SO KHOA HOC CONG NGHE VA mi TRUONG TINH TRA VINH BAO CAO TONG KET DU AN UNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI cẤY MÔ TẾ BAO THUC VATVAO VIỆC CHỌN LỤC VÀ NHÂN GIỐNG CÂY TRÔNG Ủ TỈNH TRÀ VINH Chủ nhiệm án | fa tt Ấy 06x ayôe | I.MỎ ĐẦU : 1- Tổng quan nhân giống vơ tính ni mơ tế bào thực vật: Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù sử dụng chung cho tất loại đinh nuôi cấy nguyên liệu thực vật, hoàn toàn vi.sinh vật môi trường đưỡng nhân tao điều kiện vô trùng Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống ¡n vitro kỹ thuật Bằng kỹ thuật này, mơi trường nhân tạo, từ mô quan thực vật ban đầu tái sinh thành hồn chỉnh thời gian ngắn tạo lượng trồng lớn có cấu trúc di truyền đặc điểm sinh học giống hệt nhan 1.1- Cơ sở lý luận phương pháp nhân giống vo tinh in vitro: Cơ sở lý luận phương pháp nhân giống ni in viro tính tồn sinh : năng(toptipotence) tế bào Mỗi tế bào thực vật có khả tái “thành hồn chỉnh cung cấp điều kiện cần thiết Cho đến nay, người hồn tồn chứng luận điểm nêu Haberlaudt (1982) nêu Hàng trăm loại trồng nhân quy mô thương mại cách tái nuôi dưỡng phận thích hợp mơi trường đinh đưỡng vơ trùng sinh ching cay (Murashige, 1980) Quá trình phát sinh phân hố phản phân bào phơi thành tế bào nhiên, tế bào chuyên hình thái nui cay in vitro thue chat 18 kết hoá tế bào Sự phân hoá tế bào chuyển tế mơ chun hố, nhận chức khác Tuy hố khơng mất,đi khả phân chia điều „kiện thích hợp chúng lại trở dạng phôi sinh lại phân chia mạnh mẽ °, Quá trình gọi phản phân hoá ngược lại với phân hoá Các trình biểu diễn theo sơ đồ sau: — ° Phân hố tế bào Y Tế bào phơi sinh % F |«&—| Tế bào giảm phân Tế bào chun hố Phản phân hố Trang | Trong ni in vitro, tính tồn tế bào thể qua q , trình phản phân hố, phân hố tế bào tái sinh hồn chỉnh từ mơ ni cấy Q trình chủ yếu điều khiển hàm lượng tỷ lệ chất điều khiển sinh trưởng thực vật nhóm Auxin, Xytokinin: + Auxin có tác đụng mơi trường ni cấy kích thích hình thành rễ bất định mơ ni cấy Đồng thời kích thích giãn nở rế bào, lam tế bào phình to dẫn đến tăng kích thước quan đưa vào nuôi cấy + Xytokinin ứng dụng chủ yếu nuôi cấy mô, tế bào thực vật Các chat Xytokinin tổng hợp Benzyladenin (BA), Kenitin Xytokinin tự nhiên nước đừa ứng dụng rộng rãi nuôi cấy mơ Việc có mặt chúng mơi trường định phâh chia hố chổi mơ ni cấy, trình nhân nhanh in vitro mô nuôi cấy tái sinh nhiều chồi „Muốn vậy, phải ni cấy mơi trường có tý lệ Xytokinin định + Các đường tái sinh hồn chỉnh nudi cay in vitro: Cây tái sinh từ tổ chức chứa sẵn mô phân sinh (phôi, điểm sinh trưởng, chổi, chổi nách) từ mơ có khả nang hình thành điểm sinh trưởng phụ, có hai phương pháp tái sinh ~ Tái sinh trực tiếp từ lát cắt điểm sinh trưởng ~ Tái sinh gián tiếp sau phản phân hố thành mơ seo(Reinert,1977) Có nhiều phương pháp nhân giống vơ tính (Donal propagation) „sử dụng nuôi cấy loại ăn quả, hoa Về phương điện giá trị kinh tế, ”, phẩm chất kỹ thuật tái sinh trực tiếp từ điểm sinh trưởng có sẵn kỹ thuật quan tâm Nhiều tác giả khẳng định rằng, đường an toàn để thu đồng mặt di truyền trì tính trạng mẹ (Hu and Wang, 1983) Người ta chứng minh rằng, có tế bào lưỡng bội giữ vai trị quan trọng q trình phân hố, tái sinh có tế bào mơ phân sinh chứa trì số nhiễm sắc thể đặc trưng loại Sau lần phan chia (D'Amato,1975) Cay thu từ kết phâh chia (phân hoá) tế bào phân sinh Do bảo tổn đặc tính ‘ me %` : Mặt khác cần thiết phải tạo số lượng giống lớn thời giàn ngắn, kỹ thuật phôi hoi tế bao soma(somatic embryo gacnesis) hướng có Dự ấn cấy mỏ xu cho kết cao Tir Lgr m6 seo cé thé tạo khối lượng khổng lồ phôi soma (Sluis and Walkel, 