Luận văn nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống hoa cúc CN97 bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Trờng đại học vinh Khoa sinh học Trần thị thu hiền Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống hoa cúc cn97 bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro Khoá luận tốt nghiệp đại học Ngành cử nhân khoa học sinh học Vinh, 5 - 2007 1 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Th.s Mai Văn Chung - cán bộ hớng dẫn khoa học, Th.s Phạm Thị Nh Quỳnh, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào đã hớng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thiện khoá luận. Tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn sinh lý- sinh hoá, sự tạo điều kiện và ủng hộ của các cán bộ phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - tế bào thực vật khoa Sinh học, trờng Đại học Vinh. Xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ, cung cấp t liệu, hoá chất, nguồn giống của viện Công nghệ sinh học (thuộc viện Khoa học và Công nghệ Viêt Nam). Cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Lần đầu tiên tham gia nghiên cứu khoa học sẽ không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đợc những ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để đề tài nghiên cứu của tôi đợc hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng 5 năm 2007 Sinh viên thực hiện Trần Thị Thu Hiền 2 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Những chữ viết tắt sử dụng trong khoá luận NCM-TB : Nuôi cấy mô-tế bào CNSH : Công nghệ sinh học IAA : Axít ò Indol acetic - NAA : Axít Naphtyl acetic IBA : Axít Indol butyric BA/BAP : 6 benzyl adenin (6 benzyl amino purine) K : Kinetin MS : (Môi trờng dinh dỡng) Murashige & Skoog 1962 ppm : part per millon ( phần triệu ) mM : milimol 3 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Mục lục Trang Mở đầu 1 chơng 1 : tổng quan tài liệu 3 1.1. Cây hoa cúc 3 1.1.1. Nguồn gốc, vị trí và phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc 3 1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa cúc 4 1.2. Tình tình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam 5 1.2.1. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới 5 1.2.2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc ở Việt Nam 6 1.3. Tình hình nghiên cứu tạo giống in vitro cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.3.1. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc trên thế giới 7 1.3.2. Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở Việt Nam 9 1.4. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật in vitro 12 1.4.1. Cơ sở khoa học của công nghệ NCM TB thực vật 12 1.4.2. Môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 1.4.3. Kỹ thuật nhân giống in vitro 20 Chơng 2: đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 23 2.2. Nội dung nghiên cứu 23 2.3. Phơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Vật liệu khởi đầu 23 2.3.2. Giai đoạn khử trùng mô nuôi cấy và vào mẫu 23 2.3.3. Giai đoạn nhân nhanh 24 2.3.4. Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh 25 2.3.5. Giai đoạn huấn luyện thích nghi 26 2.3.6. Phơng pháp xử lý số liệu 26 4 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Chơng 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận 27 3.1. Kết quả nghiên cứu của giai đoạn vào mẫu 27 3.2. Kết quả nghiên cứu của giai doạn nhân nhanh 31 3.3. Kết quả nghiên cứu giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh 35 3.4. Kết quả nghiên cứu giai đoạn huấn luyện thích nghi 38 3.5. So sánh kết quả của đề tài với một số nghiên cứu khác 41 3.6. Một số lu