Nhược điểm 16 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 18 3.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị 18 3.2.1 Vật liệu .18 3.2.2 Hóa chất sử dụng 18 3.2.3 Dụng cụ thiết bị .19 3.3 Phương pháp nghiên cứu .19 3.3.1 Quy trình trích ly – AP dứa gạo phương pháp SDE 19 3.3.2 Công thức xác định hàm lượng – AP dứa mẫu gạo 22 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .23 4.1 Xác định peak collidine GC 23 4.2 Định tính – AP dứa phương pháp SDE kết hợp với GC – MS 24 4.3 Định lượng – AP dứa 27 4.4 Xác định LOD LOQ 28 4.5 Khảo sát hàm lượng – AP mẫu gạo Nanh chồn 34 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .36 5.1 Kết luận 36 vi 5.1.1 Định tính – AP phương pháp SDE kết hợp với GC – MS 36 5.1.2 Định lượng – AP dứa gạo thơm 36 5.1.3 Xác định LOD LOQ 36 5.2 Đề nghị 37 Tài liệu tham khảo PHỤ LỤC vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT – AP – Acetyl – – pyrroline [2 – AP] Nồng độ – AP SDE Simultaneous Distillation Extraciton (Trích ly kết hợp chưng cất đồng thời) GC Gas Chromotography (Sắc ký khí) GC - MS Gas Chromotography – Mass Spectrum (Sắc ký khí khối phổ) RF Response Factor (Hệ số phản hồi) LOD Limit Of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit Of Quantitation (Giới hạn định lượng) FAO Food and Agricultural Organization (Tổ chức nông lương quốc tế) IR Infrared Spectrocopy (Quang phổ hồng ngoại) ECD Electron capture detector (Đầu dò bắt điện tử) TMS Trimetylsilyl viii - AP Hình 4.6: Sắc ký đồ GC mẫu dứa bánh tẻ pha loãng 50 lần - AP Hình 4.7: Sắc ký đồ GC mẫu dứa bánh tẻ pha loãng lần 29 - AP Hình 4.8: Sắc ký đồ GC mẫu dứa bánh tẻ pha lỗng 10 lần Hình 4.9: Sắc ký đồ GC mẫu dứa bánh tẻ pha loãng 80 lần 30 4.4.2 Phương pháp 2: Dựa Signal to noise (tín hiệu nhiễu nền) Xác định tỉ lệ S/N cách so sánh tín hiệu đo từ mẫu với hàm lượng thấp chất phân tích với mẫu trắng thiết lập nồng độ thấp mà chất phân tích phát tin cậy Thông thường tỷ lệ S/N = sử dụng để tính tốn giới hạn phát S N Hình 4.10: Sắc kỹ đồ GC mẫu dứa bánh tẻ pha loãng 50 lần (phóng to) Dựa vào sắc ký đồ mẫu pha lỗng 50 lần, ta tính tỉ lệ S/N: S/N = = 4.83333 >= Ta chấp nhận tỷ lệ hình dạng peak – AP nồng độ thấp có tượng dỗn chân peak Nếu hạ thấp nồng độ ta khó xác định peak hợp chất – AP 4.4.3 Phương pháp 3: Dựa độ lệch chuẩn tín hiệu hệ số góc Để xác định độ lệch chuẩn hệ số góc, ta dựng đồ thị hiểu chỉnh gồm điểm có diện tích peak nồng độ tương ứng Sau pha loãng lần, 10 lần, 50 lần, ta tiến hành phân tích GC diện tích peak tương ứng với sắc ký đồ: 31 Lá dứa bánh tẻ Diện tích peak (pA*s) Khơng pha lỗng 20672313 Pha loãng lần 8173790 Pha loãng 10 lần 1563679 Pha lỗng 50 lần 164385 Bảng 4.3: Diện tích peak – AP mẫu pha loãng lần, 10 lần, 50 lần Tương tự, theo công thức Butery ctv (1986) trên, ta tính nồng độ – AP mẫu pha loãng: Lá dứa bánh tẻ Diện tích peak (pA*s) Nồng độ – AP (ηg/kg) Khơng pha lỗng 20672313 737,8198 Pha lỗng lần 8173790 291,7321 Pha loãng 10 lần 