1985) chế hạt giống nhân tạo (Redenbogh ˆ etal,1986) Ngồi ra, hai hướng khác thu với hệ số lớn nuôi cấy bao phấn, hạt phấn (androgesneis) nuôi cấy tế bào tran (protoplast) Điểm chung kỹ thuật tế bào thường trãi qua giai đoạn phát triển mơ sẹo Chính giai đoạn dù môi trường đặc rnôi trường lỏng dé xuất tế bào đột biến, mang số nhiễm sắc thể không giống tế bào ban đầu, số lần cấy chuyền tăng lên (DAmato,1971) Đây nguyên nhân dẫn đến tình trạng tái sinh từ mô nuôi cấy khác khác mẹ mặt truyền Vì cần ý lựa chọn hướng để nhân giống với đối tượng cụ thể ta cần W 1.2- Ngun tác, kỹ thuật chung nhân giống vơ tính in viro : Theo quan điểm nay, quy trình nhân giống vơ tính in vitro chia thành giai đoạn nối tiếp sau: «Ẳ Giai đoạn ( giai đoạn chuẩn bị): Là giai đoạn khữ trùng mẫu đem nuôi cấy, tạo nguồn mẫu ban đầu đưa vào nuôi cấy in vitro Việc xử lý mẫu vật điều kiện tiệt trùng lầm mẫu vật trở nên hồn tồn vơ trùng Hố chất dùng để khử trùng HgCl1; 0,1%, NaOClL, Ca(OCD„.v.v , Với nhiệt đới cận nhiệt đới, nhiệt độ bing 25°C va 4m 46 75% „7 điều kiện giữ mẫu thích hợp, cho hiệu cao nuôi cấy, tỷ lệ nhiễm bệnh ˆ thấp (Debergh Zimmerman,1991) © Mục đích giai đoạn tát sinh mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy thường y sử dụng thí nghiệm chồi đỉnh (shoottip) chổi nách (axillar shogt) mẹ Ngoài ra, tuỳ đối tượng ni cấy, người ta cịn sử dụng mẫu nuôi cấy mẫu lá, đài hoa, cánh hoa, mẫu rễ ,v.V Đối với việc chọn mẫu chổi đỉnh chổi nách cần + ý tiêu về> tuổia ot ¬ as VẤN sihh lý nhẫu Theo Anoleron- I980 mẫu thời kỳ sinh trưởng mạnh mùa sinh trưởng cho kết qua kha quan tái sinh chổi Các mô lấy từ Dự án cấy mỏ Tran wa va * Giai đoạn ( tái sinh mẫu ni cấy); có khả tái sinh chồi cao mô từ trưởng thành (Bhatt,1979), Để, tái sinh mẫu người ta sử dụng tỷ lệ Auxin/Xytokinin khác đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm điều khiển tái sinh cách định hướng mô ni cấy ®- Giải đoạn ( nhân nhanh chổi); Tồn q trình vi nhân giống, xét cho nhằm mục đích tạo hệ số nhân chổi cao Chính vậy, giai đoạn coi giai đoạn q trình giai đoạn này, môi trường dinh dudng nhan tạo để nuôi cấy thường đưa thêm vào chất điểu hoà sinh trưởng (auxin, xytokinin, giberillin, ) chất bổ sung khác nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thuỷ phân casein, kết _ hợp với yếu tố nhiệt độ, ánh sáng nhằm đạt hệ số nhân cao mà ` đảm bảo sức sống chất di truyền Tuy nhiên, tùy đối tượng “ni cấy, người ta kích thích hình thành cụm chổi, nhân cụm chổi hảy kích thích phát triển chổi nách vị giâm cành thông qua việc tao từ phơi vơ tính ‡ ©- Giai đoạn ( hình thành rõ), Sau giai đoạn ni cấy trên, đạt đến kích thước định, chổi chuyển từ môi trường giai đoạn vào môi trường rễ Thường sau 2-3 mần, từ chổi riêng lẻ xuất rễ (Bhojwani,1980; Bhojwa ni et al,1982:) Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào mơi trường auxin anxin nhóm hormon thực Vật quan trọng có chức tạo rễ phụ (Pierik ,1987) Trong nhóm chat: IAA, IBA, NAA, 2,4D sử dụng nghiên cứu “nhiều để tạo rễ cho chổi in vitro, Môi trường có bổ sung NAA, IBA, IAA với ham luong ti 0,1-] mg/l rat thích hợp cho việc tao rễ hầu hết loại trồng * Tuy vậy, số loại chuối ngái hình thành rễ tốt đạt môi trường khơng có chất điều hồ sinh trưởng (Bhofwani Razdan, 1983) k bướ lạ Giai doan (dua edy in vitro dat): Giải đoạn đưa hồn chỉnh (có đủ rễ, thân, lá) từ ống nghiệm cuối quy trình vi nhân giống đất Cây lấy từ ống nghiệm phải rửa agar bám bể mặt rễ để tránh xarfi nhập côn trùng nấm mốc Theo Bhofwani va Razdan (1983), quy tinh sé cong hon néu từ 10-15 ngày trước đưa đất, ta ươm cất cố độ ẩm 90% hình thành Sau Trong khoảng