ý trong quá trình nhân giống in vitro hoa cúc CN97 43 Kết luận và đề nghị 44 A. Kết luận 44 B. Đề nghị 45 tài liệu tham khảo 46 PHụ Lục 50 5 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Mở đầu Hoa là một món quà đặc biệt, có thể ví nh nguồn cảm hứng thanh tao, hay ngời bạn tri âm, tri kỷ mà thiên nhiên đã ban tặng cho con ngời. Từ bao đời nay, hoa đã gắn liền với đời sống của con ngời, mang đến cho con ngời biết bao cảm xúc, niềm tin và tình yêu cuộc sống. Ngày nay, nhu cầu về hoa trên thị trờng rất lớn và ngày càng tăng cao. Sản xuất hoa đã trở thành một ngành kinh tế phát triển đem lại nguồn thu nhập cao cho nền kinh tế quốc dân của nhiều nớc trên thế giới nh Hà Lan, Nhật, Mỹ. Theo Roger và Alan (1998), năm 1997, giá trị sản lợng hoa trên thế giới đạt 27 tỷ USD và những năm đầu thế kỷ XXI là 40 tỷ USD [41]. ở nớc ta, sản xuất hoa đã và đang đợc u tiên đầu t phát triển, diện tích trồng hoa không ngừng tăng lên. Ví dụ nh: diện tích trồng hoa của Hà Nội năm 1995 đạt 500 ha, tăng 12,8 lần so với năm 1990 [5], đến năm 2001, đạt tới 867 ha [33]. Cúc là một trong những loại hoa đợc trồng phổ biến. Hoa cúc đợc a chuộng không chỉ bởi màu sắc đẹp, hơng thơm kín đáo, đa dạng về dáng vẻ mà còn bởi vẻ đẹp thanh tao, quý phái của một loại hoa quân tử. Ngời phơng Đông trang trọng đặt hoa cúc thuộc loại cây tứ quý là tùng, cúc, trúc, mai . Ngời Nhật Bản xem cúc là quốc hoa và thờng dùng hoa cúc trong những buổi lễ quan trọng. Hoa cúc còn đợc yêu thích bởi độ tơi lâu một đặc điểm không phải loại hoa nào cũng có. Bên cạnh những giá trị tinh thần, hoa cúc còn có nhiều giá trị khác: kim cúc, bạch cúc dùng làm thuốc chữa bệnh (đau mắt, đau đầu), cúc trừ tùng dùng làm thuốc trừ sâu, cúc chi dùng để chiết tinh dầu thơm, ngâm r- ợu [25]. Cúc đã trở thành cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế lớn. Ước tính, 1 sào đất trồng hoa cúc có thể đạt doanh thu 3 - 5 triệu đồng, chi phí cho sản xuất chỉ mất 1,5 - 2 triệu đồng/ha tiền vốn, trong khi đó, nếu trồng lúa 1 sào đất trồng chỉ đạt 350 - 400 nghìn đồng [21]. Nớc ta có điều kiện khí hậu rất thuận lợi để trồng hoa cúc. Chính vì vậy, hiện nay, cùng với hồng, cúc là loại hoa cắt cành đợc trồng rộng rãi. Việc phát triển sản xuất hoa cúc không chỉ nâng cao thu nhập cho ngời lao động mà còn góp phần thúc đẩy chuyển dịch cơ cấu cây trồng, góp phần đẩy nhanh tiến trình công nghiệp hoá, hiện đại hoá nông nghiệp và phát triển nông thôn. Tuy nhiên, 6 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền ngành sản xuất hoa nói chung và sản xuất hoa cúc nói riêng của nớc ta hiện nay còn gặp nhiều khó khăn, nhất là chất lợng hoa còn thấp, cha đủ tiêu chuẩn để xuất khẩu. Một trong những nguyên nhân chủ yếu là nguồn cây giống còn cha đáp ứng đợc yêu cầu cả về lợng và chất [33]. Để khắc phục tình trạng trên, góp phần phát triển vững chắc và đem lại hiệu quả kinh tế cao cho cây cúc, nhiệm vụ cấp bách hiện nay là phải ứng dụng công nghệ cao vào sản xuất tạo giống. Kỹ thuật nhân giống in vitro cho phép sản xuất đợc nguồn giống sạch bệnh, chất lợng cao, có độ đồng đều lớn, giữ đ- ợc những đặc tính quý của cây gốc mà các phơng pháp nhân giống truyền thống khó có thể đáp ứng đợc. áp dụng phơng pháp này vào nhân giống, tạo nguyên liệu cho ngành sản xuất hoa ở nớc ta, đã có những nghiên cứu về quy trình nhân giống in vitro một số loại hoa nh: đồng tiền, lily, hồng môn, phong lan trong đó có hoa cúc, đã đợc công bố và ứng dụng [2, 3, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 21, 23, 24, 27, 29, 30]. Tuy nhiên, nghiên cứu hoàn thiện quy trình cũng nh đề xuất các kỹ thuật nhân giống mới cho các