1563679 55,80953 Pha loãng 50 lần 164385 5,867092 Bảng 4.4: Nồng độ – AP (ηg/kg) mẫu pha loãng Hình 4.11: Đồ thị hiệu chỉnh dựa vào diện tích nồng độ – AP mẫu bánh tẻ pha loãng 5, 10, 50 lần 32 Đồ thị xem đường chuẩn khảo sát dựa mẫu có nồng độ chất phân tích khác nhau, giá trị y-intercept đường tuyến tính sử dụng độ lệch chuẩn Cơng thức tính LOD LOQ cho phương pháp này: LOD = 3,3* /S LOQ = 10* /S Với = độ lệch chuẩn tín hiệu S = hệ số đường hiệu chỉnh Dựa vào đường hiệu chỉnh phương trình ta xác định hệ số đường hiệu chỉnh S = 4*10-5 Để tính độ lệch chuẩn, ta sử dụng phương pháp hồi qui phần mềm MS Excel Có cách tính cho kết tương tự Cách thứ nhất, dùng tính hồi qui (Regression) có sẵn MS Excel Ta cần làm theo bước (wizard) có bảng thống kê sau: SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R R Square Adjusted R Square Standard Error 4.7645E-05 Observations ANOVA df Regression Residual Total Intercept X Variable SS 334939.1348 4.57094E-09 334939.1348 Coefficients -4.3E-05 3.57E-05 Significance MS F F 334939.1 1.47E+14 6.82E-15 2.29E-09 Standard Error t Stat 3.28512E-05 -1.31241 2.94826E-12 12105850 P-value 0.319767 6.82E-15 Lower 95% -0.00018 3.57E-05 Bảng 4.5: Bảng phân tích hồi qui đồ thị hiệu chỉnh (MS Excel) 33 Từ xác định độ lệch chuẩn = 4,76456*10-5 Cách thứ hai, dùng hàm Steyx(known_y’s, known_x’s) với known_y’s cột giá trị y tương ứng với cột diện tích peak, known_x’s cột giá trị x tương ứng với cột nồng độ – AP Và kết độ lệch chuẩn = 4,76456*10-5 Như vậy, ta tính LOD LOQ theo phương pháp là: LOD = 3,3 = 3,93 ηg/kg LOQ = 10 = 11,911388 ηg/kg 4.5 Khảo sát hàm lượng – AP mẫu gạo Nanh chồn 3: Việc chuẩn bị mẫu gạo giống dứa Sau chuẩn bị mẫu, bơm vào máy sắc ký khí Đối với mẫu Nanh chồn (50 g) peak - AP xuất dạng vết, mẫu Nanh chồn (45 g) hàm lượng – AP nhiều hơn: - AP Hình 4.12: Sắc ký đồ phân tích hợp chất thơm 45 g mẫu gạo nanh chồn Dựa vào sắc ký đồ, ta xác định diện tích peak – AP mẫu gạo nanh chồn 263182 pA*s 34 Ta sử dụng đồ thị hiệu chỉnh (hình 4.8) đường chuẩn hợp chất – AP với diện tích nồng đồ tương ứng để xác định hàm lượng – AP gạo Đối chiếu diện tích peak – AP mẫu gạo lên đường chuẩn ta có nồng độ –AP mẫu gạo nanh chồn tương ứng là: [2 – AP]nanh chồn = 4*10-5*263182 – 6*10-14 = 10,52728 ηg/kg Như vậy, hàm lượng – AP mẫu gạo Nanh chồn lớn giới hạn phát LOD nhỏ giới hạn định lượng LOQ Điều có nghĩa ta phát xác peak – AP 45 g mẫu gạo Nanh chồn hàm lượng ta tính bên khơng xác lượng – AP mẫu q Một cách tương đối, ta chấp nhận lượng – AP mẫu gạo Nanh chồn 10,52728 ηg/kg so với giới hạn định lượng LOD = 11,9 ηg/kg số chênh lệch không đáng kể Mẫu gạo Hàm lượng – AP (ηg/kg) Nanh chồn Dạng vết Nanh chồn 10,52728 Bảng 4.6: Hàm lượng – AP khảo sát mẫu gạo nanh chồn 35 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận: 5.1.1 Định tính – AP phương pháp SDE kết hợp với GC – MS: - Thời gian lưu hợp chất – AP xác định phương pháp SDE kết hợp GC – MS điều kiện phịng thí nghiệm 