thời gian này, rễ sinh bắt đầu chuyển đất với chế độ chăm sóc bình thường 1.3- Ứng dụng nuôi in vitro công tác chọn giống trong: lĩnh vực khác Nuôi mô, tế bào thực vật phục vụ nhiều ứng dụng để: Trong công tác giống trồng, nuôi cấy in vitro giống + Lầm phong phú vật liệu truyền cho cơng tác chọn nghĩa khoa học, có giá trị + Nhân nhanh trì giống, cá thể có ý kinh tế cao bệnh + Lầm virus phục trắng giống bị thối hố "Trong ứng dụng tâm nhân nhanh vơ tính trồng lĩnh vực quan pháp nhân giống hữu hiệu Bơn Kỹ thuật nhân giống in vitro biện thuật cho phép tạo quần phương pháp nhân giống vơ tính, kỹ mẹ có hệ số nhân cao, sớm thể đồng đều, giữ nguyên đặc tính tích cho nhân giống, dé chăm sóc, phát huy hiệu kinh tế, không tốn diện pháp đặc biệt tỏ ưa việt dễ dàng khắc phục điều kiện bất lợi Phương tính, giống q có với loại khó nhân giống đường hữu số lượng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh giống qua phương pháp Theo Murashige (1974) có 300 loại nhân lợi chổ: tạo quần thể nuôiycấy mô tế bào Phương pháp cịn có bệnh, dùng phương pháp trồng đồng với số lượng lớn, khoẻ mạnh điệt vong, trao đối nguồn để phục trắng quần thể có nguy bị dạng invitro (Murashige T, gen quý với quốc tế bảo quản nguồn gen Marell R, Noreranch 1974) pháp nuôi cấy mô thực vật Khả ứng dụng để thấy phương meristem số loại địa lan phục tráng giống trồng theo Morel (1960) đồng thời ơng thành cơng (Cymbiđium) cỗ khơng có virus, cấy meristim Các protocom cất nuôi kỹ thuật tạo protocom nuôi cấy định hình thành địa lan tạo protocorrf mới, Ở điều kiện nuôi cấy Kỹ thuật đặc biệt có giá trị quan trọng daf 1a cde cay virus hồn tồn tính khác, Đốt trồng nhân giống vô khoai tây, ăn nhiều loại nguyên hiểm nghèo bệnh virus với khoai tây bệnh Trang Martin ˆ nhân gây nên tượng thối hoá giống Năm 1955, Morell mang lại ý dùng kỹ thuật nuôi cấy meristem tạo giống khoai tây virus, nghĩa lớn cho ngành sản xuất khoai tây giới Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật nhân giống Nozeran nâng nho khoai tên mức ông nhận thấy trẻ hoá chổi nách ứng dụng tây, đem nuôi cấy cấy chuyển nhiều lần ống nghiệm Việc quy mô thương nuôi cấy mô nhân giống quy mô lớn thực cọ dầu, mía, mại với hàng loạt trồng có ý nghĩa kinh tế cao chuối, cà phê, giới hoa lan, có đóng góp to lớn cho nông nghiệp Trong lĩnh vực sản xuất hoa, cảy cảnh, kỹ thuật nuôi cấy in viro ) ngày công nghệ sinh học khác : (cấy chuyển gen, biến di soma, cảnh với số lương đóng góp vào thị trường hoa giới loại hoa ty USD thương mại hoá Năm 1985 kim ngạch thị trường ước tính 20-25 hoa cảnh Hà Lan kỹ thuật vi nhân giống trở thành nén tang cho công nghệ cấy in vitro Năm 1987, Thái Lan có 20 cơng ty tư nhân dùng kỹ thuật ni xuất hoa cẩm ¡ quy mô thương mại để sản xuất hoa cất Colombia nước sản Ở Maroc, chướng lớn giới nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy in vitrro trồng hoa (Albert nhân giống in vitro đóng góp tích cực cho phát triển nghề Sasson, 1992) nhân Tón lai, nudi c&y invitro da duge dua vao chuong trình chọn giống dựng nên hệ thống giống đại Bằng phương pháp này, người xây toàn virus như: : sản xuất giống gốc cho nhiều nhân giống vơ tính hồn khoai tây, nho, chuối đứa, mía, hoa lan, huệ số loại khác, 2- Ứng dụng công nghệ ” ni cấy mị tế bào thực vật Việt Nam nước Ở Việt nam, từ năm 1975 nhiều phịng ni cấy mơ viện sinh học nhiệt đới thành lập thu nhiều thành đáng kể Tại in viro SỐ ;Viện Khoa học Việt Nam hịan thiện qui trình nhân giống dứa, trồng có khả chống chịu như: Lúa, thuốc lá, khoai lang, công Nguyễn Thị Quỳnh Nguyễn Văn Uyển (1987) nghiên cứu thành pháp giâm cành kỹ thuật nhân giống cà