Số liệu đợc xử lý bằng toán xác suất thống kê trên phần mềm Microsoft Excel 2003.
Chơng iii:
kết quả nghiên cứu và bàn luận 3.1. Kết quả nghiên cứu giai đoạn vào mẫu.
Bộ phận dùng để vào mẫu là đoạn thân có mang đỉnh sinh trởng và mắt ngủ của các cây cúc khoẻ mạnh, phát triển tốt. Mẫu cúc đợc thu vào thời điểm râm mát, khô ráo (trớc đó ít nhất 3 ngày không ma, không tới nớc) để hạn chế sự nhiễm khuẩn. Các đoạn thân sau khi đợc làm sạch sơ bộ và khử trùng bằng các loại hoá chất có nồng độ và thời gian khác nhau sẽ đợc cắt nhỏ, cấy gây trên môi trờng nền là (MS + 8 g/l agar +30 g/l saccaroza +1 ppm BAP + 0,2 ppm α- NAA + 10% nớc dừa). Kết quả giai đoạn này đợc thể hiện ở bảng 1.
Bảng 1: Kết quả xử lý mẫu cúc Công thức Hoá chất Nồng độ Thời gian xử lý Số mẫu Số mẫu nhiễm, chết (%) Số mẫu bật chồi (%)
M1 CaOCl2 15% 10 phút 30 27 (90,00%) 3 (10,00%) M2 CaOCl2 15% 15 phút 30 19 (63,33%) 11 (36,67%) M3 CaOCl2 15% 20 phút 30 16 (53,33%) 14 (46,67%) M4 HgCl2 0,1% 7 phút 30 18 (60,00%) 12 (40,00%) M5 HgCl 2 0,1% 10 phút 30 13 (43,33%) 17 (56,67%) M6 HgCl2 0,1% 15 phút 30 23 (76,67%) 7 (23,33%) + Nhận xét về kết quả xử lý mẫu
- Công thức M1: Xử lý CaOCl2 15% trong 10 phút.
Với hoá chất khử trùng là CaOCl2 15%, khi tiến hành xử lý trong thời gian 10 phút thì số mẫu xanh nhiều nhng chỉ có 3 mẫu không bị nhiễm và bật chồi, chiếm 10% tổng số mẫu đợc xử lý. Có tới 25 mẫu xanh bị nhiễm nấm, khuẩn (chiếm tỷ lệ 83,33%) bên cạnh 2 mẫu hoá nâu (chiếm tỷ lệ 6,67%). Chứng tỏ CaOCl2 15% xử lý trong 10 phút cha phù hợp với việc khử trùng mẫu cúc.
- Công thức M2: CaOCl2 15% trong 15 phút.
Tăng thời gian xử lý lên 15 phút, số mẫu bị nhiễm giảm rõ rệt so với công thức M1. ở công thức M2 có 4 mẫu hoá nâu (chiếm 13,33%) và 15 mẫu xanh nhng bị nhiễm (chiếm 50%). Tỷ lệ mẫu nhiễm đã giảm tới 33,33% so với thời gian xử lý 10 phút. Tuy nhiên, số mẫu bật chồi ít, sau 4 tuần chỉ có 11 mẫu (chiếm 36,67%). Kết quả này cũng cho thấy, hiệu quả khử trùng của công thức
M2 tuy có cao hơn công thức M1 nhng vẫn cha đạt đợc những yêu cầu cần thiết của giai đoạn vào mẫu.
- Công thức khử trùng M3: Xử lý CaOCl2 15% trong 20 phút.
Tiếp tục tăng thời gian xử lý với CaOCl2 15% lên 20 phút, số mẫu bật chồi tăng (14 mẫu, chiếm tỷ lệ 46,67%), số mẫu nhiễm giảm (9 mẫu, chiếm 30%) nhng tỷ lệ mẫu chết lại tăng lên đến 23,33% (8 mẫu). Kết quả này cho thấy nếu tiếp tục tăng thời gian xử lý lâu hơn 20 phút thì số mẫu chết sẽ tiếp tục tăng lên, hiệu quả xử lý mẫu giảm rõ rệt.
