Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống invitro lan vũ nữ (oncidium) tại hà tĩnh

DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu Bảng 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồiBảng 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacaro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA NÔNG LÂM NGƯ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trungthực và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận này đã được cám ơn và mọi thông tin được trích dẫn trong khoá luận đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả khoá luận

Phạm Minh Chính

LỜI CẢM ƠN !

Để hoàn thành khoá luận này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã

nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của Ban chủ nhiệm khoa Nông Lâm Ngư - Đại học Vinh cùng với khoa Kỹ Thuật - Công Nghệ - Đại học Hà Tĩnh

Để tôi có được kết quả như ngày hôm nay, trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc tới ThS Trương Xuân Sinh – khoa Nông Lâm Ngư đại học Vinh vàThS Trần Thị Thuý Anh – Trung Tâm ứng dụng tiến bộ khoa học công nghệ HàTĩnh đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập vàhoàn thành khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Khoa Học CâyTrồng, các anh chị thuộc trung tâm ứng dụng tiến bộ khoa học - công nghệ HàTĩnh đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài này

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, tập thể lớp 45KNông Học cùng toàn thể bạn bè – những người đã giúp đỡ tôi, cùng tôi chia sẻnhững khó khăn trong thời gian qua

Vinh, ngày 25 tháng 12 năm 2008

Sinh viên Phạm Minh Chính

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN ! iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU vii

DANH MỤC CÁC BẢNG ix

DANH MỤC CÁC HÌNH x

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ xi

MỞ ĐẦU 1

1.Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm thực vật học của cây hoa lan 4

* Thân lan 4

*Lá lan 4

* Hoa lan 5

* Quả lan 6

* Hạt lan 6

1.2 Thành phần môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào 6

1.2.1 Các loại muối khoáng 7

1.2.2 Nguồn cacbon 8

1.2.3 Vitamin 9

1.2.4 Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật 9

1.2.5 Các chất phụ gia tự nhiên 11

1.2.6 Chất độn thạch agar 11

1.2.7 Độ pH của môi trường 11

1.2.8 Chuẩn bị các dung dịch đậm đặc và dung dịch làm việc 12

1.3 Quy trình chung của nuôi cấy mô tế bào- invitro 14

1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất invitro hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 15 1.4.1 Trên thế giới 15

1.4.2 Ở Việt Nam 16

1.5 Những vấn đề còn tồn tại và những vấn đề mà đề tài luận văn tập trung nghiên cứu giải quyết 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 20

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 21

-Thời gian nghiên cứu 21

- Địa điểm 21

2.3 Vật liệu nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.5.Chỉ tiêu theo dõi 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả nghiên cứu giai đoạn vào mẫu 23

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồi 25

3.3 Ảnh hưởng của sucrose lên quá trình nuôi cấy 27

3.4 Ảnh hưởng của các chất phụ gia ( hay còn gọi là chất hữu cơ tự nhiên) bổ sung trong môi trường nuôi cấy 28

3.5 Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi 30

3.6 Ảnh hưởng của Kinetin (K) đến quá trình nhân chồi 33

3.7 Ảnh hưởng của BA kết hợp Kinetin đến quá trình nhân chồi 34

3.8 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ 38

3.9 Ảnh hưởng của NAA đến quá trình tạo rễ 40

3.10 Sơ đồ tổng quát quy trình nhân giống invitro lan Vũ Nữ 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43TÀI LIỆU THAM KHẢO 45PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

BA : 6 Benzyn amino purin Kinetin : 6 Fufurolamino purine IBA : Indol – 3- Butyric Acid NAA : Naphthalene Acetic Acid

MS :Murashige - Skoog

W : White

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu

Bảng 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồiBảng 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacarose lên quá trình nuôi cấy

Bảng 3.4 : Ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường nuôi cấyBảng 3.5 : Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi

Bảng 3.6 : Ảnh hưởng của K đến quá trình nhân chồi

Bảng 3.7 : Ảnh hưởng của BA kết hợp K trong quá trình nhân chồi

Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ

Bảng 3.9 : Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu

Hình 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồiHình 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacarose lên quá trình nuôi cấy

Hình 3.4 : Ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường nuôi cấyHình 3.5 : Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi

Hình 3.6 : Ảnh hưởng của K đến quá trình nhân chồi

Hình 3.7 : Ảnh hưởng của BA kết hợp K trong quá trình nhân chồi

Hình 3.8 : Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ

Hình 3.9 : Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ

Hình 10 : Hoa lan Vũ Nữ ( Oncidium)