phê phương pháp: phương va 0,01 ppm IBA ' môi trường MS (Murashige- Skoog,1982) có bổ sung Sppm BA MŠ + 10 ppm phương pháp tạo phơi vơ tính (Somalic embryos) môi trường +40 ppm Adenin + 0.1 ppmIBA “ Trang Từ năm 1980-1982 vấn để khấc phục tượng thoái hoá giống khoai tây nghiên cứu (Nguyễn Quang Thạch) để nghị mô hình sản xuất khoai tây bệnh cho vùng đồng Bắc (Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh cộng sự, 1990) Năm 1993, Mai Xuân Lương cộng thăm đị qui trình nhân giống hoa loa kèn trắng (hoa huệ tây-E¿1ium longiflorwm) môi trường đa lượng với mức dinh dưỡng khác MS: White, B5, KnutsonC, chí mơi trường Knop, tốt môi trường MS Trường Đại Học Nông nghiệp T tiến hành nghiên cứu nhiều đối tượng khác nuôi cấy mô thành công thuốc lá, cẩm chướng, lan chuối, mía, Ở tỉnh phía Nam xây dựng ngân hàng giống cà phê với 10 dịng khác nhau, hồn thiện quy trình nhân giống cao su Ngồi phịng ni cấy mơ khác nghiên cứu thành cơng hồn thiện quy trình nhân giống hoa, ăn quả, thuốc, rừng loại quý khác có giá trị kinh tế cao 3- Nhu cầu cần thiết áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Trà Vinh Trà Vinh tỉnh thuộc khu vực Đồng Bằng Sơng Cửu Long, chun sản xuất nơng nghiệp, mạnh sản xuất đa đạng, đồng thời hệ sinh thái đặc thù vùng đồng ven biển với nhiều giống thực vật có giá trị như: quách, đừa đặc ruột, chà là, chanh, cam, chuốt, mía, đứa, loại khoai củ, loại hoa rừng vww Với nguồn gen phong phú cần phải lưu trữ, bảo vệ; đồng thời có nhu cầu lớn giống trồng phục vụ cho sản xuất tiêu dùng Tuy nhiên chưa đầu tư thiết bị công nghệ nên từ trước đến phương pháp nhân giống chủ yếu nhân giống phương pháp cổ truyền nên hệ số nhân không cao, chất lượng giống không đảm bảo, thêm vào phải phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, khí hậu, Vì vậy, việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc nhân giống, lưu giữ bảo tổn nguồn gen loại quý tỉnh đồi hỏi cấp thiết Để giải vấn để UBND tinh Trà Vinh giao nhiệm vu cho So KhoatHọc Công Nghệ Môi Trường xây dựng chủ trì Dự án " Ứng dung Cơng nghệ ni mô tế bào thực vật vào việc chọn lọc nhân giống trồng otinl Tra Vinh" mo Trang II TOM TAT NOI DUNG CHÍNH CUA DUAN 1- Tên dự án : Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn lọc nhân giống trồng tỉnh Trà Vinh 2- Mục tiêu dự án : Đầu tư xây dựng sở nuôi cấy mô tế bào thực vật, sở tiếp thu cơng nghệ để ứng dụng vào việc lưu giữ, bảo tổn phát triển nguồn gen quý địa phương; tổ chức sản xuất thử nghiệm số giống trồng có giá trị phục vụ u cầu cơng nghiệp hóa, đại hóa nơng thơn tinh Dự án tập trung vào số giống trồng sau : % - Cay an qua : Chanh ( cam, chuối ) - Cay cong nghiép : mia ( dita ) - M6ts6 cay hoa canh quy : Lan ( Huệ ) 3- Nội dung dự án : 1- Thiết kế, xây đựng phịng ni cấy mơ thực vật đạt tiêu chuẩn kỹ thuật 2- Đầu tư mua sắm, lắp đặt trang thiết bị cách đồng bộ, bao gồm: -_ Hệ thống điện, nước thiết bị phụ trợ - Thiết bị, dụng cụ cần thiết cho phịng ni cấy mơ -_ Hóa chất, ngun liệu đủ cho nhu cầu nuôi cấy 3- Đào tạo, tập huấn cán đủ trình độ tay nghề thực hành theo mục tiêu để 4- Tiến hành ni cấy nhằm nhân nhanh số trồng có nhu cầu giá trị kinh tế địa phương II KẾT QUÁ THỰC HIỆN DỰ ÁN +1 Kết khoa học công nghệ đạt 34 DA thiết kế, xây dựng phịng ni cấy mơ tế bào với đầy đủ trang thiét bi đạt tiêu chuẩn kỹ thuật, đảm bảo cho việc tiếp nhận công nghệ sản xuất thử nghiệm loại giống trồng phịng thí nghiệm Du án cấy mo Trang a Hệ thống phịng thí nghiệm: thống, đầy + Phòng rửa, chuẩn bị dụng cụ: Diện tich 20 m’,-sach thơng đủ điện nước + Phịng pha chế mơi trường: Diện tích 20 mỶ, đầy đủ điện nước nhiệt độ 25C, + Phịng