Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng để phân lập nhân giống và nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo cordyceps militaris

TĨM TẮT Tên đề tài: “Nghiên cứu mơi trường dinh dưỡng để phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông Trùng Hạ Thảo Cordyceps militaris” Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Bảo Trân Mã SV: 1811507410113 Lớp: 18SU Nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris loại nấm dược liệu quý, có giá trị kinh tế cao, mà q trình nhân giống ni trồng nấm thối hóa hệ sợi nấm ảnh hưởng nhiều đến chất lượng thể Vì đề xuất đề tài nhằm khảo sát so sánh thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi trình nhân giống từ bào tử từ mô tế bào Nghiên cứu tiến hành ba mẫu nấm lấy vùng khác (Đà Nẵng, Bình Dương, Hà Nội) Trong nghiên cứu xác định môi trường phân lập tối ưu MP300, môi trường nhân giống cấp 200g/l Khoai tây + 25g/l Bột bắp – cám gạo + 200g/l giá đỗ + 20g/l glucose + 5g/l pepton + 0,25g/l K2HPO4 + 0,25g/l MgSO4 + 20g/l agar mơi trường nhân giống dịch thể thích hợp cho việc nhân nuôi thu sinh khối sợi tốt 20g/l glucose + 5g/l pepton + 5g/l cao nấm men + 0,25g/l KH2PO4 + 0,25g/l MgSO4 Chọn giống mẫu dịch thể phát triển tốt sang tiến hành giai đoạn ươm sợi ni trồng cơng thức: 30g gạo lứt/bình + 50ml dịch khoáng (100ml/l nước dừa + 200g/l Khoai tây + 1g/l vitamin B1 + 0,5g/l MgSO4.7H2O + 0,25g/l KH2PO4) Sau q trình nhân giống ni trồng nhận thấy giống nấm phân lập từ bào tử đơn cho suất hình thái vượt trội hẳn giống nấm phân lập từ mô tế bào Do nên lựa chọn giống nấm phân lập từ bào tử để tiến hành nghiên cứu nhân giống nuôi trồng nhằm đảm bảo chất lượng sản phẩm TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT KHOA CÔNG NGHỆ HĨA HỌC – CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc MÔI TRƯỜNG NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Trần Thị Phú Nguyễn Đức Bảo Trân Mã SV: 1811507410113 Tên đề tài: Nghiên cứu mơi trường thích hợp để phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps militaris) Các số liệu, tài liệu ban đầu:  Tài liệu tham khảo: - Nguyễn Thị Minh Hằng, Bùi Văn Thắng (2017),Nghiên cứu môi trường nấm Đông Trùng Hạ Thảo Cordyceps militaris giá thể tổng hợp nhộng tằm, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ lâm nghiệp, 4:10-16 - Phạm Quang Thu (2013), Đông trùng hạ thảo nghiên cứu nuôi trồng thể Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát triển sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr 45-50 - Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn Việt Nam Tập Hà Nội: Nhà xuất Khoa học tự nhiên cơng nghệ Nội dung đồ án: - Mở đầu - Đối tượng – Phạm vi – Phương pháp nghiên cứu - Nội dung nghiên cứu: Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng loại mơi trường dinh dưỡng đến q trình phân lập giống nấm Đông trùng hạ thảo Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển giống nấm Đông trùng hạ thảo cấp Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng dịch lỏng đến khả sinh trưởng phát triển giống nấm Đông trùng hạ thảo cấp Nội dung 4: Nghiên cứu khả sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm giai đoạn nuôi trồng Các sản phẩm dự kiến Xác định môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng tới phát triển giống nấm Đông Trùng Hạ Thảo môi trường thạch dịch lỏng Ngày giao đồ án: Ngày nộp đồ án: Trưởng Bộ môn Đà Nẵng, ngày tháng 20… Người hướng dẫn năm LỜI CẢM ƠN Khoảng thời gian học tập Trường Sư Phạm Kỹ Thuật – Đại học Đà Nẵng khoảng thời gian quý báu đáng nhớ em Tại em có hội học tập, rèn luyện không lý thuyết mà thực hành Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường tạo điều kiện cho em học tập, tham gia nghiên cứu trường Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS Trần Thị Phú, người hướng dẫn giúp đỡ tận tình khơng mặt chun mơn, mà động viên mặt tinh thần để em hồn thành tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cô khoa Cơng nghệ Hóa học – Mơi trường tạo điều kiện, quan tâm giúp đỡ em suốt trình học tập Đồng thời, em gửi lời cảm ơn đến thầy cô môn Công nghệ sinh học truyền đạt, rèn luyện kiến thức, kỹ để giúp em có thêm hành trang quan trọng đường tương lai Qua em xin cảm ơn đến Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng giúp đỡ tạo điều kiện để em hồn thành tốt đồ án Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Dương Thúy Hà – người trực tiếp hỗ trợ em, sai sót, lời khuyên bổ ích truyền đạt cho em kinh nghiệm lĩnh vực đề tài Cuối em xin gởi lời cảm ơn đến người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên giúp đỡ em vật chất lẫn tinh thần, nguồn động lực lớn lao để em vượt qua khó khăn học tập hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Em xin chân thành cảm ơn! CAM ĐOAN Em xin cam đoan đồ án tốt nghiệp công trình nghiên cứu em hướng dẫn TS Trần Thị Phú, số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực Mọi nguồn thông tin sử dụng đồ án rõ nguồn gốc MỤC LỤC Nhận xét người hướng dẫn Nhận xét người phản biện Tóm tắt Nhiệm vụ đồ án tốt nghiệp Lời cảm ơn Cam đoan Danh sách bảng Danh sách hình vẽ Danh sách ký hiệu, chữ viết tắt MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược nấm Cordyceps militaris 1.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy nấm C.militaris Việt Nam giới Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, phạm vi vật liệu nghiên cứu 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 10 2.3 Phương pháp nghiên cứu 10 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1 Ảnh hưởng môi trường mơi trường dinh dưỡng đến q trình phân lập giống nấm C.militaris 16 3.2 Ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống cấp 23 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả tạo sinh khối sợi môi trường dịch lỏng 25 3.4 Khả sinh trưởng phát triển giống nấm giai đoạn nuôi trồng 29 KẾT LUẬN 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thiết bị, dụng cụ hóa chất Bảng 2.2: Các môi trường phân lập từ mô nấm 11 Bảng 2.3: Các môi trường phân lập từ bào tử 12 Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường nhân giống cấp 13 Bảng 2.5: Môi trường nhân giống dịch lỏng cấp 14 Bảng 3.1: Kết qủa phân lập ba mẫu từ thể 16 Bảng 3.2: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Cordyceps militaris phân lập từ thể 18 Bảng 3.3: Kết phân lập từ bào tử 21 Bảng 3.4: Khả sinh trưởng bào tử mẫu C môi trường phân lập 22 Bảng 3.5: Đường kính sinh trưởng hệ sợi nấm môi trường nhân giống cấp 23 Bảng 3.6: Ảnh hưởng sinh trưởng hệ sợi nấm dạng dịch thể 30 Bảng 