Hình 11 : Môi trường nuôi cấy

Hình 12 : Chuẩn bị môi trường, bố trí thí nghiệm

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng giai đoạn vào mẫu

Đồ thị 3.2 : Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình nhân chồi

Đồ thị 3.3 : Ảnh hưởng của đường sacarose lên quá trình nuôi cấy

Đồ thị 3.4 : Ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường nuôi cấy

Đồ thị 3.5 : Ảnh hưởng của BA đến quá trình nhân chồi

Đồ thị 3.6 : Ảnh hưởng của K đến quá trình nhân chồi

Đồ thị 3.7 : Ảnh hưởng của BA kết hợp K trong quá trình nhân chồi

Đồ thị 3.8 : Ảnh hưởng của IBA lên quá trình tạo rễ

Đồ thị 3.9 : Ảnh hưởng của NAA lên quá trình tạo rễ

MỞ ĐẦU 1.Lý do chọn đề tài

Từ xưa cho đến nay, hoa lan luôn được con người ngưỡng mộ và được xemnhư là nữ hoàng của các loài hoa, loài hoa của vương giả hay vua của những loài

cỏ cây có hoa Do có vẻ đẹp quyến rũ mê hồn về màu sắc, hương thơm đặc biệt,các đường nét thật cầu kỳ và sắc sảo của cánh hoa thêm vào đó hoa lan có đặctính bền và tươi lâu nên nó không chỉ chiếm ưu thế trong đời sống tinh thần củacon người mà còn trở thành một mặt hàng mang lại nguồn thu lớn cho ngànhnông nghiệp Đặc biệt là các nước thuộc châu Á nhiệt đới như Thái Lan,Singapo, Malayxia, Nhật bản…

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cùng với sự phát triển nhanh chóngcủa nền kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng hoa nói chung và hoa lan nói riêngcũng tăng nhanh Hoa không chỉ dùng trong những dịp lễ tết như trước đây mànhu cầu về hoa trong cuộc sống thường ngày của người dân cũng rất lớn Bêncạnh nhu cầu về số lượng thì chất lượng cũng đòi hỏi ngày càng cao Trong khithực tế sản xuất hoa ở Việt Nam cũng gặp rất nhiều khó khăn về giống, cơ sở vậtchất, kỹ thuật dẫn đến số lượng và chất lượng hoa lan chưa đáp ứng được thịhiếu của người tiêu dùng

Gần đây, nhờ việc áp dụng công nghệ kỹ thuật mới trong lĩnh vực sinh học

đó là công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã tạo ra sự đa dạng về màu sắc, phong phú

về chủng loại của các loài hoa lan.Vì vậy ngày càng đáp ứng được thị hiếu củangười thưởng thức và chơi hoa

Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào với những ưu điểm nổi trội là: cho hệ sốnhân giống rất cao; sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diệntích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu; cây giống sản xuất ra hoàn toànsạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, việc vận chuyển cây giống đi xa thuậntiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu vềsản xuất cây giống hoa phong lan hiện nay

Vũ nữ (Oncidium) là một trong những loài phong lan quý được nhiều người

ưa chuộng và ngưỡng mộ Việc nhân giống bằng biện pháp truyền thống xẻ thânkhông mang lại hiệu quả cao mà còn làm cho giống lan này ngày một ít đi và cónguy cơ diệt vong

Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành đề tài: ''ứngdụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống invitro loài lan Vũ Nữ

(Oncidium) tại Hà Tĩnh ''

2 Mục đích nghiên cứu.

Mục đích của đề tài này là nhằm áp dụng cơ sở khoa học của phương phápnuôi cấy mô tế bào thực vật để nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống invitrolan Vũ Nữ, sản xuất được nguồn cây giống sạch bệnh với số lượng lớn, chấtlượng cao ở tỉnh Hà Tĩnh

3 Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu

- Đối tượng: Cây lan Vũ nữ: Giống Vũ nữ Oncidium Grower Ramsey, với

hoa màu vàng tươi có chấm nâu, cánh hoa nhỏ, cành có nhiều chùm hoa

- Nội dung nghiên cứu:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong giai đoạn vào mẫu

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất phụ gia bổ sung trong môi trường

nuôi cấy lan Vũ Nữ (Oncidium)

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BA đến quá trình

nhân chồi lan Vữ Nữ (Oncidium)

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng Kinetin đến quá

trình nhân chồi lan Vữ Nữ (Oncidium)

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng BA kết hợp với

kinetin đến quá trình nhân chồi lan Vữ Nữ (Oncidium)

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA đến quá trình

tạo rễ lan Vữ Nữ (Oncidium)

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng NAA đến quá

trình tạo rễ lan Vữ Nữ (Oncidium)

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Trên cơ sở xác định được các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến quátrình nuôi cấy mô tế bào từ đó xây dựng được quy trình nhân giống lan Vũ Nữinvitro

- Vũ Nữ là một trong những loài lan khó nhân giống bằng phương pháp xẻthân truyền thống nên việc xác định và làm chủ được quy trình nhân giốnginvitro là một việc làm hết sức quan trọng nhằm sản xuất hàng loạt cây giốngchất lượng cung cấp cho nghành công nghiệp sản xất lan thương mại đang pháttriển ở nước ta

