+ Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP 6-benzylamino purin tới khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro.. Hệ số nhân chồi trong các thí nghiệm được tính theo công thức Hệ
Trang 1Đại học Vinh Tạp chí khoa học, tập XXXV, số 1A-2006
Nhân nhanh giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
Mai Văn Chung(a), Phùng Văn Hào (b)
Tóm tắt Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cây đồng tiền bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô in vitro, bước đầu, chúng tôi thu được kết quả: Chồi đỉnh ngọn trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro được khử trùng kép bằng cồn 70 0 trong 1 phút và HgCl 2 0,1% trong 10 phút; Môi trường nhân nhanh chồi đồng tiền: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% nước dừa; Môi trường ra rễ cho chồi
đồng tiền: MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l α-NAA
I Đặt vấn đề
Cây đồng tiền (Gerbera jamesonii B.) là một loài thuộc họ Cúc (Asteraceae) cho hoa quanh năm Hoa đồng tiền được coi là một trong 10 loại hoa đẹp nhất trên thế giới (chỉ xếp sau hoa hồng, cúc, cẩm chướng, lay ơn) [2, 4]
ở Việt Nam, hiện có rất nhiều giống hoa đồng tiền đang được trồng với những ưu điểm: hoa to, cánh dày, xếp nhiều tầng, màu sắc phong phú, dáng hoa
đẹp, cho năng suất cao Tuy nhiên, khó khăn trong sản xuất hoa đồng tiền là nguồn giống cung cấp cho quá trình trồng trọt chủ yếu là cây tách thân, mặc dù sinh trưởng mạnh trong giai đoạn đầu nhưng đến giai đoạn trưởng thành và ra hoa, cây sinh trưởng chậm, nhanh già cỗi, chất lượng hoa kém Bên cạnh đó, phương pháp tách thân tạo ra số lượng cây không nhiều trong mỗi lần nhân giống [2, 4] Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro khắc phục được những hạn chế trên, cho phép chủ động sản xuất ra một lượng lớn cây giống, có độ đồng đều cao
và chất lượng tốt [1] Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trình nhân giống vô tính hoa đồng tiền được công bố [2, 3, 4] Tuy nhiên, việc tiếp tục hoàn thiện cũng như đề xuất quy trình kỹ thuật mới cho các giống vẫn thực sự cần thiết
II vật liệu và phương pháp nghiên cứu
1 Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là giống đồng tiền kép, hoa đỏ có nguồn gốc nhập nội Cây giống được trồng trong nhà lưới, sạch bệnh
2 Xử lý mẫu
Chồi đỉnh ngọn được rửa trên nước chảy và khử trùng sơ bộ bằng cồn 700
trong 1 phút trước khi xử lý bằng H2O2 hoặc HgCl2 Sau khi khử trùng, chồi được rửa sạch bằng nước cất vô trùng 4 - 5 lần, cắt lấy mẫu có kích thước 3 ì 3 ì 3mm rồi
Nhận bài ngày 22/8/2005 Sửa chữa xong 17/11/2005
Trang 2đưa vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy trong 2 tuần Các mẫu sống, bật chồi
được chuyển sang môi trường nhân nhanh và nuôi Sau 4 tuần, chồi in vitro được nuôi trong môi trường tạo rễ 1 tháng trước khi đưa ra vườn ươm
Mẫu in vitro được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 250 ± 20C, cường độ ánh sáng 2000lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày [5, 6]
3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Để xây dựng quy trình nhân giống in vitro, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng
đến tỷ lệ sống của mẫu với các thí nghiệm được bố trí: Khử trùng mẫu bằng H2O2 nồng độ 10, 15 và 20% trong 10 - 15 phút; bằng HgCl2 0,1% trong 5 - 15 phút + Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BAP (6-benzylamino purin) tới khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro Môi trường nuôi cấy chồi được
sử dụng là [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar] bổ sung BAP với các nồng độ từ 0,1 - 2,0mg/l Hệ số nhân chồi trong các thí nghiệm
được tính theo công thức
