Luận văn thạc sĩ nghiên cứu phân lập nhân giống và nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (cordyceps militaris) ở việt nam

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đông tr ng hạ thảo loài nấm dược liệu qu từ lâu giới biết đến Nhi u nghiên cứu khoa học chứng minh Cordycep militaris có thành ph n hóa học ch nh có giá trị dinh dưỡng dược t nh như: cordycepin, adenosine, cordycepic acid, polysaccharides, superoxide dismutase (SOD), acid béo, sterol hoạt chất có tác dụng sinh học khác acid amin, protein, vitamin (A, B1, B3, B6, B12, ) nguyên tố vi lượng (Zn, Se, Cu, ) Các chứng khoa học xác nhận hiệu Cordycep militaris như: cải thiện hệ miễn dịch, chống lão hóa, chống mệt mỏi, tiêu diệt tế bào ung thư, vi rút vi khuẩn, hỗ trợ hệ tim mạch, cải thiện đ kháng insulin bệnh nhân ti u đường, giảm cân có th s dụng mỹ phẩm, Ch nh vậy, nhu c u sản phẩm từ Cordycep militaris nước ước t nh đạt 300 tỷ đồng ngày gia tăng, 70% sản phẩm nhập Trong đó, thị trường tiêu thụ sản phẩm từ Cordycep militaris giới đạt mức 10.000 tấn/năm, tương đương khoảng 100 tỷ đô la Mỹ/năm Việc Đông tr ng hạ thảo tự nhiên d n trở nên khan thúc đẩy nhi u nghiên cứu hướng đến việc nuôi trồng Đông tr ng hạ thảo nhân tạo Cordyceps militaris s dụng nguồn Đơng tr ng hạ thảo có th nuôi cấy nhân tạo đ tạo th , đáp ứng nhu c u s dụng ngày gia tăng nước giới với ch ph hợp l Ở Việt Nam có nhi u chủng nấm Đông tr ng hạ thảo (Cordyceps militaris) mọc tự nhiên v ng sinh thái khác nhau, việc phân lập, nhân giống định danh loài nuôi trồng chủng cho suất th cao, chất lượng hoạt t nh tốt c n hạn chế Vì vậy, chúng tơi thực đ tài “Phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) Việt Nam” với mục đ ch định danh nh ng chủng giống nấm Đông tr ng hạ thảo thu nhận tự nhiên Việt Nam đ nuôi trồng cho suất th cao hàm lượng hoạt chất Cordycepin, Adenosine tốt, góp ph n thúc đẩy sản xuất nh ng lồi nấm Công ty Cổ Ph n Dược Thảo Thiên Phúc Việt Nam Phần I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan chung Cordyceps militaris 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu Nấm đông tr ng hạ thảo xem quý Nh ng câu truyện mang tính th n thoại truy n thuyết liên quan đến loài nấm lưu truy n nhi u thiên niên kỷ Hiện nay, ghi nhận v thời gian phát đ u tiên loài nấm chưa thống Theo Das (2009) nấm đơng tr ng hạ thảo Cordyceps biết đến từ nh ng năm 2000 trước công nguyên Nhưng theo Holliday cộng (cs.) (2004) tổng hợp từ nhi u nguồn tài liệu ghi nhận đ u tiên v nấm đông trùng hạ thảo thực Trung Quốc vào năm 620 sau công nguyên, vào tri u đại nhà Đường Sự ghi nhận làm rõ chất sinh học từ nh ng câu truyện huy n thoại truy n thuyết v đông tr ng hạ thảo Đông tr ng hạ thảo sinh vật tồn hàng năm chuy n cách th n bí từ động vật sang thực vật vào m a h sau lại từ thực vật chuy n sang động vật vào m a đơng Tiếp sau có nhi u cơng trình xuất với nội dung v lồi nấm đông tr ng hạ thảo học giả xứ Tây Tạng từ kỷ 15 đến kỷ 18, có cơng trình đ u tiên cho có sở khoa học tin cậy mô tả v nấm đông tr ng hạ thảo Wu-Yiluo năm 1757, sách Dược n, tri u đại Thanh Theo sau học giả xứ Tây Tạng, việc phát giá trị đông trùng hạ thảo thuộc v nh ng người chăn b núi Hymalaya Tây Tạng cũ Nepal, họ thấy nh ng bò gặm cỏ ăn phải nấm đông trùng hạ thảo vào m a xuân trở nên cuồng nhiệt, b đực ln tìm theo sát bò (Holliday J cs, 2004) 1.1.2 Phân loại Chi nấm Cordyceps thu m u định loại 400 loài khác Theo hệ thống phân loại truy n thống, chi Cordyceps thuộc giới Nấm, ngành Ascomycota, lớp Sordariomycetes, Hypocreales, họ Clavicipitaceae (Sung J.H cs, 2007) Phân loại nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris: Giới : Fungi Ngành: Ascomycota Phân ngành: Ascomycotina Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipataceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris 1.1.3 Đặc điểm phân bố Cordyceps militairs Nấm Đông tr ng hạ thảo loài nấm ký sinh sâu non nhộng sâu trưởng thành số lồi trùng, lớp nhện Vào m a Đông nấm xâm nhiễm, k