- Các công trình nghiên cứu về nhân giống hoa lan ở nước ta chưa nhiều,chưa được ứng dụng rộng rãi, đề tài này sẽ đi sâu nghiên cứu vào môi trườngnuôi cấy đặc biệt là sử dụng các chất kích thích sinh trưởng trong nhân giống hoalan nhằm góp phần tạo một bước đột phá trong nghành công nghiệp hoa lan ởtỉnh Hà Tĩnh và khu vực Bắc Trung Bộ

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm thực vật học của cây hoa lan

* Rễ lan

Nhìn chung họ lan thuộc các loài cây thân thảo, sống lâu năm, chúng sống ởđất, vách đá hoặc sống phụ, sống hoại Vì vậy, đặc điểm rễ lan có sự khác biệtlớn giữa các giống loài ( Vừ Văn Chi, 1969) Khi sống ở đất, chúng thường códạng củ nạc, rễ mập và xum xuê hoặc có chân rễ bò dài hay ngắn Tuy nhiên, nétđộc đáo nhất của họ lan là lối sống phụ bám (bì sinh), treo lơ lửng trên các thâncây gỗ khác Chúng phát triển các dạng thân rễ nạc, dài, ngắn, mập hay mảnh mai(tuỳ thuộc từng loài) đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày đặc

Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối dày

đặc

* Thân lan

Có hai nhóm thân chính là đơn thân và đa thân Thân lan có thể ngắn haykéo dài, đôi khi phân nhánh, mang lá hay không mang lá (Việt Chương, NguyễnViệt Thái, 2002), (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Ở nhóm đa thân thì cây vừa có thân vừa có giả hành Giả hành là nơi dự trữchất dinh dưỡng và nước để nuôi cây Đây được đánh giá là bộ phận rất cần thiếtcho sự sinh trưởng và phát triển của lan đa thân (Nguyễn Xuân Linh, 2002) Lan Vũ Nữ thuộc nhóm lan đa thân thường có giả hành dẹp tận cùng có 1 -

2 lá dẹp hay hình trụ (Dẫn theo Nguyễn Công Nghiệp, 2006)

*Lá lan

Hầu hết các loài lan đều là cây tự dưỡng do đó nó phát triển đầy đủ hệthống lá mềm mại, duyên dáng và hấp dẫn Lá mọc đơn độc hoặc xếp dày đặc ởgốc, hay xếp cách đều đặn trên thân, trên củ giả Hình dạng lá thay đổi rấtnhiều, từ loại lá mọng nước, nạc, dài, hình kim, hình trụ dài, tiết diện dài hay córãnh đến loại lá hình phiến mỏng, dài, màu xanh bóng đậm hay nhạt tuỳ theo vị

trí sống của cây, đặc biệt rất hiếm loại lá hình tròn thuôn dài thành bẹ ôm lấythân (Nguyễn Xuân Linh, 2002).

* Hoa lan

Cấu tạo hoa lan cực kỳ phong phú và hấp dẫn Ta có thể gặp nhiều loài màmỗi mùa chỉ có một đoá hoa nở hoặc có nhiều cụm hoa mà mỗi cụm chỉ đơmmột bông Tuy nhiên, đa số các loài lan đều nở rộ nhiều hoa, tập hợp lại thànhchùm phân bố ở đỉnh thân hay nách lá Hoa lan có cấu trúc cơ bản là hoa mẫu ba,kiểu hoa đặc trưng của hoa lớp một lá mầm nhưng đó biến đổi rất nhiều để hoa

có đối xứng qua một mặt phẳng Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính, rất hiếm gặp loàiđơn tính, bao hoa có dạng cánh xếp thành hai vòng (Võ Văn Chi, 1978)(NguyễnXuân Linh, 2002)

Hoa lan có 3 cánh đài, thường có cùng màu sắc và kích thước Tuy nhiên,các loài lan khác nhau, cánh đài có hình dạng biến đổi rất khác nhau Dạng hìnhtròn như các giống Vanda, Ascocentrum, nhọn như Cattleya, xoắn như các loàithuộc giống Laelia Nằm kề bên trong và xen kẽ với ba cánh đài là hai cánh hoa,thường cũng giống nhau về hình dạng, kích thước và màu sắc.Cánh còn lại nằm ởphía trên hay phía dưới của hoa, thường có hình dạng và màu sắc đặc biệt kháchẳn hai cánh kia gọi là cánh môi hay cánh lưỡi.Chính cánh môi quyết định phầnlớn giá trị thẩm mỹ của hoa lan (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Trụ hoa là bộ phận sinh dục của hoa, bao gồm cả cơ quan sinh dục đực vàcái nên được gọi là trục - hợp - nhụy Phần cái mang noãn hình lồi, bề mặt dínhchất nhầy Phần đực mang phấn khối, phấn của hoa lan không tách ra thành từnghạt nhỏ mà kết tụ lại thành những đám đặc có ít hay nhiều sáp Số lượng phấnkhối là 2, 4, 6, 8 có dạng cong hay thuôn lưỡi liềm Hoa phong lan có bầu hạ,thuôn dài kéo theo xuống Sự vặn xoắn toàn bộ hoa trong quá trình phát triển làđặc điểm của bầu Hoa thường bị vặn xoắn 180o sao cho cánh môi khi hoa bắtđầu nở hướng ra bên ngoài, thuận lợi cho côn trùng đậu Hiếm khi hoa vặn 360o

