Giai đoạn nhân nhanh nhằm mục đích trong thời gian ngắn tạo ra số lượng chồi lớn và đồng đều. Vì vậy đây là giai đoạn quyết định đến hiệu quả của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy in vitro.
Mục đích cần đạt được của giai đoạn này là tạo được hệ số nhân chồi cao, tức là đạt được số lượng cây giống lớn trong thời gian ngắn, cây con có trạng thái sinh trưởng phát triển tốt.
Ở giai đoạn này chúng tôi sử dụng các chồi in vitro mía thu được trong giai đoạn vào mẫu, chuyển sang môi trường nhân nhanh , bổ sung chất điều tiết sinh trưởng BAP (6benzen amino purine) với các nồng độ khác nhau để nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên sự phát triển, sinh trưởng của chồi in vitro.
3.2.1. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến hệ số nhân nhanh và sự sinh trưởng phát triển của chồi mía in vitro giống mía C95-186
Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1:
Bảng 4: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng bật chồi và hệ số nhân nhanh chồi mía in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức Nồng độ BAP (ppm) Số chồi ban đầu (chồi) Số chồi tạo thành (chồi) Hệ số nhân nhanh (lần) CT1(ĐC) 0 40 60 1,5c CT2 1 40 140 3,5a CT3 2 40 106 2,66b CT4 3 40 100 2,5b
BAP có tác dụng kích thích sự phân hoá chồi tạo cụm chồi, ảnh hưởng tốt đến hệ số nhân chồi và chất lượng chồi trên nhiều đối tượng cây trồng.
Để nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên khả năng nhân chồi mía in vitro, chúng tôi tiến hành bổ sung BAP vào môi trường dinh dưỡng cơ bản với nồng độ thay đổi từ 0 - 3 ppm, mỗi công thức gồm 15 bình, mỗi bình cấy 2 – 5 chồi.
Kết quả nghiên cứu bảng 3.1 cho thấy:
Tất cả các công thức thí nghiệm được bổ sung BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn so với công thức đối chứng. Ở các công thức được bổ sung BAP, hệ số nhân chồi đạt từ 2,5 – 3,5 lần trong khi đó ở công thức đối chứng hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,5 lần.
So sánh với các công thức được bổ sung BAP cho thấy: Phần lớn chồi cấy ban đầu đều hình thành chồi mới, nồng độ BAP khác nhau cho hệ số nhân nhanh chồi khác nhau, cụ thể:
- Công thức 2: Với việc bổ sung một lượng 1 ppm BAP vào môi trường dinh dưỡng cho thấy sự thay đổi rõ rệt so với công thức đối chứng. Lượng chồi hình thành là 140 chồi trên tổng số 40 chồi ban đầu. Hệ số nhân nhanh của công thức này là 3,5. Chứng tỏ BAP được bổ sung vào đã đóng vai trò quyết định trong việc hình thành chồi mía in vitro.
- Công thức 3: Khi tăng nồng độ BAP lên 2 ppm, số lượng chồi mía có xu hướng giảm, 106 chồi được hình thành trên tổng số 40 chồi cấy ban đầu và cho hệ số nhân nhanh là 2,66, thấp hơn công thức 2 và công thức đối chứng.
- Công thức 4: Khi tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 3 ppm, hê ̣ số nhân chồi có xu hướng giảm hơn nữa, chỉ đạt 2,5.
Điều này chứng tỏ việc bổ sung nồng độ BAP lên 2-3 ppm là quá cao đã ức chế quá trình hình thành chồi cũng như sự sinh trưởng của chồi mía in vitro.
Như vậy: Ở giai đoạn nhân nhanh, việc bổ sung vào môi trường dinh
dưỡng chất điều tiết sinh trưởng là BAP thì nồng độ 1 ppm là thích hợp
nhất đối với hệ số nhân nhanh của chồi mía.
Bảng 5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hình thái, khả năng sinh trưởng phát triển của chồi mía in vitro (sau 4 tuần nuôi cấy)
Công thức Nồng độ (ppm) Chiều cao chồi (cm) Số
lá/chồi Đặc điểm chồi mía in vitro
1-ĐC 0 3,00 1,91 Chồi hơi yếu, lá màu xanh nha ̣t.
2 1 4,25 3 Chồi cao, khoẻ, thân thẳng bậm, lá
3 2 3,8 2,7
Chồi cao, thân bậm, lá màu xanh đậm.
4 3 3,5 2,00 Chồi cứng, lá nhỏ, hơi xoăn, màu xanh nhạt.