3.7: Kết nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng thể 33 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” 3.2 Ảnh hưởng loại môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Cordyceps militaris giai đoạn nhân giống cấp Thí nghiệm tiến hành bố trí mơi trường PGA cải tiến (CT1) có bổ sung nguồn chất khác bột bắp – cám gạo, giá đỗ (CT2) giá đỗ (CT3) trình bày bảng 2.4 Môi trường nuôi cấy hấp khử trùng nhiệt độ 121 oC 20 phút Sau cấy giống mẫu ni điều kiện 25oC, tối hoàn toàn Và tiến hành theo dõi sinh trưởng hệ sợi qua mốc thời gian ngày, ngày, ngày, 11 ngày Kết thể cụ thể bảng 3.5 Bảng 3.5: Đường kính sinh trưởng hệ sợi nấm mơi trường nhân giống cấp Chiều dài lan sợi hệ sợi nấm (mm) Mật Công Mẫu độ hệ thức ngày 11 ngày sợi A (quả thể) B (quả thể) C (bào tử) Ghi chú(+) Yếu CT1 29,6 35,7 56,7 61,6 ++ CT2 51,2 64,5 89,4 94,9 +++ CT3 45,0 73,6 72,3 82,2 ++ CT1 10,4 23,4 45,5 59,5 ++ CT2 34,3 49,8 85,4 93,4 +++ CT3 22,3 41,1 65,2 60,9 ++ CT1 21,1 47,8 63,6 75,6 +++ CT2 37,9 50,6 71,0 96,2 +++ CT3 13,5 26,8 53,2 77,9 ++ (++) Trung bình (+++) Dày Kết nghiên cứu dựa vào số liệu bảng 3.5 cho thấy, môi trường dinh dưỡng nấm sinh trưởng phát triển tốt Tuy nhiên chúng có khác tốc độ lan tơ, thời gian ăn kín hình thái hệ sợi Yếu tố dẫn đến khác thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy Môi trường CT1 môi trường không bổ sung nguồn chất nên tốc độ sinh trưởng hệ sợi ba mẫu chậm mơi trường CT2 CT3, cịn mơi trường CT2, CT3 mơi trường có bổ sung giá đỗ cà rốt mơi trường CT2 có giá đỗ mơi trường giàu dinh dưỡng nhất, tốc độ sinh trưởng hệ sợi mẫu nấm > 90mm sau 11 ngày cấy Mơi trường CT3 cho tốc độ sinh trưởng hệ sợi nhanh chậm môi trường CT3 Nguyên nhân dẫn đến môi trường CT2 môi trường giàu dinh dưỡng mơi trường có bổ sung thêm giá Vì theo Nguyễn Cơng Khẩn cộng (2010) [16], Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 23 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” 100g giá có 86,5g nước, 44 Kcal, 5,5g protein, 0,2g lipid, 5,1g glucid, 2g Celluloza, 4,13 sugar, 38g canxi, 1,40g sắt, 17g magie, 164g đồng, 23g natri, 0,2g B1, 0,13g B2, 0,088g B6, 0,8g PP, 10g vitamic C, ngồi cịn có acid amin thiết yếu khác: Lysin 274mg, Valin 324mg, Cystin 43mg, Tyrosin 129mg Có thể thấy giá chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết mà ta cần bổ sung thêm vào môi trường nhân giống Cordyceps militaris Hình 3.8: Mẫu C mơi trường CT1 sau ngày nuôi cấy CT3 sau 11 ngày ni cấy Quan sát bảng 3.5 hình 3.8, sau ngày nuôi cấy nhận thấy: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi mẫu C môi trường CT1 (21,1mm) có đường kính khuẩn lạc lớn mơi trường CT3 (13,5 mm) Nhưng sau 11 ngày nuôi cấy đường kính khuẩn lạc CT1 (75,6mm) lớn CT3 (77,9 mm) Điều có nghĩa sau ngày ni cấy mơi trường CT1 đường kính khuẩn lạc phát triển nhanh đến ngày thứ 10, với mơi trưởng CT3 sau 10 ngày ni cấy đường kính khuẩn lạc bắt đầu phát triển nhanh Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 24 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” a b Hình 3.9: Mẫu A (trái) B (phải) sau ngày ni cấy Qua hình 3.9 cho thấy thay đổi đặc điểm hình thái sợi nấm mọc qua khoảng thời gian xác định loại môi trường khác Sau ngày từ mô hệ sợi cấy ban đầu, hệ sợi môi trường bắt đầu ăn lan