như ở Malayxia, Paludosa hoặc không vặn gì do cuống hoa rủ xuống như loàiStanhopea Như thế khi hoa nở, cánh môi hướng lên trên, thích nghi với loại côn

trùng ưa lộn đầu xuống dưới khi chui vào hoa Bầu hoa có 3 ô gọi là 3 tâm bỡ.Trong bầu chứa vô số các hạt nhỏ li ti gọi là tiểu noãn nằm trên 3 đường, dọctheo chiều dài của 3 mép tâm bì Sau khi thụ phấn, thụ tinh, các tiểu noãn sẽ biếnđổi và phát triển thành hạt trong khi đó bầu noãn sẽ phát triển thành quả Hoa lan

Vũ Nữ thường nhỏ nhưng đặc biệt có cánh môi rất lớn Hoa thường là màu vàngvới đốm nâu, có thể rất dài

* Quả lan

Quả lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 đường nứt dọc Có dạng từquả cải dài đến dạng hình trụ ngắn, phình ở giữa Khi chín quả nở ra và mảnh vỏcòn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc Ở một số loài khi quả chín nứttheo 1 – 2 khía dọc, thậm chí không nứt ra mà hạt chỉ ra khỏi vỏ khi vỏ này bịmục nát (Nguyễn Tiến Bân, 1990)

* Hạt lan

Hạt lan rất nhiều, nhỏ li ti Hạt chỉ cấu tạo bởi một khối chưa phân hóa, trên mộtmạng lưới nhỏ, xốp, chứa đầy không khí, sau 2 – 18 tháng hạt mới chín Phần lớn hạtthường chết vì khó gặp nấm cộng sinh cần thiết để nảy mầm do đó hạt nhiều, nhẹ cóthể theo gió bay phát tán rất rộng nhưng hạt nảy mầm thành cây rất hiếm Chỉ trongnhững khu rừng già ẩm ướt vùng nhiệt đới mới đủ điều kiện cho hạt lan nảy mầm.Khối lượng toàn bộ hạt trong một quả chỉ bằng 1/10 – 1/1000 mg, trong đó không khíchiếm xấp xỉ 76 – 96% thể tích hạt

1.2 Thành phần môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào

Môi trường nuôi cấy là điều kiện cần thiết, là yếu tố quyết định cho sự phânhoá tế bào và cơ quan trong nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy phải có đầy đủ chất dinh dưỡng và các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như cho sự sinh trưởng bình thường của cây

Đến nay, có hàng trăm loại môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được xây dựng và thử nghiệm Hầu hết các loại môi trường đều bao gồm những nhóm chất chính sau đây:

TT Thành phần môi trường dinh dưỡng

1 Các loại muối khoáng đa lượng, vi lượng

1.2.1 Các loại muối khoáng

Các nguyên tố khoáng trong môi trường dinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào thực vật được chia thành 2 nhóm theo hàm lượng sử dụng: Nhóm đa lượng và nhóm vi lượng

a Các nguyên tố khoáng đa lượng:

Bao gồm các nguyên tố khoáng: N, P, S, K, Mg, Ca, được sử dụng ở nồng

độ trên 30 ppm, tức là trên 30mg/l

- Nitơ ( N): Hai dạng NO3- và NH4+ được sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau Hầu hết các thực vật đều có khả năng khử nitrat thành amonium thông qua hệ thống nitrat reductase Amonium được tế bào thực vật đồng hoá trực tiếp

để sinh tổng hợp nên các chất đạm hữu cơ như amoni axit Điều đáng lưu ý là nếu chỉ dùng amoni thì sinh trưởng của tế bào giảm, thậm chí ngừng hẳn

Nguyên nhân chính là do quá trình trao đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi pH của môi trường Vì vậy, hầu hết các loại môi trường đều dùng nitrat và amonium dạng phối hợp, nhưng tuỳ theo đặc tính hấp thu nitơ của loài cây đó mà phối hợp tỷ lệ thích hợp

- Lưu huỳnh ( S): Chủ yếu và tốt nhất là muối S042- Các dạng ion khác như S03 hoặc S02 thường kém tác dụng, thậm chí là độc