Kết quả đánh giá đặc điểm hình thái chồi mía in vitro (chiều cao, số lá trung bình/chồi) được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy:
Tất cả các công thức đều có sự tăng trưởng về chiều cao và số lá qua các tuần nghiên cứu. Ở tuần thứ 2 và tuần thứ 3, độ tăng trưởng giữa các công thức có sự biến động và dần càng tăng nhanh ở tuần thứ 4, cụ thể:
- Công thức 1 (ĐC): Ở công thức này, hầu hết chồi mía ít hình thành chồi mới, sự phát triển về chiều cao cũng kém. Đường kính chồi nhỏ, lá màu xanh nhạt, phiến lá nhỏ nên ảnh hưởng xấu đến quá trình quang hợp, hấp thu ánh sáng.
- Công thức 2: So với công thức đối chứng thì chiều cao chồi và đường kính chồi mía ở công thức này lớn hơn nhiều. Điều này chứng tỏ, bổ sung BAP vào môi trường dinh dưỡng đã có tác động sinh lý tới hình thái, chất lượng chồi mía rất là rõ rê ̣t. So với công thức 3 và 4 thì ở công thức 2 (1 ppm BAP) cho hình thái chồi tốt nhất. Cây cao,khoẻ, thân bậm, lá xanh. Những chồi in vitro khoẻ, cứng cáp phù hợp cho giai đoạn nghiên cứu tiếp theo.
- Công thức 3: Khi tăng nồng độ BAP lên, sự sinh trưởng phát triển của chồi mía không tốt hơn, đường kính của chồi mía khá lớn, lá màu xanh đậm, chiều cao chồi khoảng 3,8 cm, tăng nhanh từ tuần thứ 3 cho tới tuần thứ 4.
- Công thức 4: Chồi mía có đường kính thân nhỏ và cứng, lá có màu xanh nha ̣t hơn, hơi xoăn, các chồi phát triển không đồng đều. Về chiều cao của chồi mía sau 4 tuần nhân nhanh là 3,5 cm.
Nhận xét chung: Qua nghiên cứu về khả năng bật chồi, hệ số nhân nhanh chồi cũng như khả năng sinh trưởng phát triển của cây mía in vitro khi bổ sung BAP vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn nhân nhanh chúng tôi thấy: Môi trường nhân nhanh tốt nhất cho chồi mía in vitro giống C95-186 là:
CT 1: 0 ppm BAP CT 2: 1 ppm BAP
CT 3: 2 ppm BAP CT 4: 3 ppm BAP
Một số hình ảnh của chồi mía in vitro sau 3 tuần nhân nhanh
3.2.2. So sánh kết quả nghiên cứu với một nghiên cứu khác.
Bảng 6: So sánh thời gian xử lí đến hiệu quả khử trùng của HgCl2 0,1% đối với vật liệu khởi đầu là đỉnh sinh trưởng
Giống mía Thời gian xử lý HgCl2 0,1% Số mẫu nhiễm (%) Số mẫu chết (%) Số mẫu bật chồi (%) C95-186 5 phút 20% 13,33% 66,67% VN84-4137 10 phút 16,67% 12,50% 70,83%
Bảng 7: So sánh hiệu quả nhân nhanh của các chất điều tiết sinh trưởng khác nhau lên chồi mía in vitro
Công thức nhân nhanh đã bổ sung
chất ĐTST Giống mía Hệ số nhân nhanh (lần) MS + 8 g/l Agar + 20 g/l saccaroza + 5 ppm KI + 10% nước dừa VN84-4137 4,0 MS + 9 g/l Agar + 30 g/l saccaroza +
1 ppm BAP + 15% nước dừa C95-186 3,5
Bảng trên trình bày sự so sánh kết quả của chúng tôi với công trình nghiên cứu của Lê Phi Long, K47 K2 Nông học. Kết quả cho thấy:
Cùng chất khử trùng là HgCl2 0,1% và cùng vật liệu khởi đầu là đỉnh sinh trưởng thì thời gian xử lí thích hợp nhất của đề tài là 5 phút trong khi đó nghiên cứu trên có thời gian xử lí thích hợp là 10 phút. Mặc dù hiệu quả bật chồi của mẫu là xấp xỉ nhau
Trong giai đoạn nhân nhanh, với chất điều tiết sinh trưởng khác nhau cho hiệu quả nhân nhanh khác nhau rõ rệt. Với chất điều tiết sinh trưởng là KI cho hệ số nhân nhanh lên đến 4 lần, trong khi đó kết quả đối với chất điều tiết sinh trưởng là BAP cho hệ số nhân nhanh tối đa là 3,5 lần.
