Nhân nhanh giống mía c95 186 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro luận văn tốt nghiệp đại học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA SINH HỌC ĐẶNG MINH HẰNG NHÂN NHANH GIỐNG MÍA C95-186 BẰNG CƠNG NGHỆ NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT IN VITRO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC VINH 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô giáo Th.s Phạm Thị Như Quỳnh, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào hướng dẫn tận tình tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt thời gian nghiên cứu hồn thành đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn ý kiến đóng góp q báu thầy giáo mơn sinh lí – sinh hố, tạo điều kiện ủng hộ cán phịng thí nghiệm Nuôi cấy mô – tế bào thực vật Cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi trình thực đề tài Lần tham gia nghiên cứu khoa học khơng tránh khỏi thiếu sót, mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn bè để đề tài nghiên cứu tơi hồn thiện Xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng năm 2011 Sinh viên thực Đặng Minh Hằng MỤC LỤC Đặt vấn đề Chương I Tổng quan tài liệu 1.1 Công nghệ NCM-TB thực vật in vitro 1.1.1 Cơ sở khoa học công nghệ NCM-TB thực vật in vitro 1.1.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro 13 1.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống mía cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro giới Việt Nam .14 1.2.1 Trên giới 14 1.2.2 Ở Việt Nam 14 1.3 Tìm hiểu chung mía .17 1.3.1 Đặc điểm thực vật mía 17 1.3.2 Yêu cầu ngoại cảnh mía 18 Chương II Đối tượng, nội dung phương pháp nghiên cứu 20 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 20 2.1.3 Thời gian nghiên cứu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 21 2.3.2 Điều kiện thí nghiệm 21 2.3.3 Vật liệu khởi đầu 21 2.3.4 Giai đoạn vào mẫu .21 2.3.5 Giai đoạn nhân nhanh 22 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 22 Chương III Kết nghiên cứu thảo luận .23 3.1 Kết nghiên cứu giai đoạn vào mẫu .23 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lí hố chất khử trùng HgCl2 0,1% đến tỉ lệ thành công đỉnh sinh trưởng .23 3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian xử lí hố chất khử trùng H2O2 10% đến tỉ lệ thành công đỉnh sinh trưởng .25 3.1.3 So sánh thí nghiệm 27 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh 28 3.2.1 Ảnh hưởng hàm lượng BAP đến hệ số nhân nhanh sinh trưởng phát triển chồi mía in vitro giống mía C95-186 28 3.2.2 So sánh kết nghiên cứu với nghiên cứu khác 32 3.3 Một số lưu ý trình nhân giống mía kỹ thuật ni cấy mơ in vitro (giai đoạn vào mẫu nhân nhanh) .36 3.3.1 Giai đoạn vào mẫu .36 3.3.2 Giai đoạn nhân nhanh 36 Kết luận đề nghị 37 A Kết luận 37 B Đề nghị 37 Tài liệu tham khảo 38 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHỐ LUẬN NCM – TB : Ni cấy mơ – tế bào BAP : 6- benzylamino purin IAA : Indolylacetic α-NAA : Naphthylacetic axit KI : Kinetin MS : (Môi trường) Marashige & Skoog 1962 ppm : part per millimon (phần triệu) mM : millimol mg : milligam in vitro : (điều kiện) nuôi cấy nhân tạo CT : Công thức Chất ĐTST : Chất điều tiết sinh trưởng ĐẶT VẤN ĐỀ Cây mía (Saccharum officinarum L) thuộc ngành thực vật có hạt (Spermatophyta), lớp mầm (Monocotyledneae), họ hồ thảo (Gramineae), chi Saccharum, cơng nghiệp có nhiều giá trị, chủ yếu để cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến đường Đường loại thực phẩm cần thiết cho đời sống, cung cấp lượng lớn cho người Đường nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp thực phẩm như: sản xuất bánh kẹo, đồ hộp, giải khát ngành y dược, hoá