cấy vơ trùng: Diện tích 20 m? dim bảo vô trùng đủ ánh sáng gian chiếu sáng + Phịng ni cấy lưu trữ: Diện tích 40 m*, đảm bảo thời 12 giờ/ngày, ánh sáng 1500lux nhiệt độ 25°C b Vườn wom: *% 70%, chắn gió, + Nhà ươm cấp I: Diện tích 200 m°, đảm bảo độ che sáng thơng thống, giữ ẩm, tránh cơng trùng + Nhà ươm cấp II: Diện tích 200 mỶ, đạng nhà lưới đơn giản c Thiết bị, nguyên vật liệu phụ trợ kỹ thuật, + Mua sắm, lắp đặt trang thiết bị đồng đảm bảo tiêu chuẩn bao gồm: + Hệ thống điện nước thiết bị phụ trợ + Thiết bị dụng cụ cần thiết cho phịng ni cấy mơ -._ + Hoá chất, nguyên liệu đủ cho nhu cầu nuôi cấy d Đào tạo tiếp nhận công nghệ tiếp nhận công + Cữ cán đến Trường Đại học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh nghệ chuyên gia đến tư vấn triển khai dự án tỉnh công nghệ + Đã đào tạo 04 cán tiếp nhận tồn cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật 02 công nhân phịng thí nghiệm & : cơng nghệ - + Ngồi cịn phối hợp với số quan khoa học AT , nước! để triển khai dự án + Quy trình cơng nghệ ni cấy mô tế bào thực vật Sau tiếp nhận công nghệ cán trung tâm ứng dụng trồng, phòng ‹_KHKT tiến hành nhân thử nghiệm loại giống thí nghiệm tỉnh đưa quy trình cơng nghệ nhân loại sau: Lan, Huệ, Dưa, Mía, Chuối, cam, Chanh a Quy trình nhân giống chanh; Cay chanh (Citrus limonia Osbesk) sản phẩm cần thiết bữa ăn, gần gũi với đời sống hàng ngày: làm nước giải khát, rượu, gia vị dân thuốc chữa bệnh, nhờ trồng chanh chanh trát vụ nhiều gia đình nơng cho thu nhập cao Tuy nhiên, để mở rộng diện tích trồng chanh phổ biến đặt việc cung cấp giống đầu dòng bệnh ổn định di truyền vấn đề như: giâm Song người đân nhân giống phương pháp cổ truyền khó cành, chiết cành, gieo hạt Với phương pháp lại gặp nhiều tính mẹ, khăn như: gieo hạt có số lượng lớn khơng giữ đặc Vì vậy, để giải chiết cành khơng có số lượng nhiều ảnh hưởng đến mẹ, thực vật để nhân vấn để giống việc áp dụng ni cấy mơ tế bào giống chanh việc làm thiết thực - Vật liệu khởi đầu: Đối tượng đưa vào lấy mẫu nuôi cấy cành bánh te - Xử lý mẫu: Mẫu đưa vào, cất lá, rửa nước xà phịng sau đó, khử trùng đưa HgCls 0,1% thời gian 10 phút rửa nước cất (3-5) lần, vơ trùng mẫu vào phịng cấy, thao tác thực điều kiện (Box Laminer) ` - Nuôi cấy: ' Mẫu tiếp khử trùng xong, dùng dụng cụ vô trùng cắt bo phần mơ đoạn có xúc với hố chất khử trùng, cất đoạn cảnh mang chổi nách thành tái sinh chổi va dat chiều dai 0,6 - em sau cấy vào ống nghiệm có mơi trường 25°C Sau vào phịng ni điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày 1500lux, nhiét nhân môi tuần theo dối chổi tái sinh nhú lên, ta lại tách chổi chồi trường,MS + 0,IppmBAP, có chổi ta tiến hành tạo hoàn chỉnh Mang cấy chuyờn sang mụi trng r MĐ +0,5 ppmôNAA sau tuần rễ, chuyển vườn ươm tưới chăm sóc tuần ta có giống w ` ¬ * b.Qu} trìmh nhân giống Cây cam Dự ấn cấy mơ Trang 10 ăn tươi cịn Cay cam (Citrus sinensis (L)) Quả cam việc dùng để dùng để dùng để đóng hộp, làm nước hoa qua Vỏ cam, hoa tương chiết xuất tỉnh dầu, dùng để chữa bệnh quy trình nhân giống cam tự chanh - Vật liệu khởi đầu: Đối tượng đưa vào lấy mẫu nuôi cấy cành bánh tẻ - Xử lý mẫu: khử Mẫu dưa vào, cắt léo lá, rửa nước xà phịng sau đó, nước cất (3-5) lần, trùng HgŒ1› 0,1% thời gia 10 phút rửa điều kiện vô đưa mẫu vào phòng cấy, thao tác thực trùng (Box Laminer) ì ; - Ni cấy: tiếp Mẫu khử trùng xong, đùng dụng cụ vô trùng cắt bỏ phần mơ đoạn có xúc với hoá chất khử trùng, cắt đoạn cành (mang mắt ngủ) thành chồi đặt chiều đài 0,6 - cm sau cấy vào ống nghiệm có mơi trường tái sinh Sau vào phịng ni điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, 