xung quanh, tạo khuẩn lạc, hệ sợi mỏng, màu trắng Sau ngày hệ sợi dần chuyển sang màu vàng cam CT1 CT2 Với mơi trường CT3 sau 10 ngày hệ sợi dần chuyển sang màu vàng cam Từ kết nghiên cứu, công thức nhân giống cấp để hệ sợi nấm C.militaris phát triển tốt CT2 với thành phần: 200g/l Khoai tây + 25g/l Bột bắp – cám gạo + 200g/l giá đỗ + 20g/l glucose + 5g/l pepton + 0,25g/l K2HPO4 + 0,25g/l MgSO4 + 20g/l agar 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thành phần môi trường đến khả tạo sinh khối sợi môi trường dịch lỏng Sau có giống nấm cấp tuổi (hệ sợi nấm phát triển kín tồn bề mặt chất) ta tiến hành nhân giống hệ sợi sang môi trường lỏng bình trụ 500ml Mục đích q trình giúp hệ sợi nấm thích nghi với điều kiện nuôi cấy lỏng Chuẩn bị môi trường trình bày bảng 2.5, điều chỉnh pH mơi trường 6, đem hấp tiệt trùng 121oC 20 phút Sau ni sợi nhiệt độ, với tốc độ lắc 150 vòng/phút Để đánh giá ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng giống nấm nghiên cứu ba mơi trường dịch thể ta tiến hành nhân giống công thức với hàm lượng nitơ khác trình bày bảng 2.5, để tìm mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho phát triển hệ sợi giống nấm Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 25 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Theo dõi trình sinh trưởng hệ sợi môi trường lỏng nhận thấy rằng: sau ngày ni lắc mẫu thạch bắt đầu tăng lên kích thước sau – ngày bắt đầu xuất hạt có kích thước nhỏ lơ lửng môi trường Các hạt tạo thành hệ sợi nấm sinh trưởng, nhân lên môi trường tác dụng lực lắc xoay tròn kết lại với mà tạo thành Trong trình cấy giống, thao tác phải thực điều kiện vô trùng cách cẩn thận để hạn chế tỉ lệ nhiễm vi sinh vật khác lạ không mong muốn Và sau ngày nuôi cấy quan sát thấy giống nấm giai đoạn thời điểm dễ phát giống nấm có bị nhiễm hay khơng Nếu bị nhiễm, chai giống chuyển màu nâu sậm đục, có mùi khác lạ (đa phần có mùi khó chịu) Kết nghiên cứu trình bày sau: Hình 3.10: Kết nhân giống dịch thể ba giống nấm Các giống nấm nghiên cứu Bố trí thí nghiệm A (quả thể) B (quả thể) C (bào tử) Lần Lần Lần Lần Lần Ghi chú: MTL1 + - + MTL2 + - ++ MTL3 ++ - ++ MTL1 - + + MTL2 ++ - + MTL3 + - + MTL1 - - - MTL2 + - ++ MTL3 ++ - ++ MTL1 + - + MTL2 - - - MTL3 - - + MTL1 + - + MTL2 + + ++ MTL3 ++ - ++ (-) Nhiễm (+) Trung Bình (++) Tốt Khi tiến hành lần lặp lại ba giống nấm A (quả thể), B (quả thể), C (bào tử) môi trường dịch lỏng nhận thấy tỷ lệ nhiễm ba mẫu tương đối cao, trình bày cụ thể sau: Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 26 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Tỷ lệ mẫu nhiễm 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% A (quả thể) MTL1 B (quả thể) MTL2 C (bào tử) MTL3 Hình 3.11: Tỷ lệ nhiễm hai giống nấm mơi trường dịch lỏng Quan sát hình 3.11, thấy mẫu B (quả thể) cho tỷ lệ nhiễm cao (80 - 100%) chứng tỏ mẫu B khơng thích nghi mơi trường dịch thể lỏng Hoặc phần nguyên nhân chất lượng giống gốc ban đầu chưa đạt chất lượng cao Còn hai giống nấm A (quả thể) C (bào tử) cho tỷ lệ nhiễm thấp (20 - 40%) Và khả hệ sợi sinh trưởng phát triển ổn định ba môi trường dịch thể ni cấy Do đó, lựa chọn giống nấm A (quả thể) giống nấm C (bào tử) tiếp tục khảo sát sinh trưởng hệ sợi môi trường dịch lỏng Sẫm màu Nhiễm Hình 3.12: Mẫu