Hệ số nhân chồi = số chồi sau thời gian nuôi cấy / số chồi ban đầu + Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia là nước dừa bổ sung cho môi trường nuôi cấy với các nồng độ từ 0 - 20% đến sinh trưởng, phát triển và hệ số nhân chồi in vitro
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA (α-naphtyl acetic acid) đến khả năng ra
rễ của chồi in vitro Môi trường ra rễ được sử dụng là (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar) có bổ sung α-NAA với các nồng độ từ 0,1 - 1,5mg/l
Các nghiên cứu được thực hiện từ tháng 01 đến tháng 7 năm 2005 tại Phòng Nuôi cấy mô - tế bào thực vật, khoa Sinh học, trường Đại học Vinh
III Kết quả nghiên cứu và bàn luận
1 ảnh hưởng của loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng Bảng 1 Hiệu quả khử trùng đỉnh ngọn cây đồng tiền
Hoá
chất
Nồng độ (%)
Thời gian (phút)
Số mẫu
đưa vào
Số mẫu nhiễm
và chết (%)
Số mẫu sống (%)
H2O2
HgCl2
Trang 3Mai Văn Chung - Phùng Văn Hào, Nhân nhanh giống hoa , tr.10-15
Kết quả bảng 1 cho thấy: sử dụng H2O2 ở các nồng độ 10% và 15% để xử lý mẫu đồng tiền trong thời gian 10 phút cho tỷ lệ nhiễm khá cao (từ 60 - 75%), chứng tỏ hiệu quả khử trùng mẫu của các thí nghiệm này thấp Khi H2O2 được
sử dụng với nồng độ cao hơn (20%) và kéo dài thời gian xử lý (15 phút) thì số lượng mẫu bị nhiễm có giảm nhưng tỷ lệ chết lại cao Có thể nói, H2O2 không phù hợp cho việc sử dụng để khử trùng đỉnh ngọn đồng tiền
Đối với HgCl2 0,1%, thời gian khử
trùng 5 phút cho số mẫu bị nhiễm
nhiều (13 mẫu) Khi tăng thời gian khử
trùng, tỷ lệ mẫu bị nhiễm và chết giảm
nhiều, hiệu quả cao nhất đạt được ở
công thức xử lý 10 phút (tỷ lệ sống và
bật chồi đạt 80%) Thời gian xử lý 15
phút cho số mẫu bị nhiễm giảm nhiều
(3 mẫu) nhưng lại có tới 6 mẫu bị chết
(do thời gian xử lý dài) Như vậy, sử
dụng HgCl2 0,1% với thời gian xử lý 10
phút là phù hợp đối với đỉnh ngọn cây
hoa đồng tiền
Hình 1 Chồi đồng tiền in vitro sau 1 tuần nuôi cấy từ đỉnh ngọn
2 ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro
Sau khi lựa chọn được loại hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp, chúng tôi đã tiến hành xử lý mẫu với số lượng lớn để nhân nhanh và tìm hiểu ảnh hưởng của BAP - một loại chất kích thích sinh trưởng thực vật - đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro
Bảng 2 ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Nồng độ
BAP (mg/l)
Số mẫu
Số chồi Hệ số nhân Số chồi Hệ số nhân
Qua bảng 2, chúng tôi nhận thấy: không có BAP, sinh trưởng và phát triển của chồi đồng tiền in vitro kém, hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,16 sau 1 tháng nuôi cấy Khi bổ sung BAP vào môi trường dinh dưỡng (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar), sinh trưởng của chồi tăng tỷ lệ thuận với thang nồng độ BAP từ 0,1 - 1,5mg/l,
Trang 4hệ số nhân chồi cao nhất đạt được ở nồng độ BAP 1,5mg/l (sau 2 tuần nuôi cấy là 3,10, sau 4 tuần là 6,14) Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2,0 mg/l thì hiệu quả xử
lý đã giảm xuống
Hình 2 Chồi đồng tiền in vitro sau 1 tuần cấy chuyển
3 ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng sinh trưởng và nhân chồi
in vitro
Bảng 3 ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân chồi đồng tiền in vitro
Sau 2 tuần nuôi cấy Sau 4 tuần nuôi cấy Nồng độ
nước dừa (%)
Số mẫu Số chồi Hệ số nhân Số chồi Hệ số nhân
Nước dừa là một loại hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên, trong thành phần chứa nhiều hợp chất quan trọng đối với mô, tế bào in vitro: axit amin, axit hữu cơ, gluxit, các hợp chất có hoạt tính auxin, các xytokinin dạng glycosit và myo insitol Bổ sung vào môi trường nhân chồi đồng tiền (MS + 50g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 1,5mg/l BAP) nước dừa với nồng độ 15% cho kết quả tốt nhất, chồi