13,052 phút - Hệ số phản hồi – AP theo chất ngoại chuẩn collidine 1400906900 pA*s/µg 5.1.2 Định lượng – AP dứa gạo thơm: - Hàm lượng - AP dứa thơm Dĩ An, Bình Dương cụ thể loại dứa non, bánh tẻ, già 2,0757218 ppb; 0.7378189 ppb; 1,134134 ppb Như vậy, lượng – AP diện nhiều dứa non, dứa già dứa bánh tẻ - Hàm lượng – AP mẫu gạo nanh chồn 10,52728 ηg/kg mẫu nanh chồn 5.1.3 Xác định LOD LOQ: Đối với phương pháp phân tích SDE kết hợp GC: Phương pháp tính LOD LOQ (ηg/kg) (ηg/kg) Dựa ước lượng thị giác 5,87 - Dựa tín hiệu nhiễu 4,833 - 36 Dựa độ lệch chuẩn tín hiệu hệ số góc 3,93 11,91 5.2 Đề nghị: - Nhu cầu sử dụng gạo thơm người dân ngày tăng việc xác định – AP mẫu gạo thơm thực tế Nhưng để việc phân tích tốt nên đầu tư trang thiết bị đại hơn, cột tách với hiệu tách cao đầu cực nhạy - Để phương pháp hoàn thiện cho hiệu tối ưu nên nhà nghiên cứu nước tiếp tục nghiên cứu cải tiến liên tục - Đề tài nghiên cứu có ý nghĩa khả ứng dụng cao sử dụng phương pháp tương đối đơn giản hiệu (chiết suất phương pháp SDE kết hợp phân tích GC – MS) - Ngồi ra, ta sử dụng phương pháp SPME để đánh giá nhanh hàm lượng – AP gạo thơm 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Phan Phước Hiền, Trương Thị Bích Liễu, Huỳnh Vĩnh Khang, Đỗ Khắc Thịnh, 2009: Phân tích so sánh hàm lượng mùi thơm – AP dứa (Pandanus amarillifolius) với gạo thơm bàng SPME-GC/GCMS DES-GC/GCMS Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng Lâm Lâm nghiệp số 02/2009, tr – 13 Phạm Hùng Việt, 2004 Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết khả ứng dụng Nhà xuất Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Kim Phi Phụng, 2006 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trương Thị Bích Liễu, 2008 KLTN – Khảo sát hàm lượng mùi thơm – Acetyl – – pyrroline dứa (Pandanus armallifolius) số giống gạo Ngô Lâm Tuấn Anh 2009 Bài giảng môn học Phân tích thực phẩm Trường Đại học Sư phạm kỹ thuật TP Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng nước ngồi: Phan Phuoc Hien, Truong Thi Bich Lieu, Nguyen Thi Thu Huong, Huynh Vinh Khang, 2009: Analysis and comparison of – Acetyl – 1- pyrroline content in Pandanus’ leaf with aromatic rice by SPME and SDE coupling with GC and GCMS The Analytica Conference 2009, Organized by Vietnam Analytical Science Society (VASS), tr 149 – 156 Sugunya Wongpornchai, Tinakorn Sriseadka, Suppachai Choonvisase, 2003 Identification and Quantitation of the Rice Aroma Compound, – Acetyl – pyrroline, in Bread Flowers (Vallaris glabra Ktze), J Agric Food Chem, 2003, 51 (2), tr 457 – 462 Casey C Crimm, Christine Bergman, Janis T Delgado and Rolfe Bryant, 2001 Screening for – Acetyl – – pyrroline in the Headspace of Rice Using SPME/GC – MS, J Agric Food Chem., 2001, 49(1), tr 245 – 249 T Yoshihashi, 2002 Quantitative Analysis on – Acetyl – – pyrroline of an Aromatic Rice by Stabe Isotope Dilution Method and Model Studies on its 38 Formation during Cooking, Jounal of Food Science, 67 (2), March 2002, tr 619 – 622 Paramita Bhattachrjee, Amol Kshirsagar and Rekha S Singhal, 2004 Supercritical carbon dioxide extraction of – acetyl – – pyrroline from Pandanus amaryllifolius Roxb, Food Chemistry, 91 (2), June 2005, tr 255 – 259 Stoichey T, Baptista MS, Basto MC, Carvalho PN, Vasconcelos MT, 2008 Application of SPME to the determination of alkylphenols and bisphenol A in cyanobacteria culture media, Anal Bioanal Chem, 32(1), Apr 2008, tr 391 – 425 M de Frutos, J Sanz and l Martinez – Castro Simultaneous distillation – extration (SDE) method in the qualitative and quantitative GC analysis of cheese volatile components, vol 25 (10), tr 861 – 864 Xugang Gu, Zhengzhu Zhang, Xiaochun Wan, Jingming Ning, Chengcheng Yao, Wanfang Shao, 2009 Simultaneous Distillation Extraction of some volatile flavor components from Pu-erh Tea Samples – Comparison with Steam Distillation – Liquid/Liquid Extraction and Soxhlet Extraction, International Journal of Analytical Chemistry, vol 2009 (2009) Wei Y, Li B, Duan H, Wu X, Yao X, 2010 An integrated simultaneous distillation – extraction apparatus for the extraction of essential oils from herb materials and its application in Flos Magnoliae, Biomed Chromatogr 2010 Mar, 24 (3) Các website: http://vi.wikipedia.org/wiki/L%C3%BAa http://vi.wikipedia.org/wiki/G%E1%BA%A1o http://en.wikipedia.org/wiki/2 – Acetyl – – pyrroline http://www.freepatentsonline.com/4522838.html http://gaovnf1.vn/online/index.php/Lua – gao – Viet – Nam/sn – xut – lua – tren – th – gii.html 39 http://cayluongthuc.blogspot.com/2009/04/ac – tinh – mot – so – giong – lua – chu – luc – va.html http://www.chemvn.net/chemvn/showthread.php?t=5062 http://forum.vfx.vn/phan-tich-k-thu-t/936-l-ch-chu-n-post2796.html http://www.chemvn.net/chemvn/showthread.php?p=57912 40 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Khối phổ hợp chất thời gian lưu 13.038 dứa bánh tẻ Phụ lục 1: Tủ sấy Memmert, serial UM400 41 Phụ lục 2: Cân điện tử số Precia Phụ lục 3: Máy xay Philips, Rego design No 170851 Phụ lục 4: Thiết bị gia nhiệt Jakie, JK – 579 (Mỹ) 42 Phụ lục 5: Máy làm lạnh Fisher model 10201, serial G52434 (Mỹ) Phụ lục 6: Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby, serial 10449 (Mỹ) Phụ lục 7: Máy sắc khí khối phổ 6890 N, serial G1530N (Mỹ) 43 ...NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT VÀ SỬ DỤNG CẤU TỬ – AP (2 – Acetyl – – pyrroline) TRONG LÁ DỨA (Pandanus Amaryllifolius) NHƯ LÀ CHẤT CHUẨN ĐỂ PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG – AP TRONG. .. đề tài ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chiết xuất sử dụng cấu tử – AP (2 – Acetyl – – pyrroline) dứa (Pandanus Amaryllifolius) chất chuẩn để phân tích định lượng – AP gạo thơm? ?? 1 .2 Mục... đích yêu cầu 1 .2. 1 Mục đích Sử dụng cấu tử – AP dứa chất chuẩn để phân tích định tích định lượng – AP gạo thơm 1 .2. 2 Yêu cầu - Xây dựng quy trình kỹ thuật chiết xuất phân tích – AP dứa phương pháp