sinh vào th côn trùng làm cho côn trùng chết nấm tồn th côn trùng dạng hệ sợi giai đoạn vô t nh Đến mùa Hè, nhiệt độ ẩm độ khơng khí cao, hợi sợi nấm vơ tính tiến hành giao phối chuy n giai đoạn h u tính, hình thành nấm (chất đệm) quan chứa bào t vơ tính nhú lên khỏi mặt đất gốc v n dính li n vào thân sâu Chính mà nấm có tên gọi Đơng tr ng hạ thảo (Phạm Quang Thu cs, 2013) Nấm đông tr ng hạ thảo thường phát vào mùa hè số cao nguyên có độ cao từ 3500 m đến 5000 m so với mặt bi n; v ng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Cam Túc, Vân Nam Đây ch nh nguồn đông tr ng hạ thảo tự nhiên (Nguyễn Mậu Tuấn cs, 2013) Ngồi cịn phát vùng núi cao thuộc Ấn Độ, Nepal, Bhutan Hiện nay, khoảng 400 lồi tìm thấy, có khoảng 90 loài phát Trung Quốc (Zhou X cs, 2009) Tại Việt Nam, đông tr ng hạ thảo phát nhi u địa m khác Năm 2009, Phạm Quang Thu cs phát chủng Cordyceps nutans Pat khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên T - Sơn Động - B c Giang, Cordyceps gunni Berk vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc, Cordyceps militaris Link vườn quốc gia Hoàng Liên tỉnh Lào Cai Năm 2009, Đái Duy Ban cộng cơng bố phát v lồi đơng trùng hạ thảo l n đ u tiên tìm thấy Việt Nam lồi đơng tr ng hạ thảo có tên Isaria cerambycidae Năm 2010, Phạm Thị Thùy Viện phát giống Cordyceps nutans Vườn quốc gia Cúc Phương (Ninh Bình) Cordyceps militaris Vũ Quang (Hà Tĩnh) 1.1.4 Giá trị dược liệu nấm Cordyceps militaris Các hợp chất dược liệu loại nấm Cordyceps militaris ứng dụng u trị bệnh nâng cao sức khỏe người, lồi nấm có giá trị kinh tế cao Nấm Cordyceps militaris khan tự nhiên Do đó, việc sản xuất quy mơ lớn chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu u trị bệnh từ Cordyceps militaris vấn đ cấp thiết Các hợp chất chống ung thư: Hợp chất cordycepin (3′-deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt t nh kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, u h a miễn dịch (Shonkor et al, 2010) oạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứa dịch chiết nấm C.militaris có t nh kháng DPPH, hoạt t nh kh tạo phức nồng độ (8 mg/ml) 89%, 1,188 85% (Fengyao et al., 2011) Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu lợn cho thấy d ng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh tr ng tăng, số ph n trăm tinh tr ng di động hình dạng bình thường tăng Hiệu trì ch sau tu n ngưng s dụng chế phẩm Lượng cordycepin tế bào tăng thời gian s dụng chế phẩm nên có khả chất làm tăng lượng tinh dịch chất lượng tinh tr ng lợn (Lin et al, 2007) ạn chế vius cúm: Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng đậu nành nảy m m có khả ứng dụng u trị cúm A Chất góp ph n u h a hoạt động miễn dịch đại thực bào (Yuko et al, 2007) Kháng khuẩn kháng nấm kháng ung thư: C militaris: protein (CMP) tách chiết từ nấm có k ch thước 12kDa, pI 5,1 có hoạt t nh khoảng pH 7-9 Protein ức chế nấm Fusariumoxysporum gây độc tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et al, 2009) Hợp chất cordycepin c n cho thấy khả kháng vi khuẩn Clostridium Các hợp chất d n xuất từ nấm mong đợi ứng dụng việc u trị bệnh nhiễm khuẩn đường ruột (Young-Joonet al., 2000) Cordycepin ngăn bi u gen T2D chịu trách nhiệm u h a bệnh ti u đường thông qua việc ức chế đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, hy vọng ứng dụng chất u h a miễn dịch d ng u trị bệnh v miễn dịch (Seulmee et al., 2009) Tan huyết khối: Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt t nh g n fibrin, xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzyme có khả s dụng u trị tan huyết khối tương tự enzym fibrinolytic mạnh khác nattokinase enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme có th sản xuất quy mô lớn giải pháp thay h u hiệu cho enzym fibrinolytic giá thành cao s dụng cho bệnh tim lão hóa người (Jae-Sung et al., 2006) Tính kháng viêm: Đ xác định tác dụng kháng viêm nấm, dịch chiết từ th nấm Cordyceps militaris (CMWE) th nghiệm v tác dụng ki m soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm k ch th ch việc sản xuất nitric oxide), việc phóng th ch yếu tố hoại t khối u α (TNF-α) interleukin-6 (IL-6) tế bào RAW 264,7 Các đại thực bào x l với nồng độ khác CMWE làm giảm đáng k LPS, TNF-α IL-6 mức độ giảm theo nồng độ dịch chiết Nh ng kết cho thấy CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất chất trung gian gây viêm tế bào (Wol et al., 2010) Các ứng dụng lâm sàng nấm Cordyceps militaris: Mặc d nấm Cordyceps sinensis s dụng rộng rãi Cordyceps militaris, nhiên ứng dụng lâm sàng chúng tương tự Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có th s dụng trường hợp suy giảm chức phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das et al., 2010) 1.1.5 Các hoạt chất nấm đơng trùng hạ thảo Cordyceps militaris Theo số liệu nghiên cứu v thành ph n hóa học th nấm C.militaris cho thấy loài nấm chứa thành ph n protein chiếm 40,69%; loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al, 2007) Acid amin: Kết nghiên cứu Hyun (2008) cho thấy th nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao sinh khối nấm (69,32 mg/g th 14,03 mg/g sinh khối nấm) Khối lượng acid amin loại th sinh khối nấm có chênh lệch, dao động từ 1,15-15,06 mg/g 0,36-2,99 mg/g Thành ph n acid amin loại th bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), alanine (5,18 mg/g) in the fruiting body Số liệu phân t ch Chang cộng (2001) cho thấy ph n lớn sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001) Acid béo: Quả th nấm Cordyceps militaris chứa nhi u acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trongquả th 21,5% sinh khối Lượng acid béo no chủ yếu acid palmitic, chiếm 24,5% th 33,0% sinh khối (Hur, 2008) Adenosine cordycepin: Adenosine cordycepin hai hợp chất có dược t nh cao nấm Cordyceps militaris Adenosine chiếm 0,18% th 0,06% sinh khối nấm Đối với hợp chất cordycepin, th có hàm lượng cao gấp l n so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hyun et al, 2008) Polysaccharide: Các polysaccharide CPS-1 CPS-2 tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành ph n từ đơn phân đường monosaccharide, mannose galactose Kết nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide có khả phục hồi tổn thương gan ethanol, tác dụng tăng lên tăng li u d ng chiết xuất Yan cộng cho tác dụng có th chức kháng oxy hóa polysaccharide từ nấm (Yan et al, 2008) 1.2 Tình hình nghiên cứu ni cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Việt Nam giới 1.2.1 Tình hình nghiên cứu ni cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris giới Các cơng trình nghiên cứu giới v loại nấm chứng minh công dụng vượt trội nấm đông tr ng hạ thảo nguồn dược liệu quý Nh ng năm g n đây, nhi u tính chất dược lý lồi nấm nghiên cứu cánh khoa học công bố tạp ch chuyên ngành như: Năm 2004, Yoo H.S cs công bố: Dịch chiết từ th Cordyceps militaris có tác dụng chống ung thư, hiệu hai loại tế bào màng tĩnh mạch rốn HT1080 B16-F10 có khả chống lại tạo thành mạch máu cách giảm bi u bFGF, nh ng nhân tố kích thích q trình Do có vai trị kìm hãm q trình tạo thành mạch máu mà có th ngăn chặn q trình di phát tri n tế bào ung thư Ngồi ra, dịch chiết nấm Đơng tr ng hạ thảo cịn có tác dụng kìm hãm phát tri n tế bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J cs, 2001) Mặt khác, dịch chiết nước ấm nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm phát tri n dòng tế bào ung thư máu người cách gây tượng tự chết tế bào thông qua hoạt hoá enzym caspase-3 (Lee H Và cs, 2006) Năm 2005, cơng trình nghiên cứu Won S.Y Park E.H cho thấy Cordyceps militaris có tác dụng chống lão hố, chống chứng viêm tấy Ahn Y.J cs (2000) cho nấm Đơng tr ng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm phát tri n số virut, vi khuẩn nấm Ngoài nấm Đơng tr ng hạ thảo Cordyceps militaris cịn có tác dụng kìm hãm oxy hố lipit, lipoprotein lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E Kamendulis L.M., 2004) Vì vậy, việc ni trồng lồi nấm q nhà khoa học giới nghiên cứu từ quy mơ phịng thí nghiệm thu sinh khối sợi nấm, tới quy mô lớn thu th nấm Nuôi trồng th nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris tiến hành nhi u nước giới: Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản Mỹ Tại Trung Quốc có trang trại lớn chun ni trồng lồi nấm tỉnh: Thượng Hải, Quảng Châu, Chiết Giang, An Huy, Giang Tơ Chỉ tính trang trại ni trồng loài nấm Kaiping, Quảng Châu, sản lượng năm thu 100000 kg sản phẩm Sản phẩm nấm đông tr ng hạ thảo từ nuôi trồng nhân tạo có mặt nhi u nước giới k nước phương Tây mang lại lợi nhuận cao cho doanh nghiệp người nuôi trồng nấm (Phạm Quang Thu, 2013) Patcharaporn Wongsa (2005) Thái Lan nghiên cứu phân lập sinh trưởng hệ sợi, hình thành bào t chồi nấm Cordyceps unilateralis ký sinh kiến Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), PYEG (Peptone Yeast Extract Glucose), CSA (Carrot extract Sucrose Agar) môi trường MEA (Malt Extract Agar) d ng đ phân lập nuôi cấy hệ sợi Tại Hàn Quốc, Jae Sung Kim cs (2006), s dụng nhộng tằm đ nuôi trồng th nấm Cordyceps militaris Nhộng tằm đựng lọ nuôi cấy, kh trùng 12oC thời gian 90 phút, đ nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn k n toàn giá th u kiện nhiệt độ 20-250C, cường độ ánh sáng 500-700 lux hình thành m m th Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi tác giả tiến hành môi trường dinh dưỡng lỏng với thành ph n sau: 40 g/l t đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, 0.5 g/lít MgSO4.7H2O Duck-Hyun Cho cs (2003), tiến hành nghiên cứu sinh trưởng hệ sợi chủng ký hiệu CHO-7208; CHO-7845; CHO-7846 loài Cordyceps militaris mơi trường dinh dưỡng q trình hình thành th nấm Cordyceps militaris với giá th sâu non loài Allomyrina dichotoma Linnaeus Kết cho thấy sinh trưởng hệ sợi chủng khác khác nuôi cấy thu n khiết Chỉ có chủng CHO7208 CHO-7846 hình thành th s dụng sâu non Allomyrina dichotoma Linnaeus làm giá th Chi u dài th đạt 51-56 mm sau 27 ngày nuôi cấy Tại thành phố Hayward, bang California, Mỹ, Công ty công nghệ sinh học BIOKEN ni trồng quy mơ cơng nghiệp lồi nấm Cordyceps militaris Sản phẩm tiêu thụ nước thị trường quốc tế 1.2.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris Việt Nam Các cơng trình nghiên cứu v ni cấy đơng tr ng hạ thảo Cordyceps militaris Việt Nam chưa nhi u chưa có hệ thống Một số nghiên cứu tiến hành dừng lại mức độ nghiên cứu v sinh trưởng hệ sợi nghiên cứu tạo th mức độ th nghiệm Đ tài: “Nghiên cứu đặc m sinh học hệ sợi nuôi cấy thu n khiết chủng nấm đông tr ng hạ thảo Cordyceps militaris (L.Fr) Link.” Phạm Quang Thu cs (2011) rằng: Đặc m sinh học nấm Cordyceps militaris bao gồm đặc m sinh trưởng, loại môi trường dinh dưỡng, pH môi trường, nhiệt độ ẩm độ khơng khí tối ưu cho phát tri n nấm nghiên cứu Kết chủng nấm Cordyceps militaris gồm chủng thu thập Việt Nam, chủng sưu t m từ Nhật chủng Trung Quốc, tất đ u sinh trưởng bình thường mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, chủng sinh trưởng nhanh bao gồm chủng HL2, chủng CM, chủng F1010 chủng F1080 với tốc độ l n lượt 104,66; 122,02; 107,64; 105,08 μm/giờ, 4/8 chủng nấm sinhtrưởng chậm chủng HL22, chủng HL34, chủng HL35 chủng F1012 với tốc độ sinh trưởng đạt 69,95; 71,92; 79,37 80,36 μm/giờ Các đặc m nuôi cấy cho phát tri n tối ưu hệ sợi xác định mơi trường dinh dưỡng PDA có bổ sung thêm 10% nhộng tằm, nhiệt độ khơng khí thích hợp từ 20 - 25oC, số chủng HL2 chủng F1012 cho sinh trưởng nhanh nhiệt độ thấp 15oC.