in vitro phát triển mạnh, cây khoẻ, hệ số nhân chồi đạt được sau 2 và 4 tuần nuôi cấy tương ứng 3,86 và 6,72 Các nồng độ cao hoặc thấp hơn 15% đều cho hiệu quả kém hơn (bảng 3) Do đó, môi trường sử dụng để nhân nhanh chồi đồng tiền cần bổ sung nước dừa với nồng độ 15%
4 ảnh hưởng của αα-NAA đến khả năng phát triển rễ và lá của chồi in vitro
Các chồi đồng tiền có khả năng tạo rễ và phát triển lá khác nhau trong môi trường có nồng độ α-NAA khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (bảng 4)
Trang 5Mai Văn Chung - Phùng Văn Hào, Nhân nhanh giống hoa , tr.10-15
Bảng 4 ảnh hưởng của NAA đến khả năng phát triển rễ và lá của chồi
đồngtiền in vitro
Nồng độ
α-NAA (mg/l) Số chồi
% số chồi
ra rễ Số rễ/ cây
Dài rễ (mm) Số lá /cây
Kết quả thu được cho thấy, các nồng
độ α-NAA từ 0,5 - 1,5 mg/l có ảnh hưởng
tốt đến tỷ lệ ra rễ của chồi đồng tiền in
vitro (80 - 90%), số lượng nhiều (3,0 - 3,4
rễ/cây), chiều dài rễ lớn (24,6 - 30,8mm),
trong đó, nồng độ 1,0mg/l α-NAA cho hiệu
quả tốt nhất ở nồng độ này, mặc dù số
rễ/cây chưa phải là nhiều nhất nhưng tỷ lệ
cây ra rễ, chiều dài rễ và số lá/cây là cao
hơn cả
Vì vậy, theo chúng tôi, nồng độ α-NAA
bổ sung vào môi trường (MS + 50g/l
saccaroza + 6,5g/l agar) cho chồi đồng tiền
in vitro ra rễ thích hợp nhất là 1,0mg/l
Hình 3 Cây đồng tiền sau 4 tuần nuôi trong môi trường ra rễ
IV kết luận
Từ những kết quả thu được, bước đầu, chúng tôi đề xuất phương pháp nhân giống vô tính in vitro giống đồng tiền kép, hoa đỏ như sau:
+ Chồi đỉnh ngọn trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro được khử trùng kép:
xử lý mẫu bằng cồn 700 (1 phút), sau đó sử dụng HgCl2 0,1% trong 10 phút + Môi trường nhân nhanh chồi đồng tiền in vitro
MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,5mg/l BAP + 15% nước dừa + Môi trường tạo rễ cho chồi đồng tiền in vitro:
MS + 50g/l saccaroza + 6,5 g/l agar + 1,0 mg/l α-NAA
Trang 6Tài liệu tham khảo
[1] Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 1997
[2] Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, Hoa đồng tiền, NXB Lao động - Xã hội, Hà Nội, 2004
[3] Trần Thị Lệ, Lê Dung, Hoàn thiện quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng công nghệ in vitro, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Số 10 (2005), 80 - 82
[4] Nguyễn Xuân Linh, Hoa và kỹ thuật trồng hoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội,
1998
[5] Đỗ Năng Vịnh, Công nghệ sinh học cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội,
2002
[6] M R Fowler, Plant cell culture, laboratory techniques, In Encyclopedia of cell, Wiley, New York, 2002
SUMMARY
Rapid multiplication of Gerbera (Gerbera jamesonii B.)
by tissue culture technique
We have studied to apply the technique of in vitro propagation in order to produce a large number of disease-free plantlet of Gerbera
The first results of our research show that: The in vitro shoot tip explants of Gerbera were sterilized by etanol 700 in 1 minute and HgCl2 0.1% in 10 minutes; The best medium using for shoot multiplication is [MS (Murashige and Skoog, 1962) + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.5mg/l BAP (6-benzylaminopurine) + 15% coconut water]; The best medium using for roots formation was (MS + 50g/l saccharose + 6.5 g/l agar + 1.0 mg/l α-NAA (α-naphtyl acetic acid))
(a) (b) Khoa sinh học, Trường Đại học Vinh
Trang 7§¹i häc Vinh T¹p chÝ khoa häc, tËp XXXV, sè 1A-2006
Trang 9NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian , tr 16-22
Trang 11NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian , tr 16-22
Trang 13NguyÔn V¨n Dòng, Vµi nhËn xÐt vÒ kh«ng gian , tr 16-22