1500lux, nhiệt độ 25°C môi trường tuần theo dõi chổi tái sinh bật lên, ta lại tách chồi nhân chổi cấy MS + 0,7ppmBAP, có chổi ta tiến bành tạo hồn Mang chuyển chuyển sang mơi trường rẻ MS +0,5ppm xNAA sau tuần rễ, vườn ươm tưới chăm sóc tuần ta có giếng C Quy trình nhân giống chuối giá trị Cây Chuối ( Musa.sp) ăn nhiệt đới có giá trị định dưỡng ẹ 72 kg kalo, kinh tế cao Theo tài liệu FAO, 100g chuối tiêu chín cho 79,2 %nước, 1,8% Protein, 6,2 lipit, 185 đường tổng số, 80mg vitamin, 8mg vitamin C Ngoài cịn có chất khống khác Bì, B› Quả dùng để ăn tươi bột chuối, mứt chuối, rượu chuối, trồng chuối tư, biết thâm canh cho hiệu kinh tế cao Từ Ca, P, Fe, mà nhanh cho lợi Na, K vitamin nguyên liệu chế biến thu hoạch, vốn đầu ích chuối nhiều vấn đề giống nhiều người muốn trồng chuối với diện tích rộng, song gặp - Vật liệu khởi đầu: Đối tượng đưa vào lấy mẫu nuôi cấy đỉnh chồi củ chuối Trang LÌ - Xử lý mẫu: sau rửa qua nước cất vô Mẫu đưa vào rửa vòi nước giờ, đến ngâm dung trùng đem vào ngâm cổn 70° phút, tiếp dich rửa lại nước cất vô trùng Sodium Hypocloride 3% thời gian 15 phút ide 1% thời gian phút, lần, sau khử trùng trở lại với Sodium Hypoclor lý mẫu xong chuyển mẫu vào rửa lại nước cất vô trùng từ 3-5 lần , sáu xử phịng ni cấy - Ni cấy: trùng cắt bỏ phần mô tiếp Mẫu khử trùng xong, dùng dụng cụ vô thước 5Š mmẺ cấy vào ống xúc với hoá chất khử trùng, cất thành rơ với kích thực tủ cấy vơ nghiệm có mơi trường tái sinh chối, thao tác hoạt tính đặt vào phịng ni trùng, môi trường MS + 5ppmBAP + lgr than độ 25C Từ mô cấy, cạm chồi điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, 15001ux, nhiệt sau 6-8 tuân chổi lớn bắt đầu phát triển sau tuần tiếp tục theo dõi gốc thân để cấy vào môi cum chéi tiếp tục nhân cách cắt dọc phần trường, chổi nhỏ môi trường tạo rễ chuyển vườn ươm phần phân chuồng cấy cấy sang mơi trường khác Sau chồi lại MS Bốn tuần sau hình thành hoàn chỉnh đất + Ngoài vườn ươm trồng bầu đất + phan ủ hoai+ phần tro trấu sau tuần xuất vườn d Quy trình nhân giống cay Dita: g sinh trưởng nhanh Cay Dita (Ananas comonus L.) Dứa có đặc điểm chun thu hoạch nhanh, sản lượng cao, dể trồng, không kén đất, chịu hạn, sâu bệnh cho dùng làm giấy để ăn tươi, làm đồ hộp xuất khẩu, nước giải khát bã cho suất thấp Dứa có nhiều giống với giống có từ trước dita méi cho nang suất cao giống ngày bị thối hố, cịn giống h giống dứa cho lại hạn chế số lượng Vì việc nhân nhan để cẩn giải Để suất cao để đáp ứng đủ giống cho người trồng vấn phương pháp nuôi cấy mơ tế giải vấn để việc nhân giống dứa bào làyviệc làm cần thiết , “„~ Vật liệu khởi đầu: vs Nguyên liệu dùng để nuôi cấy dứa Dự án mô Trang 12 Lips I - Xử lý mẫu: Ngọn dứa lấy mẫu, cất bỏ rửa nước xà phòng sạch, đem vào ngâm cồn 70° thời gian phút vớt đem ngâm vào dung dich Kali hypocloride 10% thời gian 30 phút, sau rửa mẫu nhiều lần nước cất vô trùng - Nuôi cấy: Mẫu xử lý vơ trùng chuyển vào phịng ni cấy Dùng đao vơ trùng tách bỏ lớp vỏ bao bên ngồi mầm chỗi, cắt chổi thành mảnh có kích thước 1x2cm, cất bỏ phần bị tổn thương khử trùng cấy mẫu vào môi trường tạo chổi MS + 3ppm + 0,5ppm œNAA chuyển vào phịng ni điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, 15001ux, nhiệt độ 25% Sau 15 ngày chổi bất đầu phát triển, sau 30 ngày cao 9-10 mm Tiếp tục tách chồi lớn tạo hồn chỉnh cay mơi trường rễ MS + 1,5 «NAA va sau 30 cay cao 5-6cm Chuyén vườn ươm cát sạch, vườn ươm sau 60 ngày cao 12-15 cm bón phân DAP-1g/1, KNO; 2g/1 tuần tưới lần sau tuần xuất trồng e Nhán giống Mía: Cay Mia (Saccharum officirarum L.) giống mía giữ vai trị quan trọng sản xuất mía giới Trước chưa biết lai hữu tính để