Độ ẩm khơng khí khoảng 80 - 85%, môi trường pH axit từ 4,5 - 6,5 “Nghiên cứu thành ph n loài nấm Đơng tr ng hạ thảo Vườn Quốc gia Hồng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai” Tr n Văn Tú (2011) cho thấy: Tại Vườn Quốc Gia Hoàng Liên Huyện Sa Pa Tỉnh Lào Cai, tác giả phát hiện, thu hái, giám định phân lập lồi nấm Đơng tr ng hạ thảo, k sinh côn tr ng khác nhau: Cordyceps militaris, Cordyceps nutans, Cordyceps crinalis, Cordyceps formosana, Cordyceps pseudomilitaris Beauveriabassiana, Isariafarinosa, Isaria tenuipes, Trong có lồi nấm Cordyceps formosana 10 Cordyceps pseudomilitaris l n đ u tiên mơ tả Việt Nam Thành ph n lồi nấm ĐTHT thu địa bàn khu vực nghiên cứu đa dạng, với loài khác Nấm phân bố nhi u loại hình rừng, độ cao, độ tàn che khác nhau, tập trung chủ yếu ở: rừng tự nhiên, có độ cao từ 1500- 2000m độ tàn che > 0,5 Các loài nấm ĐTHT thu khu vực nghiên cứu đa dạng v giá trị thương mại, dược liệu, công nghiệp Đặc biệt giá trị dược liệu, đáng k loài nấm ĐTHT thuộc chi nấm Cordyceps nấm Isaria tenuipes, Isaria farinosa loài nấm giai đoạn vô t nh chi nấm Cordyceps Năm 2011, Tô Quang Huyên Lê Thị Xuân tiến hành u tra thành ph n nấm k sinh côn tr ng khu rừng di t ch lịch s cảnh quan môi trường Mường Phăng huyện Điện Biên tỉnh Điện Biên Kết u tra từ tháng đến tháng thu loài nấm khác bao gồm loài thuộc chi Cordyceps loài thuộc chi Beauveria Lồi có t n suất b t gặp nhi u khu vực u tra C nutans với t n suất xuất 96,40%, loài Beauveria bassiana với t n suất 1,35% loài c n lại lồi chiếm 0,45% Ngồi ra, có số đ tài đánh giá ảnh hưởng u ni trồng đến khả hình thành th như: Cơng trình nghiên cứu Đỗ Tuấn Bách cs (2017) s dụng giá th gạo lứt với dung dịch dinh dưỡng tối ưu thu gồm glucose 40 g/L, peptone g/L, MgSO4.7H2O 1,5g/L, K2HPO4 1,5 g/L, NAA mg/L, bột nhộng tằm 3% Đi u kiện nhiệt độ trì mức 12h chiếu sáng 250C-12h tối 200C Quả th ni trồng mơi trường tối ưu có hàm lượng cordycepin đạt 4,33±0,08 mg/g khô, cho thấy ti m ứng dụng quy trình quy mơ cơng nghiệp 1.3 Các phƣơng pháp định danh nấm 1.3.1 Phương pháp định danh thơng qua hình thái S dụng phương pháp truy n thống đ định danh thường dựa vào tiệu phân loại như: đặc m hình thái, sinh l , đặc m biến dưỡng lượng Trong th nghiệm đ xác định đặc m sinh l , sinh hóa tiêu quan trọng  Sử dụng khóa phân loại Thơng thường đ định danh theo phương thức truy n thống, người ta thường 90 So sánh thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ba thời gian chiếu sáng khác chúng nhận thấy rằng: chiếu sáng 12 giờ/ngày thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ng n hai thời gian chiếu sáng lại Kết cụ th trình bày bảng đây: Bảng 3.21 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Kích thƣớc thể mm Mẫu CM1 CM2 CM7 Số lƣợng thể TB/hộp 22,67 ± 0,44 23,67 ± 0,44 28,33 ± 0,44 Chiều dài thể 51,80 ± 0,07 33,33 ± 0,09 66,80 ± 0,07 Đƣờng kính thể Đặc điểm thể 2,67 ±0,09 Quả th có màu cam đậm, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ 2,40 ± 0,13 Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có bào t 2,10 ± 0,07 Quả th có màu cam đỏ, hình trụ dài, ph a đ u th có màu tr ng, th tr n CM13 35,67 ± 0,44 48,20 ± 0,07 2,73 ± 0,04 CM18 25,33 ± 0,44 60,10 ± 0,07 2,13 ± 0,11 CM29 35,67 ± 0,44 53,73 ± 0,04 3,63 ± 0,04 CM32 35,33 ± 0,44 92,10 ± 0,13 3,03 ± 0,04 CM34 40,33 ± 1,11 50,20 ± 0,07 3,57 ± 0,24 Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thuôn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt 91 Như vậy, thời gian chiếu sáng phù hợp cho sinh trưởng phát tri n th nấm 12 giờ/ngày Hình 3.60 Hình ảnh mẫu sau nuôi trồng chất tổng hợp thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày e) Kết nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm đến khả hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris Đ nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm đến khả hình thành phát tri n th nấm Cordyceps militaris tiến hành bố tr th nghiệm ba u kiện độ ẩm khác Nuôi c ng u kiện nhiệt độ, ánh sáng Kết th nghiệm trình bày bảng 92 Bảng 3.22 Ảnh hƣởng độ ẩm đến khả hình thành phát triển thể Cordyceps militaris M u CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 CM32 CM34 Độ ẩm (%) 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 70 80 90 Thời gian hệ sợi ăn k n b mặt chất (ngày) 5 6 6 5 6 5 5 5 Thời gian hình thành th (ngày) 14 11 16 15 10 10 14 10 11 14 13 14 14 12 12 12 10 10 15 12 13 15 10 11 Thời gian thu hoạch th (ngày) 61 55 56 57 55 55 57 52 53 62 58 58 56 53 54 60 55 55 55 50 51 60 55 56 Từ kết thí nghiệm trên, cho