Như vậy: Trong nhân giống vô tính in vitro, với các đối tượng nghiên
cứu khác nhau thì yêu cầu kĩ thuật không giống nhau. Chính vì vậy, quy trình kĩ thuật của đối tượng này không thể áp dụng cho đối tượng khác. Mặt khác, khi xây dựng quy trình công nghệ nhân giống một giống mới cần thử nghiệm nhiều công thức, nhiều loại hoá chất khác nhau để đưa ra công thức tối ưu nhất. Điều cần thiết là phải xây dựng quy trình nhân giống cho từng đối tượng, nhất là đối với các giống mới.
Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi đề xuất công thức nhân giống in vitro giống mía C95-186 ở giai đoạn vào mẫu và nhân nhanh như sau:
Quy trình Điều kiện nuôi cấy
Các đỉnh sinh trưởng
Giai đoạn vào mẫu, cấy gây
Mẫu in vitro
Giai đoạn nhân nhanh
Chồi in vitro
Giai đoạn ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
Cây in vitro hoàn chỉnh
Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Cây in vitro
Vườn ươm
Một số hình ảnh về giai đoạn vào mẫu Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút
Công thức khử trùng HgCl2 0,1% trong 5 phút Thời gian cấy gây là 4 tuần
Môi trường nhân nhanh MS + 9g/l Agar + 30g/l saccaroza
+ 15% nước dừa + 1 ppm BAP Thời gian nhân nhanh là 5 - 6 tuần
Sau 10 ngày nuôi cấy Sau 2 tuần nuôi cấy
Sau 3 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy
Một số hình ảnh giai đoạn nhân nhanh Bổ sung 1ppm BAP chất điều tiết sinh trưởng
Sau 2 tuần nhân nhanh Sau 3 tuần nhân nhanh
Sau 4 tuần nhân nhanh
Sau 5-6 tuần nhân nhanh
3.3. Mô ̣t số lưu ý trong quá trình nhân giống mía bằng kỹ thuâ ̣t nuôi cấymô in vitro mô in vitro
3.3.1. Giai đoạn vào mẫu
Nhiễm vi khuẩn, nấm mốc là khó khăn thường gặp trong nhân giống in vitro. Các môi trường nuôi cấy trong giai đoạn này đều yêu cầu phải vô trùng, nếu có sơ suất trong kỹ thuật hoặc do điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ẩm độ phòng) không đảm bảo, có thể làm cho các bào tử nấm mốc rơi vào bình nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng trong bình sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển nhanh chóng, ảnh hưởng xấu đến môi trường nuôi cấy.
Kết quả của giai đoạn vào mẫu phụ thuộc vào thời điểm lấy mẫu và chất lươ ̣ng mẫu mía. Các cây mía dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu của đề tài phải được lấy mẫu trong điều kiê ̣n khô ráo, cách 5 – 7 ngày không mưa để ha ̣n chế sự nhiễm nấm và vi khuẩn. Các mẫu mía dùng cho nghiên cứu phải khoẻ ma ̣nh, sa ̣ch bê ̣nh và đúng giống.
Phải khử trùng các du ̣ng cu ̣, tủ cấy bằng các hoá chất và cồn thâ ̣t chu đáo trước khi vào mẫu để ha ̣n chế sự lây nhiễm của nấm và vi khuẩn.
Thao tác trong lúc vào mẫu phải nhanh go ̣n, dứt khoát, không cho người qua la ̣i phòng cấy trong lúc vào mẫu hay xử lí mẫu.
Đối với mẫu mía tiết ra nhiều phenol làm đen môi trường trong quá trình nuôi cấy mẫu chúng ta cần chú ý tách mẫu ki ̣p thời, loa ̣i bỏ cắt đi các phần hoá nâu và đem chuyển sang môi trường mới để giúp cho mẫu tái sinh và hút dinh dưỡng tốt hơn.
3.3.2. Giai đoạn nhân nhanh
Cần lưu ý đến viê ̣c tách chồi: Đối với chồi mía thì cần tách và cấy cu ̣m chồi từ 2 – 5 chồi thì sẽ cho hê ̣ số nhân cao, đồng thời chồi phát triển khoẻ hơn rất nhiều so với khi chúng ta tách chồi đơn lẻ.
Loa ̣i bỏ các phần đen và các lá bi ̣ vàng trong quá trình nhân nhanh để giúp cho các chồi mía có khả năng hấp thu ̣ chất dinh dưỡng tốt hơn.
Thao tác nhanh go ̣n khi cấy chồi, cấy chồi ở đô ̣ sâu vừa phải để tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của chồi giúp chồi phát triển tốt hơn. Không cấy quá sâu làm cho mầm chồi khó đâm lên.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI ̣ A. Kết luận
Từ những kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi có một số kết luận sau:
1. Giai đoạn vào mẫu
Đối với giống mía C95-186, giai đoạn tạo nguồn vật liệu ban đầu khử trùng đỉnh sinh trưởng bằng dung dịch khử trùng HgCl2 0,1% trong khoảng thời gian 5 phút sau khi xử lý sơ bộ đỉnh sinh trưởng bằng etanol 700 trong 30 giây là thích hợp nhất.