giống hoa, nhất là các giống mới nhập nội, vẫn thực sự cần thiết. Xuất phát từ những lý do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống hoa cúc CN97 bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng đợc quy trình nhân giống hoa cúc nhập nội CN97 từ nguyên liệu khởi đầu là các đoạn thân mang mắt ngủ và đỉnh sinh trởng bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro. Để thực hiện mục tiêu đó thì nhiệm vụ của đề tài là: Thử nghiệm và tìm điều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp cho các giai đoạn vào mẫu cấy gây, nhân nhanh, ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi, từ đó đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống hoàn chỉnh đối với giống hoa cúc CN97. 7 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền Chơng 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Cây hoa cúc. 1.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại Cây hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp., xuất phát từ tiếng Hy Lạp là Chrysos (nghĩa là vàng) và Anthemon (nghĩa là hoa). Cây hoa cúc bắt nguồn từ Nhật Bản, Trung Quốc và một số nớc châu âu. Trong hệ thống phân loại thực vật, Cúc đợc xếp vào lớp Hai lá mầm (Dycotyledones), phân lớp Cúc (Asteriles), bộ Cúc (Asterales), họ Cúc (Asteraceae), phân họ hoa Cúc (Ateroideae), chi Chrysanthemum [6]. Họ Cúc là họ lớn nhất: bao gồm tới 1000 chi và hơn 20 nghìn loài, phân bố ở khắp mọi nơi trên Trái đất, sống đợc ở rất nhiều môi trờng khác nhau. Nớc ta hiện có 125 chi và trên 350 loài cúc, phân bố rộng rãi từ vùng ven biển đến các vùng núi cao tới 3000m so với mặt nớc biển [26]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc Cây cúc có các đặc điểm thực vật sau: - Rễ: Rễ cây cúc thuộc loại rễ chùm, chủ yếu phát triển theo chiều ngang ở độ sâu 10 20 cm; có khả năng hút nớc và chất dinh dỡng mạnh mẽ do có nhiều rễ phụ và lông hút. Do cúc chủ yếu đợc trồng bằng phơng pháp nhân giống vô tính nên các rễ không phát sinh từ mầm rễ cúc hạt mà là từ những mấu của thân (còn gọi là mắt) ở phần ngang sát mặt đất. - Thân: Cúc là cây thân thảo, nhỏ, có nhiều đốt, dòn, dễ gẫy, càng lớn càng cứng, khả năng phân nhánh mạnh. Thân có thể cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm, thân đứng hay thân bò phụ thuộc vào từng giống và từng thời vụ trồng. Những giống nhập nội thân thờng to, mập, thẳng và giòn. - Lá: Lá cây hoa cúc thờng mọc cách và không có lá kèm, lá đơn xẻ thuỳ có răng ca sâu. Phiến lá mềm, mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc xanh đậm hay xanh nhạt phụ thuộc vào từng giống. Mặt dới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ mặt trên nhẵn, gân hình mạng. Trong một chu kỳ sinh trởng của cây cúc có từ 30 - 50 lá trên thân. 8 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền - Hoa: Hoa cúc có thể đơn tính hay lỡng tính. Mỗi hoa gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi cánh thực chất là một bông hoa. Màu sắc và kích thớc hoa rất phong phú. Đờng kính của bông hoa phụ thuộc vào từng giống, giống hoa to có đờng kính 10 - 12 cm, loại trung bình đờng kính từ 5 - 7 cm và loại nhỏ từ 1- 2 cm. - Quả: Quả cúc thuộc loại quả bế, đóng, chứa một hạt. Quả có chùm lông dài để phát tán hạt. Hạt có phôi thẳng và có không có nội nhũ. 1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa cúc [11] - Nhiệt độ: là một trong những yếu tố quan trọng quyết định đến sự sinh trởng, phát triển nở hoa và chất lợng của hoa cúc. Cây hoa cúc có nguồn gốc ôn đới a khí hậu mát mẻ hoặc chỉ nóng trung bình. Nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trởng phát triển là từ 10 - 25 0 C. ở thời kỳ cây con, cây hoa cúc cần nhiệt độ cao hơn. Cúc có thể chịu đợc nhiệt độ từ 10 - 35 0 C. Ngoài khoảng nhiệt độ này, cúc sinh trởng phát triển kém. ở Việt Nam, hầu hết các giống cúc sinh trởng và phát triển gần nh quanh năm, trừ những vùng, những mùa quá nóng hoặc ma quá nhiều. Trong thời kỳ ra hoa, cây cúc cần đảm bảo nhiệt độ thích hợp cho từng loại hoa cúc để thu đợc hoa to và đẹp [19, 37]. - ánh sáng: cần thiết cho phản ứng quang hợp của cây, ảnh hởng rất lớn đến sự phân hoá mầm hoa và sự nở hoa của cúc. Cúc là loại cây a sáng, tuy nhiên ánh sáng quá mạnh sẽ làm cúc chậm lớn. Hầu hết các giống cúc cần ánh sáng ngày dài hơn 13 giờ. Trong thời gian trổ hoa, cây cúc chỉ cần ánh sáng ngày ngắn từ 10 - 11 giờ và nhiệt độ không khí nhỏ hơn 20 0 C. Trong điều kiện thời gian chiếu sáng ngắn, cúc sinh trởng phát triển mạnh, cây cao, hoa to, đẹp. Bởi vậy cúc rất thích hợp với thời tiết thu đông, đông xuân [20]. - Độ ẩm: độ ẩm đất 60 - 70% và độ ẩm không khí 55 - 65% rất thuận lợi cho cúc sinh trởng. Nếu độ ẩm trên, dới 80%, cây sinh trởng mạnh nhng dễ mắc một số bệnh nấm. Đặc biệt là vào thời kỳ thu hoạch, hoa cúc cần thời tiết trong xanh, khô ráo. Nếu độ ẩm quá cao sẽ bị thối do nớc đọng lại trong các tuyến mật của hoa hoặc hoa dễ bị dập nát, việc thu hoạch gặp khó khăn do cây nhiều nớc dễ bị đổ non [9, 20, 38]. 9 Khoá luận tốt nghiệp đại học Trần Thị Thu Hiền - Đất và dinh dỡng: đất có vai trò cung cấp nớc, dinh dỡng, không khí cho sự sống của cây hoa. Cây cúc là cây trồng cạn có bộ rễ nông nên cần đất trồng khô ráo, thoát nớc, tơi xốp, nhiều mùn [9]. Việc bón phân cho cây hoa nói chung và cây hoa cúc nói riêng phải đảm bảo đầy đủ và cân đối. Nếu thiếu phân, cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ. Nhng nếu thừa phân, thân cây sẽ cao vống, dễ bị đổ, khả năng chống chịu kém. Các loại phân mà cúc cần là: phân vô cơ nh đạm, lân, kali; phân hữu cơ nh phân bắc, phân chuồng; phân vi sinh và các loại phân vi lợng nh Cu, Fe, Zn, Mn. Trong các loại phân vô cơ, cúc cần có nhiều đạm vào giai đoạn sinh tr- ởng sinh dỡng (từ lúc còn nhỏ đến lúc phân hoá mầm hoa) với lợng đạm nguyên chất cho một ha trồng cúc là 140 160 kg. Cúc cần nhiều lân và kali vào giai đoạn hình thành hoa và nụ hoa với lợng lân nguyên chất là 100 - 200 kg cho một ha đất trồng cúc. Đối với phân vi lợng, cúc cần một liều lợng rất ít nhng không thể thiếu đợc. 1.2. Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới và ở Việt Nam. 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới. Năm 1688, Jacob Layn (Hà Lan) là ngời đầu tiên trồng và phát triển nghề trồng cúc mang tính thơng mại. Đầu thế kỷ XX, cây hoa cúc đã có ý nghĩa thơng mại trên toàn thế giới [9]. Ngày nay, hoa cúc là một trong những loài hoa phổ biến nhất. Hoa cúc đ- ợc a chuộng bởi sự đa dạng, phong phú về màu sắc và dáng vẻ của hoa. Ngời ta có thể điều khiển sự ra hoa của cây tạo nên nguồn sản phẩm hàng hoá liên tục và ổn định quanh năm. Chính vì thế, trên thị trờng thế giới, hoa cúc là loại hoa cắt cành chiếm vị trí thứ hai chỉ sau hoa hồng [19, 25]. Kim ngạch giao lu buôn bán về hoa cúc hàng năm ớc đạt 1,5 tỷ USD [9]. Bốn nớc sản xuất hoa cúc nhiều nhất trên thế giới là: Hà Lan, Colombia, ý, Mỹ [40]. Riêng Hà Lan, hàng năm, quốc gia này đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt và chậu hoa phục vụ cho thị trờng tiêu thụ rộng lớn trên khắp thế giới. Một trong những yếu tố tạo nên thành công của Hà Lan là sự áp dụng ph- ơng pháp nhân giống in vitro vào sản xuất: năm 1982, đã sản xuất 3.119.000 cây giống in vitro, đến năm 1986, số lợng cây cúc giống in vitro đã lên tới 10