tạo giống, giống mía thuộc loại nhiệt đới sử dụng cuối kỷ 19 không đáp hữu ứng nhu cầu đa đạng sinh thái khác Nhưng với việc tạo giống lai đáp tnh sinh trưởng phát triển không mạnh, không đồng Để ứng số lượng giống lớn có suất chất lượng cao việc áp dụng phương ni cấy mơ cần thiết phá - Vật liệu khởi đầu: Đỉnh sinh trưởng non có độ dài 60-80 cm - Xử lý mẫu: Ngọn mía lấy mẫu đem rửa vồi nước chảy sau đưa vào khử trùng băng cồn 702 thời gian Í phút vớt ngâm vào dung địch Sodium hypocloride rong 20 phút rửa lại nước cấtvô trùng 4-5 lần Du anc ‘ * Mẫu xử lý mang vào phịng ni cấy dùng dao vơ trùng bóc bao xung quanh đỉnh chổi cat đỉnh chổi thành miếng nhỏ I-2 cm cấy lên môi trương MS + Ippm BAP + IppmKinetin + 0,5 ppm«NAA chuyển vào phịng ni điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, 1500lux, nhiệt độ 25°C.Sau I tuần mẫu có tượng sống tốt sau'4 tuần mẫu phất triển thành cụm chối, chổi cao em chuyển Sang mơi trường tạo rễ tạo hồn chỉnh MS sau tuần phát triển hoàn chỉnh chuyển vườn ươm để ươm( mía cịn phát triển tốt mơi trường lỏng MS) Ngồi vườn ươm mía trồng đất: phần cát núi + phần tro trấu sau mía đưa trồng cần chăm sóc ngày lần, sau tuần xuất vườn, # Nhân giống hoa lan: Cây hoa lan (Orchidaceac) dược trồng thông dụng xuất khẩu, lưu thông ngành thương mại phát triển nhiều nước, gây trồng, lại tạo nhiều giồng độc đáo, Các quốc gia có cơng nghệ sản xuất hoa lan phương pháp tiên tiến như: Australia, Anh, Pháp, Nhật, Thái Lan, Để nhân giống vơ tính hoa lan có phương pháp + Tach chéi + Nuôi cấy mô (nhân giống invitro) Phương pháp tách chổi (nhân giống invitro) Phương pháp nhân giống g invitro hệ số nhân thấp, khó hình thành vườn ươm có số lượng lớn chúng loại, Chỉ có pháp phương phương pháp ni cấy y mơ có khả E giải giải qu vấn dé này, ngồi cịn sản xuất số lượng giống lớn Đây phương pháp nhân bố mẹ thành hoàn toàn đồng nhất, Ở Thái Lan 90% 1lan thương mại nhân phương pháp Phương pháp áp dụng thành công để nhân giống sớm đưa chúng vào sản xuất nông nghiệp, tiến hành nhân giéng loai lan 1A Dendrobium Phalenopsis +Denrobium: - Mật liệu khởi đầu: Nguyên liệu đưa vào nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, mẫu khô sương, chọn chồi nhú lấy vào buổi sáng ` - Xử lý mẫu: Du dn cay mo Trang 14 Mẫu đưa vào rửa vòi nước chảy rửa lại xà phịng, sau ngâm cồn 70° † phút, mang khử trùng Kali hypocloride 10-15 phút Sau rửa nước cất vơ trùng từ 3-5 lần, - Nuôi cấy: Mẫu xử lý mang vào phịng ni cấy đùng dao tách đỉnh sinh trưởng kính lúp cấy vào mơi trường MS + 0,2ppmœNAA + 0,2ppmBAP đưa vào phò ng nuôi điều kiện chiếu sáng 12 giờ/ngày, 1500lux, nhiệt độ 25°C Theo đối sau tuần mẫu bát dầu sống tốt, sau trần phát triển thành cụm chối Ngoài ta bổ sung thêm 100g khoai tây vào [ lít mơi trường lan phát triển tốt, khoẻ mập Sau đó, chổi to cấy chuyển sang môi trường rễ MS sau tháng ta có hồn nh vườn ươm Tại vườn ươm trồng giá thể xơ đừa ngày tưới lần, phun gro wmore llân/tuần, phát triển tốt sống 100% % +Phalenopsis: Nguyên liệu dùng để nuôi cấy vòi hoa, ta tiến hành lấy mẫu khử trùng tương tự nhu Denrobium mẫu Phalenopsis khử trù ng Kali phút Sau cắt đoạn mẫu 5mm cấy vào môi trường Knudson°e + lppmeNAA + 10 PPmBAP + IỦppm Ađenin , sau tuần theo dõi mẫu bắt đầu hypocloride 3% mọc rể mơi trường phat triển cụm chỏi ! cách mãnh liệt lại thiếu điệp lục tố Nếu môi trường Knudsn ic + 0,2ppm BAP + 0,2ppm NAA + 10 ppm Adenin có khả qua n sớm hình thành xanh Sau chổi to chuyển vào môi trường rẻ Knudson’c + 0,5ppmœNAA, sau thắng có hồn chỉnh chuyển vườii ươm giá thể xơ dừa chăm sóc chế độ chăm sóc Dernobium Nhân giống hoa Huệ: Giống huệ đưa vào