- Công thức M4: Xử lý HgCl2 0,1% trong 7 phút.
Chuyển sang nghiên cứu ảnh hởng của HgCl2 0,1%, trong thời gian khử trùng 7 phút cho ít mẫu bị chết (5 mẫu) nhng số mẫu nhiễm nhiều (13 mẫu) làm cho tỷ lệ mẫu nhiễm và chết lên tới 60%, còn lại 40% mẫu bật chồi. Chứng tỏ xử lý HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút không đảm bảo hiệu quả khử trùng cho mẫu cúc.
- Công thức M5: Xử lý HgCl2 0,1% trong 10 phút.
Trong 30 mẫu đợc xử lý theo công thức này có tới 17 mẫu sống và bật chồi chiếm 56,67%. số mẫu nhiễm và chết ít với 5 bình nhiễm (chiếm tỷ lệ 16,67%), và 8 bình bị hoá nâu (chiếm tỷ lệ 26,66%). Kết quả thu đợc cho thấy xử lý HgCl2 0,1% trong 10 phút là phù hợp đối với mẫu cấy gây.
- Công thức khử trùng M6: dùng HgCl2 0,1% trong 15 phút.
Tăng thời gian xử lý HgCl2 0,1% lên 15 phút thì số mẫu bị nhiễm ít (8 bình chiếm tỷ lệ 26,67%). Tuy nhiên tỷ lệ mẫu sống và bật chồi rất thấp - chỉ có 7 mẫu (chiếm tỷ lệ 23,33%). Trong khi đó, có tới 15 mẫu (chiếm tỷ lệ 50%) bị hoá nâu. Điều này cho thấy việc tăng thời gian xử lý HgCl2 0,1% lên 15 phút đã gây độc cho mẫu cúc.
+ Về hình thái chồi cúc in vitro sau 4 tuần cấy gây: Hình thái mẫu cúc bật chồi có thể khác nhau do nhiều nguyên nhân nh tính chất của vật liệu khởi đầu hay ảnh hởng của hoá chất khử trùng; thờng thì những mẫu bật chồi từ vật liệu
ban đầu là đỉnh sinh trởng sẽ có màu xanh đậm hơn so với những mẫu phát sinh chồi từ vật liệu ban đầu là các đoạn thân mang mắt ngủ phiá dới đỉnh sinh tr- ởng. Thời gian phát sinh chồi từ đỉnh sinh trởng thờng nhanh hơn các đoạn thân mang mắt ngủ. ở đây, chúng tôi chỉ đánh giá hình thái chồi tái sinh ở 2 công thức khử trùng cho hiệu quả tốt hơn cả là M3 và M5. Đợc cấy trên cùng một loại môi trờng nền, mặc dù thời gian xử lý lâu hơn nhng độ hồi xanh của mẫu đ- ợc xử lý CaOCl2 15% trong 20 phút nhanh hơn so với HgCl2 0,1% trong 10 phút . Chỉ sau 3 - 4 ngày, các mẫu đợc khử trùng ở công thức M3 đã xanh trở lại nh- ng ở công thức M5 thời gian hồi xanh của mẫu lên tới 6 – 7 ngày. Ban đầu, các chồi phát sinh từ mẫu đợc khử trùng bằng HgCl2 0,1% nhỏ hơn, sinh trởng chậm hơn so với những mẫu đợc khử trùng bằng CaOCl2 15%. Tuy nhiên, sau 3 – 4 tuần, các chồi cúc tái sinh từ mẫu xử lý bởi HgCl2 0,1% lại sinh trởng, phát triển mạnh hơn.
Nh vậy, theo chúng tôi, khử trùng mẫu cúc để cấy gây bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 10 phút là thích hợp nhất.