thấy độ ẩm có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát tri n th Cordyceps militaris Quan sát sinh trưởng th độ ẩm 70% nhận thấy: sinh trưởng th hai cường độ Quả th phát tri n chậm Nhận thấy th nhỏ, ng n, ph n đế th khô So sánh thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ba độ ẩm khác thấy rằng: độ ẩm 80% 90% tiêu thu thập đ u khơng có khác biệt rõ rệt Kết nghiên cứu trình bày bảng sau: 93 Bảng 3.23 Kết nghiên cứu ảnh hƣởng độ ẩm 80% 90% đến sinh trƣởng thể Mẫu Độ ẩm (%) Số lƣợng thể TB/hộp 80 Kích thƣớc thể mm Chiều dài thể Đƣờng kính thể 22,33 ±0,44 51,73±0,04 2,53 ±0,04 90 22,33 ±0,89 51,77 ±0,04 2,53 ±0,11 80 23,67 ±0,44 32,80 ±0,07 2,37 ±0,04 90 23,67 ±0,44 32,87 ±0,04 2,40 ±0,13 80 28,33 ±0,44 66,70 ±0,73 2,17 ±0,04 90 28,00 ±0,67 66,70 ±0,07 2,20 ±0,07 80 35,33 ±0,44 48,23 ±0,04 2,33 ±0,04 90 36,67 ±0,89 48,13 ±0,04 2,47 ±0,09 80 25,33 ±0,44 69,70 ±0,13 2,53 ±0,04 90 25,00 ±0,67 59,80 ±0,07 2,50 ±0,07 80 35,33 ±0,44 52,30 ±0,07 2,63 ±0,04 90 35,67 ±0,44 52,20 ±0,07 2,67 ±0,04 CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 Đặc điểm thể Quả th có màu cam đậm, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có bào t Quả th có màu cam đỏ, hình trụ dài, ph a đ u th có màu tr ng, th tr n Quả th có màu cam, hình trụ thuôn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt 94 80 34,67 ±0,44 76,47 ±0,04 3,33 ±0.04 90 34,00 ±0,67 76,53 ±0,04 3,47 ±0,09 80 40,33 ±0,44 50,23 ±0,25 3,57 ±0,11 90 40,33 ±0,44 50,20 ±0,07 3,63 ±0,09 CM32 CM34 Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thuôn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Hình 3.61 Hình ảnh mẫu sau ni trồng độ ẩm 80% 95 Hình 3.62 Hình ảnh mẫu sau nuôi trồng độ ẩm 90% Như vậy, khoảng độ ẩm phù hợp cho sinh trưởng phát tri n th nấm 80% - 90% f) Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành phát triển thể nấm Cordyceps militaris Đ nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả hình thành phát tri n th nấm Cordyceps militaris tiến hành bố tr th nghiệm ba u kiện nhiệt độ khác Kết th nghiệm trình bày bảng sau: 96 Bảng 3.24 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả hình thành phát triển thể Cordyceps militaris M u CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 CM32 CM34 Nhiệt độ (oC) 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 20 22 24 Thời gian hệ sợi ăn k n b mặt chất (ngày) 8 6 5 5 5 6 5 5 Thời gian hình thành th (ngày) 17 11 12 16 14 15 13 10 11 17 15 15 12 10 11 12 10 11 16 12 12 14 10 12 Thời gian thu hoạch th (ngày) A 63 56 57 60 57 58 56 50 52 62 60 61 55 52 54 62 56 58 55 50 52 61 55 56 B Hình 3.63 Hình ảnh mẫu CM18 sau hệ sợi ăn lan kín bề mặt chất (A) sau nuôi sáng ngày (B) nhiệt độ 22oC 97 Từ kết thí nghiệm trên, nhận thấy nhiệt độ có ảnh hưởng đến sinh trưởng phát tri n th Cordyceps militaris Quan sát sinh trưởng th nhiệt độ 20oC nhận thấy: sinh trưởng th nhiệt độ Quả th phát tri n chậm Nhận thấy th nhỏ, ng n, ph n đế th khơ So sánh thời gian hình thành th thời gian thu hoạch th ba nhiệt độ khác nhận thấy rằng: nhiệt độ 22oC 24oC tiêu thu thập đ u khơng có khác biệt rõ rệt Kết nghiên cứu trình bày bảng sau: Bảng 3.25 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng thể Mẫu Nhiệt độ (%) Số lƣợng thể TB/hộp Chiều dài thể mm Đƣờng kính thể mm 22 22,00 ± 0,67 51,70 ±0,07 2,53 ±0,04 24 22,67 ± 0,44 51,77 ±0,04 2,67 ±0,09 22 23,33 ± 0,44 32,90 ±0,13 2,37 ±0,09 24 23,00 ± 0,67 32,90 ±0,07 2,37 ±0,04 22 28,33 ± 0,44 66,50 ±0,10 2,20 ±0,07 24 28,33 ± 0,89 65,23 ±0,04 2,10 ±0,07 22 35,33 ± 0,44 48,23 ±0,04 2,33 ±0,04 24 35,67 ± 0,89 48,30 ±0,04 2,37 ±0,11 22 25,00 ± 0,44 59,77 ±0,04 2,57 ±0,04 24 25,67 ± 0,44 60,03 ±0,04 2,10 ±0,07 22 35,33 ± 0,44 52,23 ±0,04 2,60 ±0,07 24 35,33 ± 0,44 52,97 ±0,04 3,10 ±0,13 22 34,67 ± 0,44 80,60 ±0,07 3,33 ±0,04 CM1 CM2 CM7 CM13 CM18 CM29 CM32 Đặc điểm thể Quả th có màu cam đậm, hình trụ thuôn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có bào t Quả th có màu cam đỏ, hình trụ dài, ph a đ u th có màu tr ng, th trịn Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thuôn dài, đ u th 98 Mẫu Nhiệt độ (%) Số lƣợng thể TB/hộp Chiều dài thể mm Đƣờng kính thể mm 24 34,33 ± 1,11 88,63 ±0,04 3,57 ±0,04 22 40,33 ± 0,44 50,27 ±0,04 3,57 ±0,16 24 40,33 ± 1,11 50,13 ±0,04 3,50 ±0,13 CM34 Đặc điểm thể nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt  Xét ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng thể mẫu CM1, CM13, CM29, CM32, CM34 Căn vào bảng số liệu nhận thấy m u đ u có chung đặc m th Quả th có màu cam, hình trụ thn dài, đ u th nhọn, gi a th có rãnh nhỏ, th dẹt Sau khoảng thời gian nuôi trồng chất tổng hợp, nhận thấy m u CM32 có k ch thước thước th vượt trội th nh ng m u lại mà thời gian thu hoạch ng n (50 - 52 ngày) Hình 3.64 Hình ảnh mẫu CM32 nhiệt độ 22oC - 24oC sau 50 52 ngày nuôi trồng Ở m u CM1, CM29, CM34 nhận thấy sinh trưởng th tương đối giống Sau nuôi trồng chất tổng hợp, chi u dài th m u đ u > 50 mm Quả th đ u phát tri n tốt môi trường nhân tạo Quan sát sinh trưởng m u lại CM13, nhận thấy sau nuôi trồng chất tổng hợp chi u dài th đạt 48,23 - 48,30 mm sau 60 ngày nuôi trồng Quả th đ u, sinh trưởng phát tri n nhanh môi trường nhân tạo 99 Hình 3.65 Hình ảnh mẫu CM1, CM29, CM34 nhiệt độ 22oC 24oC sau nuôi trồng giá thể tổng hợp Hình 3.66 Hình ảnhmẫu CM13 sau nuôi trồng 58 ngày nhiệt độ 22oC 24oC 100  Xét ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng thể mẫu CM2, CM7, CM18 Căn vào bảng số liệu nhận thấy m u đ u có chung đặc m th là: Quả th có màu cam, hình trụ, đ u th tr n, ph a đ u có chấm tr ng Sau khoảng thời gian nuôi trồng chất tổng hợp, nhận thấy m u CM7 có kích thước thước th vượt trội th nh ng m u lại mà thời gian thu hoạch ng n (50 -– 52 ngày) Hai m u lại nhận thấy đ u sinh trưởng phát tri n tốt mơi trường ni cấy tổng hợp Hình 3.67 Hình ảnh mẫu CM7 sau nuôi trồng chất tổng hợp nhiệt độ 22oC 24oC Như vậy, khoảng nhiệt độ phù hợp cho sinh trưởng phát tri n th nấm 22oC - 24oC 101 KẾT LUẬN Kết luận Thu thập 12 m u nấm VQG Hoàng Liên – Lào Cai độ - cao khoảng 2200m Các m u xác định Cordyceps militaris dựa vào đặc m hình thái bên ngồi k hiệu sau: CM1, CM2, CM5, CM6, CM7, CM13, CM14, CM18, CM24, CM28, CM29, CM32, CM34 Đã định danh phân t cho 08 m u CM1, CM2, CM7, CM13, - CM18, CM29, CM32, CM34 Cordyceps militaris - Phân lập giống gốc cho 08 m u Cordyceps militaris, tỉ lệ phân lập m u cao đạt 73,33% (CM32) tỉ lệ phân lập m u thấp đạt 33,33% (CM2) - Môi trường nhân giống cấp thích hợp PGA - Mơi trường nhân giống cấp phù hợp M2: 20g/l Glucose + 0,1g/l MgSO4.7H2O + 0,1g/l KH2PO4 + 5g/l cao nấm men + 5g/l Pepton + 5g/l bột nhộng khô Tốc độ nuôi l c giống cấp 150 vịng/phút Mơi trường chất tổng hợp ph hợp cho nuôi trồng th là: - 18g/hộp gạo lứt khô + 25g/l glucose + 10g/l nhộng tươi nghi n nhỏ + 0,5g/l KH2PO4, 1g/l cao nấm men, 3g/l Pepton + 20ml/l gồm nước dừa, nước chiết malt Đi u kiện ph hợp cho nuôi trồng th là: Cường độ chiếu sáng - 700 lux với thời gian 12 giờ/ngày; độ ẩm 80 %-90%; nhiệt độ 22oC - 24oC Kiến nghị - Xác định hàm lượng hoạt chất m u nuôi trồng - Đánh giá đặc m di truy n m u qua hệ 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban, Lưu Tham Mưu (2009), Đông trùng hạ thảo, Nxb Y học, Hà Nội Nguyễn Thị Hậu (2014), Luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” PGS.TS Vũ Văn Liết (2009), Giáo trình quỹ gen bảo tồn quỹ gen Đoàn Minh Quân, Đinh Minh Hiệp (2014), “Nghiên cứu tách chiết ergosterol thử nghiệm hoạt tính kháng phân bào cao ether dầu hỏa từ sinh khối nấm Cordyceps spp Việt Nam”, Kỷ yếu hội nghị Nấm học nghiên cứu ứng dụng khu vực ph a nam năm 2014, tr.89 Tr n Văn Tú (2011), Luận văn thạc sỹ “Nghiên cứu thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn Quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai” Nguyễn Mậu Tuấn, Nguyễn Thái Huy, Trương Phi H ng, Lê Thị Thơ, Nguyễn Kim Chi (2013), “Một số kết nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Lâm Đồng”, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát tri n sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.51-55 Nguyễn Mậu Tuấn, Trương Phi H ng, Nguyễn Thái Huy, Dương Thị Ngọc (2009), “ iệu dịch chiết nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu, Paecilomyces tenuipes đến khả bơi chuột”, Tạp chí khoa học cơng nghệ nông nghiệp Việt Nam, 2(15), tr.110-115 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà, Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link Phạm Quang Thu (2009), “Điều tra phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps nutans pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử - Sơn Động - Bắc Giang”, Tạp chí Nơng nghiệp Phát tri n Nông thôn, (4) 10 Phạm Quang Thu (2009), “Phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps gunni Berk Tại vườn quốc gia Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc” Tạp chí Nơng nghiệp Phát tri n Nơng thơn, (6), Tr 96-99 103 11 Phạm Quang Thu (2013), “Đông trùng hạ thảo nghiên cứu nuôi trồng thể Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam”, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát tri n sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.45-50 12 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà (2011), Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi nuôi cấy khiết chủng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr) Link.- , tr.400-408 13 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2009), “Phát nấm nhộng trùng hạ thảo Cordyceps militaris LINK vườn quốc gia Hồng Liên tỉnh Lào Cai”, Tạp chí Nông nghiệp Phát tri n Nông thôn, (9) 14 Phạm Thị Th y (2010), “Nghiên cứu phát triển nguồn nấm Beauveria Metarhizium để ứng dụng phòng trừ sâu hại trồng, rừng phát nguồn nấm Cordyceps sp làm thực phẩm chức cho người”, Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, tr.224-231 15 Tr n Minh Trang, Đinh Minh Hiệp, Huỳnh Thư (2014), “Tách chiết exopolysaccharite từ dịch nuôi cấy nấm Cordyceps sinensis khảo sát hoạt tính kích thích tăng sinh PBMC”, Kỷ yếu hội nghị Nấm học nghiên cứu ứng dụng khu vực ph a nam năm 2014, tr.87 Tài liệu Tiếng Anh 16 Das S.K (2009), Production of anti-cancer agent cordycepin from the medicinal mushroom Cordyceps militaris, A Dissertation of Doctor of Engineering, University of Fukui, Japan 17 Holliday J., Cleaver P., Loomis-Powers M., Patel D (2004), “Analysis of Quality and Techniques for Hybridization of Medicinal Fungus Cordyceps sinensis”, International Journal of Medicinal Mushrooms, 6, pp 147-160 18 Itoh H., Shioda T., Matsura T., Koyama S., Nakanishi T., Kajiyama G., Kawasaki T (1994), “Iron ion induces mitochondrial DNA damage in HTC Rat Hepatoma Cell Culture - Role of antioxidants in mitochondrial DNA protection from oxidative stresses”, Arch Biochem Biophys, 313(1), pp.120 – 125 19 Sun Y.J., Lü P., Ling J.Y., Zhang H.X., Chen C., Zhang C.K (2003), “Nucleosid from Cordyceps kyushuensis and the distribution of two active components in its different parts”, Yao Xue Xue Bao, 38(9), pp 690-694 104 20 Sung J.H., Jones N.L.H., Sung J.M., Luangsa-ard J.J., Shrestha B., Spatafora J.W (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi, Studies in Mcology, 57, pp.5–59 21 Xie J.W., Huang L.F., Hu W., He Y.B., Wong K.P (2010), “Analysis of the main nucleosids in Cordyceps sinensis by LC/ESI-MS”, Molecules, 15, pp 305-314 22 Yoshikawa N., Nakamura K., Yamaguchi Y., Kagota S., Shinozuka K., Kunitomo M (2007), “Reinforcement of antitumor effect of Cordyceps sinensis by 2’ – Deoxycoformycin, an adenosin deaminase inhibitor”, in vivo, 21, pp.291-296 23 Zhang Z.S., Wang F., Wang X.M., Liu X.L., Hou Y., Zhang Q.B (2010), “Extraction of the polysaccharids from five algae and their potential antioxidant activity in vitro”, Carbohyd Polym, 82, pp.118-121 24 Zhou X., Gong Z., Su Y., Lin J., Tang K (2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions and developmental products”, Journnal of Pharmacy and Pharmacology, 61, pp.279-291