nuôi cấy giố ng huệ hương trắng ` Nguyên liệu đưa vào nuôi cấy vay (vay củ) Lấy củ hòa rửa sạch, khử trùng Hypocloride sodium 30% tỉ lệ 1:1 20 phút Sau đem rửa nước cất vô trù ng 3-5 lần Dùng dao vơ trùng tách lớp vay ngồi cắt đoạn mm cấy vào môi trường Knudsnic + Ippm NAA + 10 «ppm BAP + 10 ppm Adenin Mẫu có tượng sau tuần tuần tạo thành hoàn chỉnh chuyển vườn ươm , — Mage anne Dự án cấy mô TT TT TT rrtrnrrrrrrrrr rrrn errrreerreeir Trang 15 Tại vườn ươm: đất trồng chuẩn bị theo tỷ lệ: phần cát + phần phân chuồng ủ hoại + phần tro trấu cho vào bầu trông, che mát 70% phát triển tốt, tỷ lệ sống 70% 3- Kết nhân giống : a- Trong phịng thí nghiệm : Đã nuôi cấy 1000 lọ bao gồm : - Chuối : 10lọ - Dứa : 20 lọ - Mia : 30lọ - Hué : 05 lo Còn lại lan loại b- Ngoài vườn ươm : - Chuối : 10 - Dứa : 10 cay - Mia : 10 - Lan : - 200 gid loại - 500 cay Trang 16 IV- KET LUAN - KIEN NGHI 1- Kết luận : + Nuôi cấy mô tế bào thực vật công việc tương đối khó, địi hỏi tính tỷ mỉ cao phải có óc quan sát nhạy bén, đặc biệt khâu vơ trùng, thao tác khó nhất, thành công lần đầu Mặc khác, lý thuyết người ta tạo thành cơng phơi nhân tạo từ tế bào sinh dưỡng mot cay hoàn chỉnh : mẫu rể , mẫu , đài hoa , vòi hoa Nhưng thực tế cho thấy đỉnh sinh trưởng phận tạo thể chổi có khả nang phân chia mạnh nhất, nên tạo hệ số nhân cao Hơn đo đặc tính phân chia nhanh nên vị khuẩn khơng kịp xâm nhập, việc khử trùng mẫu để dàng Tuy nhiên, tuỳ thuộc loại mà đòi hỏi chất liệu khác : Mía : Sử dụng non cịn bọc be dài hoa non Huệ : Lá vảy -_ Đứa ; Chối nách nằm phần đứa Chuối : Đỉnh củ chuối Lan : Tuỳ theo giống - Dedrobium : Đỉnh sinh trưởng chổi nhú ~ Phalnopsis : Vòi hoa - Cymbidium : Dau ré - Cam, chanh : Ví giâm cành - Ni cấy mơ tế bào thực vật áp dụng hiệu vào chương trình chọn giống, nhân giống đại, tạo lập cá thể ưu tú chọn lọc từ quan thé mang tinh đồng cao, tạo dịng vơ tính bệnh với tốc dộ cực nhanh, có khả tồn trữ tế bào thực vật sống thời gian đài nhiệt độ thấp mà khơng tính toàn thể tế bào ` Riêng tỉnh Trà Vinh ni cấy mơ tế bào thực vật áp dụng lĩnh vực hoa kiếng nhân giống phong lan, công nghiệp : cải thiện giống mía để tăng suất Trà Vinh có vùng chun canh mía tập trung huyệh Trà Cú, đo việc cải làm cẩn thiết, thiện giống mía để tăng suất việc nhân giống vơ tính theo phương pháp cổ truyền hệ số nhân thấp, hải thời gian dài thay toàn giống cũ, sử dụng phương pháp hi cấy mơ để nhân giống thời gian ngắn Dự án mo ~~ Tóm lại : Qua năm thực dự án, lúc đầu gặp nhiều khó khăn, lúc phải làm nhiều loại khác nên kết chưa cao, dự án cấy mô đạt số thành cơng định, ngồi sản phẩm thu bước đầu tiếp thu kiến thức cấy mơ vận dụng vào việc nhân giống vơ tính số lồi cây, dùng phương pháp giâm cành đơn khó thành công 2- Kiến nghị : - UBND tinh tiếp tục đầu tư, trì hoạt động Phịng thí nghiệm cấy mơ thực vật để phục vụ yêu cầu nhân giống trồng tỉnh trước mắt lâu đài ~ Bộ KHCN& MT hỗ trợ tỉnh đào tạo số cán khoa học chuyên sâu cấy mô giúp tỉnh tiếp thu quản lý tốt công nghệ đại cấy mô Trang 18 ... lọc nhân giống trồng otinl Tra Vinh" mo Trang II TOM TAT NOI DUNG CHÍNH CUA DUAN 1- Tên dự án : Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn lọc nhân giống trồng tỉnh Trà Vinh. .. không cao, chất lượng giống không đảm bảo, thêm vào phải phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, khí hậu, Vì vậy, việc áp dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc nhân giống, lưu giữ bảo... lượng nhiều ảnh hưởng đến mẹ, thực vật để nhân vấn để giống việc áp dụng nuôi cấy mô tế bào giống chanh việc làm thiết thực - Vật liệu khởi đầu: Đối tượng đưa vào lấy mẫu nuôi cấy cành bánh te