nhiễm Sau loại bỏ mẫu nhiễm tiếp tục tiến hành theo dõi mẫu lại Và tiếp tục quan sát mẫu sau ngày nuôi lắc dịch lượng sinh khối sợi đường kính khuẩn lạc Kết nghiên cứu trình bày sau: Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 27 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” 1.65 1.6 1.6 0.99 0.98 0.96 1.55 0.94 1.5 0.92 1.45 0.89 1.4 1.4 0.9 0.88 1.35 0.86 1.3 0.84 A (quả thể) C (bào tử) Kích thước khuẩn lạc Sinh khối sợi (g/100ml/7 ngày) Kích thước khuẩn lạc cầu (mm) MTL1 Sinh khối sợi Hình 3.13: Giống nấm A C môi trường dịch lỏng MTL1 sau ngày nuôi dịch Quan sát MTL1 sau ngày lắc dịch nhận thấy hệ sợi phát triển chậm, lượng sinh khối thu không nhiều cịn đường kính khuẩn lạc nhìn chung hai giống nấm nhỏ Khối lượng hệ sợi nhiều gây ảnh hưởng lớn đến việc sử dụng vật liệu cho cơng đoạn q trình ni cấy Xét sinh trưởng hai giống nấm nuôi cấy mơi trường MTL2 trình bày cụ thể qua hình 3.15 2.1 1.03 1.9 1.8 1.7 0.92 1.7 1.6 1.5 A (quả thể) 1.04 1.02 0.98 0.96 0.94 0.92 0.9 0.88 0.86 C (bào tử) Kích thước khuẩn lạc sinh khối sợi (g/100ml/7 ngày) Kích thước khuẩn lạc cầu (mm) MTL2 Sinh khối sợi Hình 3.14: Hai giống nấm môi trường dịch lỏng MTL2 sau ngày nuôi dịch Tiếp tục quan sát hai giống nấm nuôi cấy môi trường nhận thấy hệ sợi phát triển chậm, lượng sinh khối thu khơng nhiều, đường kính khuẩn lạc nhìn chung hai giống nhỏ Xét sinh trưởng hai giống nấm ni cấy mơi trường MTL3 trình bày cụ thể hình 3.16 Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 28 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” 3.92 3.9 3.88 3.86 3.84 3.82 3.8 3.78 3.76 3.74 3.9 3.8 1.3 1.25 A (quả thể) 1.31 1.3 1.29 1.28 1.27 1.26 1.25 1.24 1.23 1.22 C (bào tử) Kích thước khuẩn lạc Sinh khối sợi (g/100ml/7 ngày) Kích thước khuẩn lạc cầu (mm) MTL3 Sinh khối sợi Hình 3.15: Hai giống nấm môi trường dịch lỏng MTL3 sau ngày nuôi dịch Quan sát môi trường MTL3 nhận thấy hệ sợi phát triển nhanh, lượng sinh khối thu nhiều đường kính hai giống nấm đa số to Trong lượng sinh khối hệ sợi thu nhiều mẫu C (bào tử) đạt 1,3 (g/l) sau ngày lắc dịch Nhìn chung tổng thể khối lượng ba mẫu thu sau ngày lắc dịch môi trường cao, hệ sợi phát triển đồng Vì chọn môi trường MTL3 gồm 20g/l glucose + 5g/l pepton + 5g/l cao nấm men + 0,25g/l KH2PO4 + 0,25g/l MgSO4.7H2O làm môi trường dinh dưỡng để nhân giống giai đoạn dịch thể 3.4 Khả sinh trưởng phát triển giống nấm giai đoạn nuôi trồng 3.4.1 Khả thích nghi hệ sợi giống nấm Giai đoạn ươm sợi giai đoạn quan trọng, giai đoạn nấm cần thích nghi mơi trường hỗn hợp Tìm môi trường hỗn hợp tối ưu cho nấm phát triển bước then chốt định tỉ lệ hình thành thể sau Thành phần công thức nuôi trồng có vai trị quan trọng đến sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Cordyceps militaris Dựa vào nghiên cứu trước gạo lứt nguồn chất thích hợp cho sinh trưởng, phát triển nấm Cordyceps militaris Vì gạo lứt hạt gạo giữ nguyên vỏ cám nên phần hạn chế độ kết dính hạt gạo với nhau, sau hấp nhiệt độ cao, môi trường chất có độ xốp tạo khoảng trống hạt gạo giúp hệ sợi ăn kín nhanh Ngồi nguồn nitơ muối khống ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm Chính vậy, tơi lựa chọn cơng thức 30g gạo lứt/bình + 50ml dịch khống (100ml/l nước dừa + 200g/l Khoai tây + 1g/l vitamin B1 + 0,5g/l