- Phốtpho ( P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu về photpho rất cao Photpho là một trong những thành phần cấu trúc của axit nucleic Ngoài ra, khi photpho ở dạng H2P04- còn có tác dụng như một hệ đệm, làm ổn định pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy

b Các nguyên tố khoáng vi lượng

Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30 ppm Đó là: Fe,

B, Mn, I, Mo, Zn, Ni, Co,

- Sắt ( Fe): Thiếu sắt, tế bào mất đi khả năng phân chia Thí nghiệm với sắt đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 59Fe cho thấy sắt được dự trữ trong nhân rất nhiều Thiếu sắt làm giảm ARN và giảm sinh tổng hợp protein nhưng làm tăng lượng ADN và axit amin tự do, kết quả là giảm phân bào Sắt thường tạo phức hợp với nhiều thành phần khác và khi pH môi trường thay đổi phức hợp này thường mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào Tốt nhất nên sử dụng sắt ở dạng phức FeCl2.FeCl3.6H20; FeS0.7H20; Fe2(S04)3; Fe(C4H40) hoặc với EDTA ( Etylen Diamin Tetra axetic axit) Từ các phức chất này sắt được giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng

- Mangan ( Mn):Thiếu Mn cũng làm cho hàm lượng các amino axit tự do vàADN tăng lên, nhưng hàm lượng ARN và sinh tổng hợp protein giảm, quá trình phân bào bị ức chế

- Bo ( B): Thiếu B trong môi trường gây nên biểu hiện như thừa auxin vì thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm Mô nuôi cấy

có biểu hiện thành mô sẹo hoá mạnh, nhưng thường là loại mô xốp, mọng nước, kém tái sinh

- Molypden ( Mo): Đóng vai trò co-factor trong hệ thống nittrat reductase Như vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật

1.2.2 Nguồn cacbon

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng Mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ điều kiện ánh sáng nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp Việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon thôngdụng nhất đã được kiểm chứng là saccarorose nồng độ thích hợp là 2-3% song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi xuống tới 0.2%

và tăng lên tới 12%

Glucose và maltose cũng thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy ( glucose cho nuôi cấy protoplast và mantose cho nuôi cấy bao phấn lúa), các loạiđường như fructose, raffinose, lactose cũng được thử nghiệm nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong trường hợp đặc biệt.

1.2.3 Vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả năng

tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng, do

đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B

Bảng: Một số vitamin thường dùng trong môi trường nuôi cấy

1.2.4 Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật

Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, một thành phần có vai tròquan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều hoà sinh trưởng Những chất đó thuộc các nhóm sau:

- Auxin: Là một loại hoocmon thực vật ( phytohormon) do Went và

Thimanm phát hiện ( 1937), chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào, nhưng cũng có vai trò làm tăng phân bào Có 4 loại auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:

+ Indolylaxetic ( IAA)

+ Naphthyl axetic axit ( NAA)

+ 2,4 – Dichlorphenoxy axetic axit ( 2,4- D)

+ Indol butyric axit ( IBA)

- Xytokinin: Là hoocmon phân bào lần đầu tiên được Skoog ( 1950) phát hiện trong một thí nghiệm chiết xuất axit nucleic bị sơ suất Đó là những cấu trúccủa nucleic axit bị phân huỷ thành Xytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là:

+ Kinietin: Cấu trúc phân tử: 6-( 2- furfuryl)- amino purin

+ BAP: 6-Benzyl amino purin

+ Zeatin: Cấu trúc phân tử 6-(hyđroxy-3-methybut-2-enyl) aminopurin

- Gibberellic axit: Được phát hiện vào những năm 1930 Loại Gibberellic axit thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3

Trong đời sống thực vật, Gibberellic axit đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý Nhưng tác động của GA trong nuôi cấy mô và tế bào thựcvật chưa thực sự rõ ràng

Bảng: Một số chất điều khiển sinh trưởng thường dùng

2,4 D [ dichlorophenoxy axetic] 0.2 - 5

α_NAA [ naphtyl axetic axit]NAA [ naphtyl axetic axit] 0.1 - 5

β_NAA [ naphtyl axetic axit]NAA [ indol axetic axit] 5 -20

Kinetin [ 6 finfuryl amino purine] 0.1 -2

BA [ 6_NAA [ naphtyl axetic axit] BAP] [6 benzylaminopurine] 0.1 - 2

- Nước dừa: Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo- inositol và một số axits amin khác Lượng nước dừa dùng trong môi trườngcấy thường khá lớn từ 15 – 20% thể tích môi trường.

- Dịch chiết nấm men: Với dịch chiết nấm men, White ( 1934) lần đầu tiên nuôi thành công rễ cà chua trong ống nghiệm kéo dài vô thời hạn Thành phần hoá học của dịch chiết nấm men ít được chú ý phân tích, chủ yếu chứa: đường, axit nucleic, axit amino, vitamin, auxin, khoáng tác dụng của dịch chiết nấm men rất tốt với rễ nhưng không rõ ràng với mô sẹo

- Ngoài ra người ta còn sử dụng các chất hữu cơ tự nhiên khác như: Khoai tây, cà rốt, chuối có tác dụng cung cấp thêm vitamin, amino axit

1.2.6 Chất độn thạch agar

Là một loại polysacarit thu được từ một số loài tảo ( chủ yếu là tảo hồng), được sử dụng làm chất đệm cho môi trường rắn lại Ở 800C, thạch ngậm nước chuyển thành dạng sol và ở 400C trở về trạng thái gel Khả năng ngậm nước của thạch là 6 – 12g/1l nước

1.2.7 Độ pH của môi trường.

Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào Vì vậy đối với mỗi loại môi trường dinh dưỡng nhất định và đối với từng trường hợp cụ thể của các loài cây, phải chỉnh độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu

Đối với nuôi cấy mô của nhiều loài cây, pH thường là 5,5 – 6

Đặc biệt khi sử dụng chất phụ gia có tính kiềm hoặc tính axit như: axit amin, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl loãng để pH môi trường

ổn định là 5,5 – 6,5

1.2.8 Chuẩn bị các dung dịch đậm đặc và dung dịch làm việc

Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy, người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc, sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày

trong tủ lạnh.Dưới đây là thành phần MS và thành phần White được sử dụng trong đề tài.

Fe2(SO4)3

0,80.38

95,001,241,2434,000,1660,0160,050

5

D MnSO4.4H2O

ZnSO4.7H2OCuSO4.5H2OMgCl2

0,0500,0050,00574,00

5

Axit nicotinicPyridoxine HClGlyxine

0.020.100.100.40

5

Thành phần môi trường White gồm:

Dung dịch Hoá chất Nồng độ ( g/l) Số ml dung dịch mẹ

cần cho 1000ml dung dịch làm việc

A Ca(NO3)2.4H2O

Na2SO4

KNO3

KClNaH2PO4.H20

3,02,00,800,650,19

Na2MoO4.2H2O

0,500,300,150,0750,0010,025

10

1.3 Quy trình chung của nuôi cấy mô tế bào- invitro

Sự thành công hay thất bại của nhân giống vô tính phụ thuộc phần lớn vào

việc thực hiện các bước trong nhân giống invitro Quy trình này bao gồm các giai

đoạn sau:

1.3.1.Giai đoạn chuẩn bị

Đây là bước đầu tiên của quy trình nhân giống Tuỳ theo điều kiện, giaiđoạn này kéo dài từ 3-6 tháng Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ

để lấy mẫu (cây mẹ thường là cây ưu việt, khoẻ, có trí trị kinh tế, ), chọn cơquan để lấy mẫu (thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, lá non, đầu rễ, )

Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ốngnghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ Sau đó chọn chế độkhử trùng thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, đồng thời khảnăng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến

hiện nay là dùng các tác nhân hoá học Các hoá chất thường được dùng để khửtrùng là cồn 70%, HgCl2, NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2, Nồng độ chất khử trùngđược chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp,

mô già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khửtrùng với nhau Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môitrường nhằm tăng hiệu quả khử trùng

Thời gian khử trùng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng loài cây,loại mô hoặc mô nuôi cấy Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian ngắn,

mô già trong thời gian dài hơn

1.3.2.Giai đoạn nuôi cấy khởi động

Sau khi khử trùng, ta đưa mẫu vào nuôi cấy invitro trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy Môi trường này được xác lập chotừng loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn,nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt độ, ánhsáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu sẽ xuất hiệncác cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặctính gần như phôi hữu tính Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu để cho quá trìnhnhân nhanh tiếp sau đó

1.3.3.Giai đoạn nhân nhanh

Một khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi, cácphôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhânnhanh Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôicấy và thành phần môi trường đã được tối ưu hóa nhằm đạt được mục tiêu này.Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1-2 thángtùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh là vào khoảng 10-36tháng

1.3.4.Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưngthông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích

tạo rễ Ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân,

lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống

1.3.5.Giai đoạn vườn ươm.

Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống invitro

khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Khiđưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng “sốc” dothay đổi về điều kiện môi trường cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thíchnghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu sự chăm sóc đặc biệt, do đó ở giaiđoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng vàgiữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và trong điều kiện cách ly bệnh

để các cây con đạt tỷ lệ sống cao

1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất invitro hoa lan trên thế giới và ở Việt

Nam

1.4.1 Trên thế giới.

Hiện nay Thái Lan là nước đứng đầu thế giới về xuất khẩu hoa lan, có 18 phòng

nuôi cấy invitro hoa lan thương mại hoạt động ở Băng Cốc và các vùng phụ cận Hàng năm sản xuất 31,6 triệu cây con trong đó Dendrobium chiếm 80%, Mocara 5% còn lại

là các loại hoa khác (Đồng Văn Khiêm, 1995)

Nhờ khả năng thực hiện công nghệ mới trong nuôi cấy mô và lai tạo, với giá laođộng thấp, khí hậu thuận lợi, giao thông tốt cho phép Thái Lan sản xuất quanh năm vàxuất đi 50 nước trên thế giới Năm 1993, Thái Lan xuất đi 70,7% cho thị trường Anh,81,4% cho Hà Lan về lan cắt cành, 64 triệu cành cho Ý, 5 triệu cành cho Nhật ( NgôQuang Vũ, 2002)

Ở Singapo nghề trồng hoa lan xuất khẩu trên quy mô lớn bắt đầu từ năm 1987.Trên cơ sở phân tích và thấy rằng tiềm năng xuất khẩu loài hoa này trên thế giới nênSingapo đã mở trang trại trồng hoa phong lan Năm 1992 xuất khẩu hơn 18 triệu USD

ra nước ngoài Hiện nay Singapo chiếm 12% thị trường phong lan thế giới, năm 1995đạt 37 triệu USD (Phan Thúc Huân, 1989)

Hà Lan đã đầu tư 20 triệu USD vào Ấn Độ để lắp đặt các thiết bị máy móc đầu tưcho sản xuất hoa lan xuất khẩu.

Nhật Bản đã đầu tư 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng cơ sở sản xuất vớicông suất 10 triệu cây hoa lan mỗi năm Hiện nay, Nhật cũng là khách hàng lớn nhấtcủa Singapo với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan của nước này (Phan Thúc Huân,1989)

Cùng với các quốc gia trên, ở Đài loan lan Hồ điệp được cả thế giới ngưỡng mộ

và được tiêu thụ khắp toàn cầu Nguyên nhân chính của sự thành công là do Đài loan đãthành lập được một hệ thống tiên tiến hàng đầu thế giới trong việc lai tạo giống lan mới.Đài loan trở thành nơi sản xuất chủ yếu lan Hồ Điệp của thế giới

Theo nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trong nhân giống lan HồĐiệp của Zhu Gen Fa (Trung Quốc) khi sử dụng các đốt cành hoa làm mẫu cấy trênmôi trường MS + 3-5 mg BA/l thì tỷ lệ các mẫu hình thành chồi sinh dưỡng đạt 90%trở lên Nuôi cấy các chồi dinh dưỡng đó trên môi trường MS + 10mg/l khoai tây +NAA 5mg/l + 10% nước dừa + đường mía 20g/l để tạo thể tiền chồi ( Nguyễn QuangThạch, 2005)

1.4.2 Ở Việt Nam

Nhìn chung sản xuất hoa lan ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnhphía Nam, đặc biệt là ở Đà Lạt và Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 năm 2004 LâmĐồng đã thành lập Hiệp hội hoa lan với tên gọi giao dịch là Dalat Orchid Asscociationvới mục đích là tập hợp những người yêu mến và có kinh nghiệm trồng lan tiến tới pháttriển nhân rộng, sản xuất theo hướng hàng hóa Hiện nay mỗi năm Đà Lạt mới chỉ sảnxuất khoảng 200.000 đơn vị lan cắt cành (Cao Liên - Việt Nam Hương sắc T8/2004) Trong những tháng đầu năm 2007, mặc dù kim ngạch xuất khẩu lan cắt cành đãgiảm đáng kể so với những tháng trước nhưng vẫn ở mức khá cao Theo số liệu thống

kê của Tổng cục Hải quan kim ngạch nhập khẩu phong lan cắt cành qua đường chínhngạch của nước ta trong tháng 02/2007 là 26,515 nghàn USD, giảm 20,17% so vớitháng 01/2007 nhưng vẫn tăng 51,76% so với tháng 12/2006 Thị trường xuất khẩu hoa

lan cắt cành chính của Việt Nam trong thời gian qua là Thái Lan với gần 100% lượnglan cắt cành (http://www.haiphong.gov.vn).

Mới đây Thành phố Hồ Chí Minh dự kiến, giai đoạn 2006 – 2007 thực hiện đầu

tư 20 hecta nuôi trồng hoa lan và 22 hecta trồng cây kiểng Đặc biệt phải kể đến trangtrại RISUN tại Gia Hiệp – Di Linh – Lâm Đồng đã đầu tư trang thiết bị hiện đại có thể

tự tạo ra nguồn cây giống để sản xuất Sản phẩm đặc biệt ở đây là lan Hồ điệp với 16 –

17 màu khác nhau Trang trại đó đầu từ 10.000m2 diện tích nuôi trồng hiện đại, cungcấp 40.000 chậu lan Hồ điệp mỗi năm Ngoài tiêu thụ trong nước lan Hồ điêp của trangtrại cũn xuất khẩu sang Mỹ, Nhật, Đông Nam Á và các nước Châu Âu

Mặc dù nước ta có điều kiện thuận lợi hơn cả Thái Lan với miền Nam khí hậu giómùa ổn định, nhưng giá trị xuất khẩu hoa lan của Việt Nam cũng rất khiêm tốn, từ 1998– 2003 chỉ đạt 90.000 – 150.000 USD/năm Đối với thị trường hoa trong nước, sảnlượng hoa phong lan cũng không đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng Các cơ sởsản xuất hoa lan chỉ đáp ứng được 30 – 40% nhu cầu lan cắt cành, ngoài ra cũng phảinhâp từ các nước khác Hiện nay sở Khoa học Công nghệ và Môi trường của tất cả cáctỉnh thành phố phía Bắc đều có phòng nuôi cấy mô tế bào, chức năng chính là để phục

vụ cho nghiên cứu khoa học, một phần phục vụ sản xuất giống cung cấp cho thị trườngtrong đó có sản phẩm là hoa lan (Vũ Thị Hoài, 2006)

Ở Hà Nội, những năm gần đây, khi đời sống người dân Thủ đô nâng cao, nhu cầuthưởng thức hoa lan tăng, phong trào nuôi trồng lan tự phát lan rộng cả đến các vùngphụ cận khiến các nhà khoa học phải vào cuộc, đi sâu nghiên cứu và sản xuất, kinhdoanh hoa lan

Tại Viện sinh học Nông nghiệp thuộc Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã

cho ra đời hàng vạn cây giống hoa lan có giá trị kinh tế như Hồ điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Lan thỏi (Dendrobium)…Ngoài ra Viện cũng làm cố vấn kỹ thuật,

chuyển giao quy trình nuôi trồng một số giống lan có hiệu quả kinh tế ở các tỉnh nhưHải Phòng, Bắc giang, Lạng sơn…

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự tại Viện sinh họcNông nghiệp về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trong nhân giống lan Hồ Điệp thì

giai đoạn vào mẫu môi trường thích hợp cho sự phát sinh hình thái mẫu là : VW +100ml nước dừa+10g đường + 2mg BA + 0.3mg K +6.5g Agar Giai đoạn nhân nhanhmôi trường thích hợp là: VW + 100ml nước dừa+10g đường + 1mg BA +1g pepton +6.5g agar ( Nguyễn Quang Thạch, 2005)

Tóm lại, ngành sản xuất hoa lan ở các tỉnh, thành phố phía Nam phát triển mạnh hơn

ở miền Bắc, sản phẩm bước đầu đã có xuất khẩu (chủ yếu là hoa lan cắt cành) Miền bắccũng đang khởi sắc, các nghiên cứu về lĩnh vực trồng hoa khá phong phú, đa dạng bướcđầu đã áp dụng vào sản xuất Những hoạt động sản xuất - kinh doanh - xuất khẩu hoa lan ởViệt Nam trong thời gian qua hứa hẹn một sự phát triển trong tương lai dựa trên những điềukiện thuận lợi sẵn có cho sự phát triển ngành trồng lan

1.5 Những vấn đề còn tồn tại và những vấn đề mà đề tài luận văn tập trung nghiên cứu giải quyết

Trên thế giới việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống invitro hoaphong lan đã có những bước phát triển từ rất lâu Một số nước như: Thái Lan, TrungQuốc, Singapo, Đài Loan đã trở thành các cường quốc về nghiên cứu và sản xuấthoa phong lan ( Nguyễn Quang Thạch, 2005)

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất hoa lan ở một số tỉnh phía Bắc và đặcbiệt là phía Nam đã có những nghiên cứu bước đầu song còn nhiều hạn chế do thiếuvốn và cơ sở vật chất khoa học kỹ thuật

Hà Tĩnh là một tỉnh đã có phòng nuôi cấy mô tế bào từ năm 1994 tại sở khoahọc công nghệ Ở đây, đã có nhiều đề tài nghiên cứu có tính ứng dụng cao trong sảnxuất giống cây trồng như:Trầm Hương, Chuối, Keo, Hoa Đồng Tiền Hiện nay, tạivùng Bắc Trung Bộ cũng như ở Hà Tĩnh việc nghiên cứu và sản xuất hoa lan cònchưa phát triển

Các công trình nghiên cứu hoa lan trong nước về ảnh hưởng của môi trườngnuôi cấy còn nhiều hạn chế Trên cơ sở đó, trong đề tài này chúng tôi đi sâu nghiêncứu về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy trong nhân giống invitro lan Vũ Nữ gópphần vào sự phát triển về nghành công nghiệp sản xuất hoa lan ở Hà Tĩnh cũng nhưkhu vực Bắc Trung Bộ