Về nguyên tắc, quy trình nhân giống vô tính in vitro gồm 4 giai đoạn [9, 10, 17, 33, 34, 35 ].
a, Giai đoạn 1: Vào mẫu và cấy gây:
Đây là giai đoạn khó khăn nhất nhng có ý nghĩa quyết định toàn bộ quy trình nhân giống. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra các nguyên liệu thực vật vô trùng để đa vào nuôi cấy in vitro.
Giai đoạn này phải đảm bảo đợc các yêu cầu sau: - Tỷ lệ nhiễm thấp
- Tỷ lệ sống cao
- Mô tồn tại và sinh trởng tốt
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, quan trọng nhất là đỉnh sinh trởng, chồi nách sau đó là hoa tự, đoạn thân, cành, mảnh lá, rễ…
Để khử trùng mô nuôi cấy, phơng pháp phổ biến hiện nay là sử dụng hoá chất có khả năng diệt vi sinh vật. Hiệu quả khử trùng của các chất này phụ thuộc vào thời gian, nồng độ xử lý và khả năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt mẫu cấy. Để tăng tính hiệu quả của hoá chất diệt khuẩn, ngời ta th- ờng sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng bề mặt nh Tween 20, Tween 80,
fotoflo, teepol hoặc có thể xử lý phối hợp với cồn 70… 0. Hoá chất đợc lựa chọn để khử trùng mẫu cấy phải đảm bảo hai thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với mô thực vật. Ngời ta thờng dùng một số hoá chất: HgCl2, CaOCl2, NaOCl, H2O2… trong đó NaOCl và CaOCl2 hay đợc dùng hơn cả vì chúng có mức độ độc tính thấp đối với mẫu, không có biểu hiện ức chế sinh trởng. Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung vào môi trờng than hoạt tính hoặc ngâm mẫu truớc khi cấy vào hỗn hợp axit ascobic và axit citric nồng độ 25 - 150 mg/l.
Ngoài những chất nói trên, có thể sử dụng thêm chất kháng sinh để khử trùng mẫu. Hai chất kháng sinh hay đợc sử dụng là: gentamixin và ampixilin (50-100mg/l). Sau khi xử lý với các hoá chất, mẫu thực vật đợc ngâm vào các dung dịch có chứa kháng sinh trong khoảng 30 phút sẽ tăng đáng kể hiệu quả của quá trình vô trùng mẫu cấy.
Chọn đúng phơng pháp khử trùng sẽ đa lại tỷ lệ sống cao, chọn môi trờng dinh dỡng thích hợp sẽ giúp cho mẫu đạt tốc độ sinh trởng nhanh.
Môi trờng nuôi cấy thờng dùng là môi trờng MS (Murashige & Skoog, 1962).
b, Giai đoạn 2: Nhân nhanh
Quá trình nhân giống in vitro nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân chồi in vitro cao nhất, vì vậy nhân nhanh đợc coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Giai đoạn này nhằm kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lợng thông qua các con đờng: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định hay tạo phôi vô tính. Vấn đề quan trọng của giai đoạn này là phải xác định đợc môi tr- ờng và các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Giai đoạn này có thể kéo dài từ 10-36 tháng, nhng không nên kéo dài quá vì mẫu cấy chuyển nhiều lần dễ dẫn đến hiện tợng biến dị xôma.
Để tăng hệ số nhân chồi, phải đa thêm vào môi trờng dinh dỡng các chất điều tiết sinh trởng: auxin, xytokinin, gibberellin, các hợp chất tự nhiên kết…
hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.
Môi trờng nuôi cấy thờng đợc bổ sung một lợng nhỏ auxin vì đây là nhóm hormon thực vật có vai trò sinh lý là tạo rễ bất định cho mô nuôi cấy, trong đó IAA; IBA; α-NAA; 2,4 D đợc sử dụng nhiều nhất. Giai đoạn này th- ờng kéo dài từ 2 - 8 tuần.
d, Giai đoạn 4: Giai đoạn huấn luyện thích nghi
Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhân giống, quyết định khả năng ứng dụng của quá trình này vào thực tiễn sản xuất. Cây con đợc chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài điều kiện tự nhiên nên cần phải có quá trình huấn luyện để thích nghi, tồn tại và phát triển. Quá trình thích nghi đợc hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần, trong thời gian này cây cần đợc chăm sóc, bảo vệ cẩn thận trớc những bất lợi nh mất nớc, nhiễm khuẩn, nấm,…
Trong giai đoạn này đối với một số loài có thể chuyển chồi cha ra rễ ra đất, nhng đa số là cây hoàn chỉnh với đầy đủ rễ, thân, lá đợc đa từ ống ngiệm ra đất. Giai đoạn này cần có giá thể chăm sóc phù hợp. Yêu cầu của giai đoạn này là:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt đợc những tiêu chuẩn hình thái nhất định. - Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp, đạt yêu cầu tơi xốp, thoát nớc. - Phải giữ ẩm cho cây, khi mới đa ra từ ống nghiệm cần che chắn để giữ ẩm và tránh ánh sáng quá mạnh. Cụ thể độ ẩm đất phải đạt 76 - 80%, độ ẩm không khí phải đạt 82 - 85%.
Chơng 2:
đối tợng, nội dung và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.