Môi trường cấy gây là: MS + 10 g/l agar + 20 g/l saccaroza + 2 mg/l BAP.
Thời gian vào mẫu là 4 tuần.
2. Giai đoạn nhân nhanh
Môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh giống mía C95-186 với chất điều tiết sinh trưởng là BAP:
MS + 9 g/l agar +30 g/l scaccaroza + 15% nước dừa + 1 ppm BAP Thời gian nhân nhanh là 6 tuần.
B. Đề nghị
Vì thời gian nghiên cứu có hạn, nên chúng tôi có một số đề nghị sau: 1. Tiếp tục nghiên cứu các giai đoạn ra rễ tạo cây hoàn chỉnh và huấn luyện thích nghi trên giống mía C95-186 để hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro.
2. Trong giai đoạn vào mẫu cần tiến hành thử nghiệm các loại chất khử trùng khác nhau với thời gian khử trùng khác nhau để cho hiệu quả vào mẫu tốt nhất.
3. Trong giai đoạn nhân nhanh cần thử nghiệm nhiều loại hoá chất điều tiết sinh trưởng hoặc tổ hợp nhiều chất điều tiết sinh trưởng để rút ra công thức nhân nhanh hiệu quả nhất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Văn Bình, Vũ Đình Chính, Nguyễn Thế Côn, Lê Song Dự, Đoàn Thi ̣ Thanh Nhàn, Bùi Xuân Sửu (1996), Giáo trình cây công nghiê ̣p, NXB.Nông nghiê ̣p, Hà Nô ̣i.33
2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), CNSH thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB. Nông nghiệp Hà Nội.
3. Đă ̣ng Văn Đông, Đinh Thế Lô ̣c (2003), Công nghê ̣ mới trồng hoa cho thu nhập cao bằng hoa cúc, NXB. Lao đô ̣ng xã hô ̣i, Hà Nô ̣i.
4. Thân Thi ̣ Thu Ha ̣nh, Lưu Thi ̣ Duyên (2003), Nghiên cứu kĩ thuâ ̣t nhân nhanh giống mía VN84-422 và VN85-1427 bằng phương pháp in vitro, “Tuyển tập kết quả nghiên cứu khoa học 1997 – 2007 ”, Viê ̣n nghiên cứu mía đường Bến Cát, trang 84-87.
5. Nguyễn Văn Hiển (2000), Chọn giống cây trồng, NXB. Giáo du ̣c.
6. Nguyễn Hoàng Lô ̣c – Lê Viê ̣t Dũng, Nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Viê ̣n Tài Nguyên Môi Trường và Công nghê ̣ Sinh Ho ̣c, Đa ̣i ho ̣c Huế.
7. Trương Văn Lung và cs (2005), Giáo trình CNSH trong sản xuất và đời sống, Đa ̣i ho ̣c Khoa Ho ̣c – Đa ̣i ho ̣c Huế.
8. Vũ Quang Sáng, Nguyễn Thi ̣ Nhẫn, Mai Thi ̣ Tân, Nguyễn Thi ̣ Kim Thanh (2007), Sinh lí thực vật ứng dụng, NXB. Nông Nghiê ̣p.
9. Trần Văn Sỏi (2003), Giáo trình cây mía, NXB. Nghê ̣ An.
10. Chi Thị Tứ, Mai Văn Quắc, Hồ Hữu Nhị (1994), Nghiên cứu sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào để nhân nhanh một số giống mía ở Việt Nam, “Kết
quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994”, NXB. Nông Nghiệp.
11. Nguyễn Văn Uyển và cs (2000), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác
giống cây trồng, Trung tâm CNSH.
12. Đỗ Năng Vi ̣nh (2002), CNSH cây trồng, NXB. Nông nghiê ̣p Hà Nô ̣i. 13. Vũ Văn Vu ̣ (2003), Sinh lí học thực vật, NXB.Giáo du ̣c Hà Nô ̣i.
14. Vũ Văn Vu ̣, Nguyễn Mô ̣ng Hùng, Lê Hồng Diê ̣p (2005), Công nghê ̣ sinh học, tâ ̣p 2, NXB. Giáo du ̣c Hà Nô ̣i.
15. Albert Sasson (1998), Công nghệ sinh học và phát triển (tài liệu dịch), UNESCO.
16. Lê Phi Long (2011), Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía
VN84-4137 bằng công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật in vitro, Đại học
Vinh.
.17.http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=334
18.http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1508 19.http://rnd.vista.gov.vn:9000/kqnc/search.asp