học Ở nước ta mía nguồn nguyên liệu để chế biến đường coi trồng quan trọng cấu trồng vùng đồi, vùng trung du miền núi Trong năm gần ngành sản xuất mía đường gặp nhiều khó khăn việc tìm nguồn giống mía có suất chất lượng cao, nhiều giống bị thoái hoá, suất chất lượng thấp, mức độ dịch hại nhiều, đặc biệt xảy giống chủ yếu nhân giống hom lưu gốc nhiều năm Trong đó, nhà máy chế biến đường thiếu nguồn cung cấp nguyên liệu mía ổn định đảm bảo mặt giá chất lượng Từ thực tế này, vấn đề đặt cần có hệ thống hoàn chỉnh liên tục để nhân giống, lưu trữ, phục tráng giống nhân nhanh giống mới, đảm bảo hiệu quả, an toàn, đáp ứng yêu cầu sản xuất Nuôi cấy mô tế bào in vitro công nghệ đại cho phép sản xuất giống bệnh với quy mô lớn, cung cấp giống với số lượng lớn cho sản xuất thời gian ngắn nhất, giống hệt bố mẹ đặc tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng lớn, thể tính ưu việt so với phương pháp nhân giống truyền thống khác Xuất phát từ vấn đề trên, để tìm hiểu nghiên cứu sâu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt nghiên cứu việc nhân nhanh giống mía cơng nghệ in vitro góp phần cung cấp liệu hồn thiện cơng nghệ nhân nhanh giống mía C95-186 để có nguồn giống tốt, đảm bảo số lượng chất lượng cho người dân, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh giống mía C95-168 cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật in vitro” CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ NCM-TB thực vật in vitro 1.1.1 Cơ sở khoa học công nghệ NCM-TB thực vật in vitro Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung kĩ thuật nhân giống vơ tính in vitro nói riêng dựa vào sở khoa học tính tồn năng, phân hố phản phân hố tế bào [8] 1.1.1.1 Tính tồn tế bào Theo Haberland (1902) mỡi tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh [8] Theo quan điểm sinh học đại mỡi tế bào chun hố chứa lượng thơng tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền thể trưởng thành Vì vậy, điều kiện định tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Đặc tính tế bào gọi tính tồn tế bào [8] Quá trình phát sinh hình thái NCM-TB thực chất kết phân hoá phản phân hoá [13] 1.1.1.2 Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể sinh vật trưởng thành bao gồm nhiều quan có chức khác hình thành từ nhiều loại tế bào Tất tế bào bắt nguồn từ tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu tế bào hợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức riêng biệt Sau đó, tế bào phơi sinh tiếp tục biến đổi thành tế bào chun hố đặc hiệu cho mơ, quan khác Đó phân hố Tuy nhiên, tế bào phân hố thành tế bào có chức chun biệt, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi Trong điều kiện thích hợp chúng trở dạng tế bào phơi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi q trình phản phân hố tế bào[8], [12] Phân hố tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào chun hố [8] Phản phân hố 1.1.2 Mơi trường ni cấy mơ tế bào thực vật Là nhân tố quan trọng định thành cơng q trình ni cấy Hầu hết môi trường dinh dưỡng nhân tạo sử dụng để nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm thành phần sau: + Các nguyên tố muối khoáng - Nguyên tố đa lượng - Nguyên tố vi lượng + Nguồn cacbon hữu +Vitamin + Chất điều tiết sinh trưởng + Nhóm chất tự nhiên + Chất làm đông môi trường (Agar) số chất khác a, Các loại muối khoáng a1 Các nguyên tố đa lượng Các nguyên tố đa lượng bao gồm: Fe, N, P, K, S, Mg, Ca Chúng có chức tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào Nồng độ nguyên tố môi trường 30 ppm (tức 30 mg/l) - Nitơ (N): Tồn dạng NO3- NH4+, chúng sử dụng riêng rẽ phối hợp với tuỳ loại giai đoạn phát triển - Lưu huỳnh (S): Nguyên tố hấp thu tốt dạng SO42- - Photpho (P): Photpho thường đưa vào môi trường nuôi cấy dạng muối phosphat hai loại hợp chất hay dùng NaH 2PO4, KH2PO4, photpho dạng H2PO4- cịn có tác dụng hệ đệm, làm ổn định pH môi trường trình ni cấy - Magiê (Mg): Được cung cấp cho đưới dạng MgSO 4.7H2O, nồng độ 0,5-3 mM - Canxi (Ca): Được cung cấp cho dạng Ca(NO 3)2.4H2O, CaCl2 6H2O, CaCl2.2H2O nồng độ 1- 3,5 mM - Sắt (Fe): Thiếu Fe, tế bào khả phân chia Fe sử dụng tốt dạng phức chất: [FeCl 2.FeCl3.6H2O], FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3 a2 Các nguyên tố vi lượng Các nguyên tố vi lượng bao gồm: Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co nguyên tố sử dụng nồng độ thấp 30 ppm [2] - Mangan (Mn): Thường sử dụng dạng MnSO 4.4H2O Thiếu Mn làm cho trình phân bào bị ức chế - Bo (B): Thường sử dụng dạng H 3BO3 Nếu thiếu B môi trường gây nên biểu thừa auxin Mơ ni cấy có biểu thành mơ sẹo hố mạnh, thường loại mơ xốp, mọng nước, tái sinh - Molypden (Mo): Mo có tác động trực tiếp lên trình trao đổi đạm tế bào thực vật - Đồng (Cu): Được hấp thu dạng CuSO 4, với nồng độ bé 0,04 – 0,08 mM [2] b Nguồn Cacbon (C) Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, cũng sống bán dị dưỡng nhờ vào khả quang hợp điều kiện ánh sáng nhân tạo, yếu không đủ nguồn cacbon hữu cho sinh trưởng phát triển Vì mơi trường nuôi cấy cần bổ sung nguồn cacbon hữu thường dùng saccarosa với liều lượng thích hợp – 3% Trong số trường hợp đặc biệt nuôi cấy bao phấn lúa, nuôi cấy tế bào trần, dùng glucoza, mantoza, galactoza [2], [6] c Các vitamin Vitamin hợp chất hữu tham gia vào cấu trúc enzim cofacto nhiều phản ứng sinh hoá Mặc dù tất loại mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả tự tổng hợp hầu hết vitamin thường không đủ lượng cần phải bổ sung thêm từ bên ngồi vào, vitamin thuộc nhóm B (Vitamin B 1, vitamin B2, vitamin B6, myo inositol, biotin, pantothenic axit) Các vitamin thường pha hỗn hợp dung dich mẹ có nồng độ cao gấp 500 1000 lần dung dịch làm việc [2], [11] Một số vitamin thường dùng môi trường nuôi cấy [11] Tên vitamin Myo-Inositol Nồng độ sử dụng (mg/l) 100 Axit nicotinic (niaxin) 0,5-1 Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0,05-0,5 Thiamine HCl (B1) 10-50 Pandothenat canxi 1-5 Riboflavin (B2) 1-5 Biotin 0,1-1 Axit folic 0,1-1 d Các chất điều tiết sinh trưởng Các chất điều tiết sinh trưởng thành phần thiếu môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, có vai trị định q trình phát triển hình thái Một số chất điều tiết sinh trưởng thường dùng [11] Tên chất sinh trưởng Nồng độ sử dụng (mg/l) 2,4D [dichlorrophennoxy] 0,2-5 α-NAA [naphtylaxetic axit] 0,1-5 β-IAA [indol axetic axit] 0,1-5 IBA [indol butyric axit] 0,1-2 Kinetin [6 finfuryl amino purine] 0,1-2 BA [6-BAP][6benzy amino purine] 0,1-2 2-IP[N6γ-γDimetylally1amino purine] 0,1-2 GA3 [Gibberelic axit] 0,1-2 Các chất thuộc nhóm sau: + Auxin ... ? ?Nhân nhanh giống mía C95- 168 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro? ?? CHƯƠNG I: TỞNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơng nghệ NCM-TB thực vật in vitro 1.1.1 Cơ sở khoa học công nghệ NCM-TB thực vật. .. vật in vitro 1.1.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.3 Kỹ thuật nhân giống in vitro 13 1.2 Tình hình nghiên cứu nhân giống mía cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật in vitro. .. tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ Quá trình gọi q trình phản phân hố tế bào[ 8], [12] Phân hố tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào chuyên hoá [8] Phản phân hoá 1.1.2 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực