Góp phần nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro

Tr-ờng Đại Học Vinh Khoa Sinh Học Góp phần hoàn tiện quy trình nhân nhanh giống hoa đồng tiền gerbera công nghệ nuôi cấy mô invitro Luận văn tốt nghiệp đại học Ngành cử nhân s- phạm sinh học Ng-ời thực hiện: Trần Nữ Thanh Xuân Ng-ời h-ớng dẫn: Th.S Mai Văn Chung Vinh , 2006 Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài này, nỗ lực thân, xin chân thành cảm ơn bảo, giúp đỡ tận tình Thầy giáo, Th.S Mai Văn Chung, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào, ý kiến đóng góp quý báu thầy giáo, cô giáo tổ môn Sinh lý- Sinh hoá thực vật, tạo điều kiện ủng hộ khoa, cán phòng thí nghiệmNuôi cấy mô, tế bào thực vật giúp đỡ, cung cÊp t- liƯu, mÉu vËt cđa nh©n d©n hun Nghĩa Đàn Lần tham gia nghiên cứu khoa học không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đ-ợc ý kiến đóng góp thầy cô bạn bè để đề tài nghiên cứu khoa học đ-ợc hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn Tác giả Những chữ viết tắt sử dụng luận văn NCM - TB : Nuôi cấy mô - tế bào CNSH : Công nghệ sinh học IAA : Axit - indol axetic NAA : Axxit - naphtyl axetic IBA : BA/BAP : benzyl adenin(6 benzyl amino purin) GA : Gibberelin K : Kinetin MS : Murashige – Skoog 1962 Ppm : part per million(phÇn triƯu) mM : milimol Mở đầu Lý chọn đề tài Ngày nay, sử dụng hoa sinh hoạt công tác hàng ngày đà trở thành thói quan tót,tạo nên nét văn hoá th-ởng ngoạn, giải trí nh- tiêu dùng Hoa đà trở nên quen thuộc cần thiết sống hàng ngày ng-ời.Để đáp ứng đ-ợc nhu cầu tiêu thụ hoa ngày tăng, nhiều giống hoa, loại hoa mới, có giá trị thẩm mĩ, giá trị kinh tế giá trị văn hoá đ-ợc đ-a vào sản xuất quy mô lớn, dùng nhiều ph-ơng thức tạo giống khác nhau, đó, Nuôi cấy mô - tế bào thực vật invitro đ-ợc đánh giá ph-ơng pháp tiên tiến, -u việt Trong loại hoa đ-ợc -a chuộng giới nay, Đồng tiền(gerbera) đ-ợc coi 10 loài hoa đẹp nhÊt, chØ xÕp sau hoa hång, lay ¬n, cóc, cÈm ch-ớng Đồng tiền loại hoa có nhiều -u điểm bật: hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa đẹp, cho suất cao, nên ngày đ-ợc ng-ời tiêu dùng -a chuộng Song khó khăn sản xuất hoa đồng tiền nguồn giống cung cấp cho trình trồng trọt chủ yếu tách thân, sinh tr-ởng mạnh giai đoạn đầu nh-ng sau sinh tr-ởng chậm, nhanh già cỗi, suất thấp, chất l-ợng sản l-ợng hoa không cao, không ổn định Bên cạnh đó,bằng ph-ơng pháp tách thân, số l-ợng giống lần tạo không nhiều,do không đủ đáp ứng nhu cầu thị tr-ờng sản xuất.[ ] Ph-ơng pháp nhân giống vô tính invitro đà bổ sung cho kĩ thuật tạo giống cách tách thân sản xuất hoa đồng tiền ngày đ-ợc ý phát triển kỹ thuật nhân giống vô tính invitro cho phép sản xuất giống đòng tiền khoẻ mạnh, bệnh, có đọ đồng cao va chất l-ợng tốt Hiện Việt Nam đà có nhiều nghiên cứu quy trình nhân giống vô tính loại hoa đa đ-ợc công bố ứng dụng.[ ].Tuy nhiên việc tiếp tục hoàn thiện nh- đề xuất quy trình kỹ thuật cho giống hoa thực cần thiết Từ sở lý luận thực tiễn đó, thực đề tài Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa đồng tiỊn - gerbera b»ng c«ng nghƯ nu«i cÊy m« - invitro Mục đích đề tài áp dụng sở khoa học công nghệ vi nhân giống để nhân nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh cây, nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiền này, Nội dung đề tài nghiên cứu tim điều kiện nuôi cấy invitro thích hợp giai đoạn xử lý mẫu, nhân chồi invitro, rễ, tạo hoàn chỉnh, huấn luyện thích nghi,từ đề xuất quy trình nhân giống hoàn thiện hoa đồng tiền CHƯƠNG I: tổng quan tài liệu 1.1 Cơ së khoa häc cđa nu«i cÊy m« invitro[ ] 1.1.1 Tính toàn tế bào thực vật Theo Habertland, tế bào thể sinh vật mang toàn l-ợng thông tin di truyền cần thiết đủ sinh vật Khi gặp điều kiện thuận lợi, tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Tính toàn tế bào mà Habertland đ-a sở lý luận Nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến ng-ời đà hoàn toàn chứng minh đ-ợc khả tái sinh mọt thể thực vật từ tế bào riêng rẽ Quá trình phát sinh hình thái nuôi cấy mô tế bào thực vật invitro thực chất kết phân hoá phản phân hoá tế bào[] 1.1.2 Phân hoá phản phân hoá tế bào Tất loại tế bào thể sinh vật bắt nguồn t- tế bào phôi sinh, từ tế bào phôi sinh chuyển thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhận chức khác Đó gọi sơ phân hoá tế bào Tuy nhiên tr-ờng hợp cần thiết diều kiện định, tế bào mô chuyên hoá lại trở dạng tế bào phôi sinh lại có khả phân chia mạnh mẽ Quá trình đ-ợc gọi phản phân hoá tế bào.[] 1.1.3 Môi tr-ờng nuôi cấy [ ] Môi tr-ờng nuôi cấy điều kiện đặc biệt cần thiết , định đến phân hoá tế bào quan nuôi cấy Môi tr-ờng nuôi cấy phải có đầy đủ chất dinh d-ỡng cần thiết cho phân chia, phân hoá tế bào nh- hco trình sinh tr-ởng bình th-ờng Thành phần môi tr-ờng nuôi cấy thay đổi tuỳ đối t-ợng nuôi cấy, phận nuôi cấy, tuỳ thuộc giai đoạn phát triển mục đích nuôi cấy: tạo rễ, tạo mầm, tái sinh hay muốn giữ trạng thái mô sẹo Tuy nhiên tất môi tr-ờng nuôi cấy có thành phần : _ Nguồn carbon (th-ờng đ-ờng) _ Khoáng đa l-ợng _ Khoáng vi l-ợng _ Vitamin _ ChÊt ®iỊu tiÕt sinh tr-ëng Cã thĨ bỉ sung thêm số hợp chất : axit amin, EDTA, n-íc dõa hay dÞch chiÕt nÊm men, a Đ-ờng Đ-ờng nguồn cung cấp carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên chất hữu giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối mô nuôi cấy nhân tạo Các loại đ-ờng th-ờng dùng saccaroze va glucoze nh-ng saccaroze đ-ợc dùng phổ biến Nồng độ đ-ờng thay đổi từ 1-6%, thông dụng 2-3 % b Các khoáng đa l-ợng + Nitơ : Cây sử dụng đ-ợc d-ới hai dạng NH4+ NO3- với tỷ lệ tuỳ loại tuỳ giai đoạn phát triển Nitrat đ-ợc cung cấp chủ yếu d-ới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 NH4NO3, (NH4)2SO4 số tr-ờng hợp d-ới dạng ure Nồng độ môi tr-ờng khoảng 3-6 mM + L-u huỳnh ( S ) L-u huỳnh đ-ợc hấp thu d-ới dạng SO42-; SO32- SO2 th-ờng gây độc cho L-u huỳnh tham gia vào cấu trúc số loại axit amin tham gia vào trình khử, tổng hợp chất hữu t-ơng ứng, ngoàI ra, l-u huỳnh điều tiết trình trao đổi chất l-ợng, xây dựng chÊt kh¸ng sinh, vitamin, +Kali ( K ) Cung cấp cho d-ới dạng KNO3, KCl, KH2PO4, với nồng độ biến thiên từ 2-25 mM, trung bình khoảng 10 mM + Magie ( Mg ) Mg đ-ợc cung cấp cho d-ới dạng MgSO4.7H2O, nồng độ 0,5-3 mM Trong tế bào, Mg có vai trò xúc tác cho nhiều hệ enzim quan trọng, cầu nối enzim chất, làm tăng hoạt tính enzim, Mg ảnh h-ởng đến trình hấp thu, đồng hoá P, O2, + S¾t ( Fe ) Trong môi tr-ờng cổ điển, dùng Fe d-ới dạng FeCl 2.FeCl3.6H2O; FeSO4.7H2O; Fe2(SO4)2; Fe(C4H4O), cßn hiƯn dïng Fe ë dạng EDTA, dạng Fe không bị kết tủa mà giải phóng dần môi tr-ờng tuỳ nhu cầu mô thực vật +Canxi ( Ca ) Đ-ợc cung cấp cho d-ới dạng Ca(NO3).4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O, nồng độ 1-3,5 mM c Các khoáng vi l-ợng Các nguyên tố vi l-ợng đ-ợc tìm thấy d-ới dạng phức chất hữu cơ- khoáng, phức chất tham gia vào phản ứng mà thân chất thành phần tham gia đ-ợc Đặc biệt vai trò nguyên tố vi l-ợng quan trọng tham gia vào cấu trúc enzim tham gia vào tất trìng sinh tổng hợp chuyển hoá chất tế bào, nói nguyên tố vi l-ợng sở sống Bảng : Một số nguyên tố vi l-ợng th-ờng dùng [] Nguyên tố Dạng sử dụng Nồng độ (mM) Mn MnSO4.4H2O 15-100 B H3PO3 6-100 Zn ZnSO4.7H2O 15-30 Cu CuSO4.5H2O 0,04-0,08 Mo (NH4)6Mo7O24.4H2O NaMoO4.2H2O 0,07-1 Co CoCl2.6H2O 0,1-0,4 I KI 2,5-20 d Các vitamin Mặc dù tất loại mô tế bào thực vật nuôi cấy invitro có khả tổng hợp đ-ợc hầu hết vitamin nh-ng th-ợng không đủ l-ợng, cần phải bổ sung thêm từ bên vào, vitamin nhóm B Bảng : Một số vitamin th-ờng đ-ợc dùng môi tr-ờng nuôi cấy [ ] Tên vitamin Nồng độ sư dơng (mg/l) Myo_Inositol 100 Axit nicotinic ( niaxin ) 0,5-1 Pyridoxine HCl ( vitamin B6 ) 0,05-0,5 Thiamine HCl ( B1 ) 10-50 Pandothenat canxi 1-5 Riboflavin ( B2 ) 1-5 Biotin 0,1-1 Axit folic 0,1-1 C¸c vitamin th-ờng đ-ợc pha hỗn hợp dung dịch mẹ có nồng độ cao gấp 500 đến 1000 lần so với dung dịch lam việc, cần giữ điều kiện lạnh d-ới 0oC để tránh nấm khuẩn nhiễm tạp e Các chất điều khiển sinh tr-ởng Bảng : Một số chất điều khiển sinh tr-ởng th-ờng dùng [ ] Tên chÊt sinh tr-ëng Nång ®é sư dơng ( mg/l ) 2,4 D [dichlorophenoxy axetic] 0,2-5 _NAA [ naphtylaxetic axit] 0,1-5 _NAA [ indol axetic axit] 5-20 IBA [ indol butyric axit] 1-5 Kinetin [6 finfurylaminopurine] 0,1-2 BA [ 6_BAP ][ benzyl amino purine] 0,1-2 2_iP [ N6 _ Dimetylallylaminopurine] 0,1-2 0,1-2 GA [ Gibberelic axit ] Th-êng pha c¸c dung dịch mẹ chất sinh tr-ởng có nồng độ cao gấp 1000 lần so với dung dịch làm việc g Các hỗn hợp chất tự nhiên + N-ớc dừa: Từ 1941, n-ớc dừa đà đ-ợc sử dụng để nuôi phôi Daruta năm 1949 nuôi mô Daucus L-ợng n-ớc dừa dùng môi tr-ờng lớn, 10-20 % thể tích môi tr-ờng + Dịch chiết nấm men Là chÕ phÈm th-êng dïng nu«i cÊy vi sinh vËt, mô tế bào động vật 1934,White lần đà nuôi cấy thành công rễ cà chua ống nghiệm kéo dài vô thời hạn dịch chiết nấm men Thành phàn 10 _ Độ ẩm giá thể: 65-80% _ Nguồn khoáng bổ sung dung dịch NPK với tû lƯ 1:1:1 víi nång ®é 2% phun trùc tiÕp lên Các tiêu theo dõi: _ Tỷ lệ sống thích nghi với môi tr-ờng _ Các tiêu hình thái: chiều cao cây, số lá/cây, màu sắc lá, phát triển rễ, 2.3.6 Ph-ơng pháp xử lý số liệu Số liệu đ-ợc xử lý toán thống kê: - Giá trị trung bình: X = xi (i số lần thực thí nghiệm) n - Độ lệch chuẩn: 21 Ch-ơng III: kết nghiên cứu bàn luận 2.3 Kết nghiên cứu giai đoạn vào mẫu Chồi đỉnh đồng tiền đ-ợc lấy từ giống trồng nhà l-ới vào thời điểm râm mát, tr-ớc ngày m-a để hạn chế nhiễm khuẩn Mẫu đ-ợc làm sơ chất tẩy rửa, rửa d-ới vòi n-ớc chảy Sau xử lý cồn 700 thời gian phút, mẫu đ-ợc khử trùng loại hoá chất có nồng độ thời gian khác Kết giai đoạn khử trùng mẫu cấy gây thể bảng Bảng 1: Kết xử lý mẫu đồng tiền Công Hoá thức M1 M2 M3 M4 Nồng độ Thời gian Tỉng chÊt xư lý H2O2 15% 10 HgCl2 0,1% 10phót H2O2 15% 15 HgCl2 0,1% 10phót H2O2 15% 15 HgCl2 0,1% 15phót NaOCl 10% 10 NaOCl 5% 8phót NaOCl 1% Sè mÉu Sè mÉu sè nhiÔm bËt mÉu chÕt(%) chåi(%) 30 28(93,3%) 2(6,7%) 30 17(57%) 30 25(83,3%) 5(16,7%) 30 25(83,3%) 5(16,7%) 13(43%) M«i tr-êng đ-ợc sử dụng để cấy gây môi tr-ờng dinh d-ìng MS + 50g/l sacaroza + 6g/l ©gar + 2mg/l BAP Kết bảng cho thấy: _Công thức khử trïng M1 : H2O2 15 % 10 vµ HgCl2 0,1% 10 phót, 30 mÉu xư lý, chØ cã mÉu sèng( chiÕm tû lÖ 6,7 %), 22 28 mẫu lại chết nhiễm nÊm,trong sè 28 mÉu cã 20 mÉu nhiƠm nÊm vµ vi khuÈn ( chiÕm tû lÖ 66,7 % ) chøng tỏ hiệu khử trùng công thức yếu, không loại trừ hết nấm vi khuẩn mẫu cấy gây _ Công thức khử trùng M2 : H2O2 15% 15 vµ HgCl2 0,1 % 10 phút, kết thông kê cho thấy công thức cho kết khử trùng tốt Trong 30 mẫu xử lý có 13 mẫu sống, nảy chồi đẹp(43%), công thức cho tỷ lệ mẫu bật chồi cao nhÊt(22 mÉu bËt chåi chiÕm tû lƯ 73%), ®ã cã nhiỊu mÉu bËt 2-3 chåi.Sè mÉu nhiƠm vµ chÕt chiếm tỷ lệ 57%, số mẫu chết mÉu chiÕm tû lƯ 27%, mÉu bÞ nhiƠm(30%) _ C«ng thøc khư trïng M3: H2O2 15% 15 phút HgCl2 0,1 % 15 phút, kết cho thÊy 30 mÉu cÊy g©y cã 10 mÉu nảy chồi ( 33,3%)trong có mẫu không bị nhiễm (16,7%) ,20 mẫu bị hoá nâu sau 2-3 ngày nuôi cấy(66,7%).Nh- tăng thời gian xử lý HgCl2 có ảnh h-ởng xấu đến chồi invitro,làm chết mẫu cấy gây, thpì gian mẫu nảy chồi chậm ( sau tuần có dấu hiệu nảy chồi).Xử lý HgCl lâu ảnh h-ởng không tốt đến chất l-ợng mẫu cấy gây _ Công thức khử trùng M4 : Thay đổi hoá chất khử trùng NaOCl , với lần khử trùng với nồng độ thời gian xử lý giảm dần , sau lần xử lý mẫu đ-ợc rửa bóc dần lớp bao bọc phía ngoài, sau lần xử lý lại đỉnh sinh tr-ởng tiến hành cấy vào môi tr-ờng.Kết cho thấy 30 mẫu xử lý có mẫu sống phát triển tèt(16,7%), sè mÉu n¶y chåi nhiỊu(17 mÉu chiÕm tû lƯ 57%) nh-ng bị nhiễm nấm, vi khuẩn.Nh- NaOCl có tính khử trùng yếu, không đủ để tiêu diệt hết vi khuẩn nấm mẫu cấy gây, không thích hợp để khử trùng chồi đỉnh ngän ®ång tiỊn NhËn xÐt: Khi khư trïng b»ng H2O215% 10 vµ HgCl2 0,1 % 10 cho kết không tốt, nh-ng tăng nồng độ H2O2 15% lên 15 phút cho 23 kết tốt hẳn,chứng tỏ H2O2 thích hợp để khử trùng chồi đỉnh đồng tiền,còn tăng thời gian xử lý HgCl 0,1 % lên 15 phút co nhiều mẫu chết, xử lý HgCl2 lâu ảnh h-ởng không tốt đén sức sống khả phát triển chồi invitro tinh khử trùng HgCl mạnh làm chết chồi Qua công thức khử trùng với hoá chất khử trùng có nồng độ thời gian khác nhau, nhận thấy công thức khử trùng cho hiệu tốt công thức khử trùng kép: H2O2 15% 15 HgCl2 0,1 % 10 3.2 Kết nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh giai đoạn này, nghiên cứu ảnh h-ởng loại chất điều tiết sinh tr-ởng khác đến tỷ lệ phát triển chồi invitro thông qua hệ số nhân nhanh hình thái chồi invitro số chồi sau thời gian nuôi cấy Hệ số nhân chồi = số chồi ban đầu Môi tr-ờng nuôi giai đoạn nhân nhanh môi trowngf dinh d-ỡng MS + 50g/l saccaroza + 6g/l agar + 10% n-íc dõa Các công thức khác loại chất điều tiết sinh tr-ởng nồng độ chúng.Kết nghiên cứu giai đoạn đ-ợc thể bảng 2: Bảng : ảnh h-ởng chất điều tiết sinh tr-ởng lên phát triên chồi invitro Công Nồng độ Sè Sau tuÇn 24 Sau tuÇn Sau tuần thức chất ĐTST mẫu Số Hệ số Số chồi nh©n HƯ sè Sè chåi nh©n chåi HƯ sè chåi nh©n chåi chåi N1 1,5mg/lBAP 50 90 1,80 120 2,4 140 2,80 N2 1,5mg/lBAP+ 50 71 1,42 102 2,04 136 2,72 90 1,80 131 2,62 150 3,00 78 1,56 104 2,08 114 2,28 50 87 1,74 112 2,24 128 2,56 50 103 2,06 110 2,20 114 2,28 0,2mg/lIAA 1,5mg/lBAP+ 50 N3 0,5mg/lIAA 1,5mg/lBAP+ 50 N4 1,0mg/lIAA 5mg/lK N5 +0,5mg/lIAA 5mg/lK N6 +1,0mg/lIAA Nhận xét _ Công thức nhân nhanh N1: Chỉ dùng BAP 1,5 mg/l chất ĐTST , kết cho thấy chịu ảnh h-ởng tốt từ BAP, thể hệ số nhân chồi t-ơng đối cao, tăng qua thời điểm nghiên cứu.BAP loại chÊt kÝch thÝch sù ph©n chia chåi, ngän, thÝ nghiƯm với công thức N1 cho thấy chồi đỉnh đồng tiền đà sinh tr-ởng phát triển tốt môi tr-ờng có BAP _ Công thức nhân nhanh N2: Kết hợp BAP 1,5mg/l 0,2 mg/l IAA nhằm nghiên cứu ảnh h-ởng tổng hợp BAP IAA đến phát sinh phát triển chồi invitro.Kết cho thấy tuần đầu, chồi phát triển chậm, hệ số nhân chồi đạt 1,42, thấp tất môi tr-ờng bố trí.Sang tuần 3, hệ số nhân chồi đà tăng đáng kể (2,04 2,73 ), chứng tỏ IAA đà có tác dụng tốt phát triển chồi invitro,song ảnh h-ởng thể sau thời gian định 25 _ Công thức nhân nhanh N3: 1,5mg/l BAP IAA 0,5 mg/l, kết cho thấy công thức đạt kết tốt nhất, hệ số nhân chồi cao với giá trị 1,81; 2,63; 3,00 t-ơng ứng với thời điểm nghiên cứu, hệ số nhân chồi hệ số nhân chồi cao so với công thức lại.Chứng tỏ việc tăng nồng độ IAA môi tr-ờng phù hợp phát triển chồi invitro _ Công thức nhân nhanh N4: 1,5 mg/l BAP 1,0 mg/l IAA.Kết cho thấy việc tiếp tục tăng l-ợng IAA công thức lại ảnh h-ởng không tốt đến phát triển chồi invitro, hệ số nhân chồi thấp so với công thức N3( qua thời điểm thống kê 1,56; 2,08; 2,28) Nh- nồng độ 1,0 mgl/l IAA đ-ợc đánh giá không cao, không thích hợp để sử dụng môi tr-ờng nhân nhanh chồi đồng tiền invitro _ Công thức nhân nhanh N5: Kinetin BAP hai loại chất ĐTST thuộc nhóm xitokinin, môi tr-ờng N5, BAP đ-ợc thay Kinetin với nồng độ 5mg/l Kết cho thấy thời gian đầu phát triển tốt, hệ số nhân chồi cao: 1,5 lần sau tuần 2,25 lần sau tuần Tuy sau đó, chồi đà phát triển yếu đi, quăn bắt đầu úa, sau tuần hệ chồi đạt 2,56 Nh- vậy, Kinetin có ảnh h-ởng tốt gian đoạn đầu l-ợng Kinetin môi tr-ờng không đủ cho phát triển sau thời gian tuần _Công thức nhân nhanh N6: Tăng gấp đôi l-ợng Kinetin môi tr-ờng nuôi cấy so với công thức 5, tuần đầu phát triển tốt, hệ số nhân cao công thức môi tr-ờng (2,07) Nh-ng sang tuần thứ số chồi tăng không đáng kể phát triển yếu nảy chồi, hệ số nhân có tăng nh-ng rÊt chËm (2,21 vµ 2,29) + NhËn xÐt vỊ hình thái Invitro chúng tối đánh giá hình thái chồi invitro công thức môi tr-ờng có hệ số nhân chồi cao mục đích toàn quy trình tạo gia số l-ợng giống tối đa thời gian ngắn 26 - Công thức nhân nhanh N1: Chỉ sử dụng BAP 1,5mg/l chất kích thích phát triển, có hình thái thấp không v-ơn cao, phiến mọc thẳng đứng dài xoăn, lợi cho hấp thu ánh sáng, ảnh h-ởng xấu đến trình quang hợp Nh- riêng BAP chất ĐTST, kích thích phát triển chồi đồng tiền invitro ch-a đủ, chồi invitro có chất l-ợng ch-a cao - Công thức nhân nhanh N2: Cho hệ số nhân chồi thấp nhất, thời gian đầu , ph¸t triĨn u Sau mét thêi gian , c¸c mÉu phục hồi dần, chồi khoẻ, cọng to, có màu xanh đậm, cọng v-ơn cao, chồi phát triển đều.Môi tr-ờng nhân nhanh N2 đảm bảo cho invitro có sức sống tốt, phục hồi tổn th-ơng nhanh chóng - Công thức nhân nhanh N3: Cho hệ số nhân chồi cao nhất, chồi Invitro phát triển nhỏ cọng to màu xanh nhạt Đặc điểm bật công thức môi tr-ờng N3 số l-ợng chồi non nhiều mọc nhanh từ chồi cấy gây, phiến nhỏ dày Công thức môi tr-ờng N3 đáp ứng đ-ợc yêu cầu giai đoạn nhân nhanh: cho hệ số nhân chồi cao, tạo số l-ợng giống lớn thời gian ngắn, chứng tỏ kết hợp BAP nồng độ 1,5mg/l IAA nồng độ 0,5mg/l kích thích nảy chồi tốt Nhận xét chung: Qua nghiên cứu hệ số nhân chồi nh- đặc điểm hình thái cậy invitro d-ới ảnh h-ởng chất ĐTST thấy môi tr-ờng tốt cho phát triển chồi invitro giai đoạn nhân nhanh lµ: MS + 50g/l Saccaroza + 6g/l aga + 10% n-íc dõa + 1,5mg/lBAP + o.5mg/l IAA 3.3 KÕt nghiên cứu giai đoạn rễ tạo hoàn chỉnh giai đoạn nghiên cứu ảnh h-ởng chất ĐTST NAA lên rễ, hình thành hoàn chỉnh chồi invitro Các tiêu đ-ợc đánh giá - Số rễ trung bình/cây - Chiều dài trung bình rễ 27 - Số trung bình - Môi tr-ờng để nghiên cứu giai đoạn là: MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 10% n-íc dõa + 0,5g/l than hoạt tính Các công thức môi tr-ờng khác nồng độ NAA sử dụng Bảng : ảnh h-ởng NAA đến rễ chồi invitro Công Chất Số thức mẫu Số ĐTST Sau tuần Sau tuần Độ dài Số rễ/cây rễ(mm) Số Độ dài Số rễ/cây rễ(mm) lá/ R1 0,5mg/l 50 0,2 1,5 4,33 1,4 8,5 5,02 50 0,42 6,2 3,86 1,39 18.7 4,52 50 0,3 1,2 3,28 1,3 7,9 3,88 NAA R2 1mg/l NAA R3 1,5mg/l NAA + NhËn xÐt rễ phát triển _ Công thøc R1 : Sư dơng NAA víi nång ®é 0,5mg/l, công thức cho kết đẹp, phát triển tốt, nh-ng hệ rễ lại phát triển Số l-ợng rễ cao (1,4 rễ/cây) nh-ng chiều dài rễ phát triển, chiều dài trung bình rễ sau tuần đạt 8,5mm Điều cho thấy nồng độ NAA môi tr-ờng ít, ch-a đủ để kích thích cậy invitro phát triển _ Công thức R2: Tăng nồng độ NAA lên 1mg/l cho kết giai đoạn rễ tốt Rễ bật sớm, phát triển mạnh nhanh, đặc biệt chiều dài (6,2mm sau tuần 18.7mm sau tuần) phát triển t-ơng đối tốt _ Công thức R3 : Tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 1,5mg/l sau tuần cho thấy rễ phát triển t-ơng đối tốt, rễ ngắn (3 có rễ chiều dài 1,2mm) Sau tuần số rễ tăng đáng kể (1,3 rễ/cây), chiều dài trung bình rễ 7,9mm Tuy nhiên công thức môi tr-ờng lại cho kết 28 tiêu nghiên cứu thấp nhất, có thấy nồng độ NAA cao dẫn đến ức chế phát triĨn cđa rƠ vµ chåi invitro + NhËn xÐt vỊ đặc điểm hình thái _ Công thức R1: NAA nồng độ 0,5mg/l , chồi môi tr-ờng chậm rễ, nh-ng rễ phát triển khoẻ, to nhiều, nâng lên khỏi bề mặt thạch cua môi tr-ờng.Tuy nhiên alị phát triển không đều, khẳng khiu, nhiều chồi non _ Công thức R2: NAA nồng ®é 1mg/l, rƠ bËt chËm nh-ng sau xt hiƯn rễ phát triển nhanh, đặc biệt chiều dài, số rễ có rễ phụ, phát triển tốt, to, đẹp _ Công thức R3: NAA 1,5mg/l , cho rƠ bËt sím, mét sè c©y chØ sau ngày nuôi đà thấy xuất rễ, rễ to, mập song phát triển chậm, lúc đầu phát triển tốt, sau thời gian phát triển đi, sức sống giảm, ít, vàng, chồi yếu + Nhận xét: Từ kết nghiên cứu trên, đ-a môi tr-ờng tạo rễ cho chồi đồng tiền invitro , tạo hoàn chỉnh nh- sau: MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 10% n-íc dõa + 0,5 g/l than ho¹t tÝnh + 1mg/l NAA 3.4 Kết nghiên cứu giai đoạn huấn luyện, thích nghi giai đoạn này, tập trung nghiên cứu loại giá thể phù hợp cho páht triển chồi exvitro thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Các tiêu nghiên cứu là: _ Tỷ lệ sống _Chiều cao trung bình củacây Các thí nghiệm đ-ợc bố trí điều kiện độ ẩm không khí 80-85% , độ ẩm giá thể 65-80%, đ-ợc che m-a , che nắng l-ới phản quang, 29 bổ sung nguồn khoáng cho cách phun lên dung dịch dinh d-ỡng chứa NPK với tỷ lệ nồng độ 1:1:1 Kết nghiên cứu giai đoạn thể bảng Bảng : ảnh h-ởng loại giá thể đến sinh tr-ởng đồng tiền Giá thể Độ ẩm Số giá Tỷ lệ Chiều cao Số lá/cây sống (sau tuần) thể(%) Cát 75-80 100 94 61,5 6,22 TrÊu 65-70 100 62 35,7 4,18 + 70-75 100 81 44,0 4,65 hun C¸t trÊu hun + NhËn xÐt _ Đối với giá thể cát, tiêu nghiên cứu sinh tr-ởng đồng tiền v-ợt trội hẳn so với giá thể khác.Tỷ lệ sông thích nghi tốt với môi tr-ờng cao (94%), chiều cao tính từ gốc đến đỉnh cao 61,5 mm, t-ơng đ-ơng với chiều cao trồng tự nhiên thời gian đ-ợc chăm sóc tốt.Số trung bình đạt 6,22 lá/ cây, dày, xanh, sinh tr-ởng khoẻ, sức sống cao _ Đối với giá thể trấu hun, độ ẩm thấp không trì đ-ợc lâu,nên phát triển yếu, 62% sống, cao đ-ợc 36,7 mm trung bình có 4,18 lá/cây, rễ phát triển kém, còi cọc, sức sống _ Đối với giá thể hỗn hợp cát trấu hun, tỷ lệ sống t-ơng đối cao(81%), cao 41mm trung bình 4,56 lá/cây, yếu, nảy Nh- điều kiện huấn luyện với độ ẩm không khí 80-85%, độ ẩm giá thể đạt 75-80%, bổ sung nguồn khoáng dung dịch dinh d-ỡng chứa 30 NPK tỷ lệ 1:1:1 phun lên lá, đồng tiền thích nghi với giá thể cát Nhận xét chung: Từ thí nghiệm đ-ợc bố trí, sau tìm điều kiện thich hợp giai đoạn vào mẫu cấy gây, nhânh nhanh, rễ tạo hoàn chỉnh ,và huấn luyện thcíh nghi giống hoa đồng tiền, đề nghị quy trình nhân giống invitro giống hoa nh- sau: Quy trình Điều kiện nuôi cấy Cây giống Chồi đỉnh -Công thức khử trùng: Cồn 700 phút Giai đoạn vào mẫu H2O2 15 % 15 HgCl2 Thêi gian cÊy g©y tuần Mẫu invitro Giai đoạn nhân nhanh _ Môi tr-êng nh©n nhanh:MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 10% n-íc dõa +1,5mg/l BAP + 0,5mg/l IAA Thêi gian nhân nhanh tuần Chồi invitro 31 _ Môi tr-ờng rÔ: MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 10% Giai đoạn rễ n-ớc dừa +0,5g/l than hoạt tÝnh + 1mg 1mg/l NAA Thêi gian rÔ: tuần Cây hoàn chỉnh _ Công thức giá thể Giai đoạn huấn luyện Cát + dung dịch dinh d-ỡng NPK 1:1:1 Thời gian huấn luyện tuần V-ờn -ơm kết luận đề nghị A Kết luận _ Từ kết thu đ-ợc, đè xuất quy trình nhân giống invitro hoa đồng tiền nh- sau: a Giai đoạn vào mẫu, cấy gây Chồi đỉnh tr-ớc đ-ợc đ-a vào nuôi cấy invitro đ-ợc khử trïng kÐp sau khư trïng s¬ bé b»ng cån700 H2O215% 15phót HgCl2 0,1% 10 M«i tr-êng cÊy g©y : MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 2mg/l BAP Thêi gian cÊy g©y : tuần b Giai đoạn nhân nhanh Môi tr-ờng nhân nhanh cho chồi đồng tiền invitro 32 MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 10% n-íc dõa + 1,5mg/l BAP + 0,5mg/l IAA Thêi gian nh©n nhanh : tuần c Giai đoạn rễ tạo hoàn chỉnh Môi tr-ờng tạo rễ cho chồi đồng tiền invitro MS + 50g/l saccaroza + 6g/l aga + 10% n-íc dừa + 0,5g/l than hoạt tính + 1mg/l NAA Các chåi invitro sau nu«i cÊy m«i tr-êng rễ tuần phát triển thành hoàn chỉnh Chồi đồng tiền đ-ợc nuôi cấy điều kiện nhiệt ®é 25 0C c-êng ®é chiÕu s¸ng 2000 – 2500 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ ngày d Giai đoạn huấn luyện thích nghi Trong điều kiện độ ẩm không khí 80 85%, độ ẩm giá thể 65 80%, nguồn khoáng bổ sung dung dịch dinh d-ỡng NPK tỷ lệ 1:1:1, cát laọi giá thể phù hợp đồng tiền trình huấn luyện thích nghi B Đề nghị Đề tài cần đ-ợc nghiên cứu mở rộng để đánh giá vai trò sinh lý chấtđiều tiết sinh tr-ởng khác nhân giống invitro hoa đồng tiền để xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống invitro loại hoa có gia trị kinh tế giá trị thẩm mỹ C Một số khó khăn cần ý trình nhân giống a Giai đoạn phòng thí nghiệm Nói đến khó khăn th-ờng gặp nuôi cấy mô - tế bào, khó khăn khó khăn lớn xuyên suốt giai đọan phòng thí nghiệm nhiễm nấm, vi khuẩn Các môi tr-ờng NCM TB yêu cầu vô trùng, cần sơ suất nhỏ thao tác kỹ thuật, thời tiết, độ ẩm phòng không đảm bảo, bào tử 33 nấm mốc, vi khuẩn rơi vào bình nuôi Môi tr-ờng thuận lợi bình nuôi tạo điều kiện cho vi khuản nấm môc phát triển nhanh chóng gấp thiệt hại lớn nhiều mặt Do NCM TB cần trọng đến yêu cầu kỹ thuật phòng thí nghiệm, đảm bảo thao tác khử trùng phòng cấy, box cấy thao tác kỹ thuật ng-ời cấy để đảm bảo độ vô trùng cao cho b Giai đoạn huấn luyện giai đoạn huấn luyện đ-a v-ờn, nấm vi khuẩn đối t-ợng gây nhiều khó khăn Trong gia đoạn tiếp xúc với nấm vi khuẩn tránh khỏi, song cần ý để tiếp xúc ảnh h-ởng đến phát triển Cần ý tăng c-ờng sức đề kháng cho nh- tạo điều kiện, môi tr-ờng thích hợp cho phát triển Cây invitro d-a từ bình nuôi vốn có đầy đủ chất dinh d-ỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tốt nhất, đ-a môi tr-ờng, sức đề kháng yếu khó tồn tại, giai đoạn đầu phải tạo cho môi tr-ờng tự nhiên gần giống với môi tr-ờng phòng thí nghiệm, việc đảm bảo chất dinh d-ỡng, phải ý chế độ t-ới tiêu chiếu sáng hợp lý Sau điều chỉnh dần để từ từ thích nghi đ-ợc vơí môi tr-ờng bình th-ờng Chăm sóc đ-a từ bình cấy mội công việc vất vả, tuỳ điều kiện thời tiết mà bố trí mái che m-a gió, tránh nhiệt đố cao 34 35 ... tài Góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống hoa ®ång tiỊn - gerbera b»ng c«ng nghƯ nu«i cÊy m« - invitro Mục đích đề tài áp dụng sở khoa học công nghệ vi nhân giống để nhân nhanh giống hoa đồng. .. nhanh giống hoa đồng tiền từ mô phân sinh đỉnh cây, nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính giống hoa đồng tiền này, Nội dung đề tài nghiên cứu tim điều kiện nuôi cấy invitro thích hợp... sinh tr-ởng khác nhân giống invitro hoa đồng tiền để xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống invitro loại hoa có gia trị kinh tế giá trị thẩm mỹ C Một số khó khăn cần ý trình nhân giống a Giai đoạn