MgSO4.7H2O + 0,25g/l KH2PO4) Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 29 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” làm môi trường khảo sát khả sinh trưởng phát triển hệ sợi nấm dạng dịch thể hai giống nấm khác Qua thời gian nghiên cứu theo dõi thu kết sau: Bảng 3.6: Ảnh hưởng sinh trưởng hệ sợi nấm dạng dịch thể lên môi trường nuôi trồng Chỉ tiêu theo dõi Mẫu A (quả thể) C (bào tử) Ghi chú: ( ++) Trung bình Mật độ hệ sợi Tỷ lệ nhiễm Thời gian ươm (%) sợi (ngày) 22% 10 +++ 33% 13 ++ (+++) Dày Trong giai đoạn ươm sợi nấm C.militaris, nhiễm bệnh tượng không mong muốn ảnh hưởng lớn đến thành công, suất chất lượng nấm Nấm C.militaris bị nhiễm mốc xanh đen bề mặt môi trường tổng hợp Nguyên nhân q trình trùng chưa đảm bảo, thao tác cấy, vệ sinh phòng, dụng cụ nhiễm chéo từ thí nghiệm vi sinh khác Cần khắc phục yếu tố để giảm tối thiểu tỷ lệ nhiễm góp phần nâng cao hiệu nuôi trồng Qua bảng 3.6, cho thấy cấy giống dạng dịch thể hai giống nấm khác hệ sợi nấm phát triển tốt môi trường nuôi trồng cho tỷ lệ nhiễm thấp qua lần lặp lại Trong giai đoạn ươm sợi thời gian hệ sợi nấm ăn kín bề mặt chất hai mẫu nghiên cứu dao động từ 10 - 13 ngày Đối với mẫu C: sau thời gian ươm sợi tỷ lệ giống ăn bề mặt chất cao đạt khoảng 78% Hệ sợi hai giống nấm mọc dày, trắng mượt, phát triển kín bình nuôi trồng ươm điều kiện tối dần chuyển sang màu vàng chiếu sáng Ở giống nấm A hệ sợi trắng hẳn, dày mịn giống nấm C Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 30 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Hình 3.16: Dịch thể ni cấy sau 10 ngày 3.4.2 Khả hình thành phát triển thể nấm Hệ sợi sau ăn kín chất chuyển sang nhà ni trồng cho thể Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian hình thành mầm thể (ngày), thời gian phát triển thành trưởng thành (ngày) Các bình nấm sử dụng thí nghiệm bình có chất lượng sợi tốt Hình 3.17: Hệ sợi sau chuyển sang nhà ni trồng Sau hệ sợi phát triển thành thục chúng sản sinh tạo thành thể nấm Số lượng chất lượng thể nấm bị chi phối mạnh mẽ nhiều yếu tố Trong đó, ánh sáng nhiệt độ hai nhân tố tác động nhiều Theo Shrestha et al (2006) cho thấy nhiệt độ sinh trưởng thích hệ hợp 20oC ánh sáng thích hợp cho phát triển Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 31 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” thể nấm cường độ ánh sáng 500lux Sau kích thích hệ sợi điều kiện vật lý (thay đổi nhiệt độ, chu kỳ sáng tối) sau thời gian ươm sợi - ngày hệ sợi dần chuyển sang màu vàng Nhưng giống C tới tận – ngày hệ sợi dần chuyển sang màu vàng Hình 3.18: Sau ngày ni trồng Sau thời gian ươm sợi ngày giống A xuất đinh ghim giống C lúc sợi nấm chuyển sang màu vàng chưa thấy thấy có dấu hiệu kết dính, đến ngày thứ sợi nấm chuẩn bị kết đinh ghim Sau sợi nấm kết đinh ghim hình thành thể Và kết hình thành phát triển giống nấm thu hình 3.20 Ngày 70 63 60 54 50 40 30 22 17 20 10 A (quả thể) Thời gian bật mầm thể C (bào tử) Thời gian cho thu hoạch Hình 3.19: Khả hình thành giống nấm Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 32 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Quan sát thấy hai giống cho thể mọc đơn thành chùm nhô lên khỏi bề mặt mơi trường có màu vàng cam, đỉnh nhọn, tốc độ phát triển nhanh Nhưng khả hình thành mầm thể tốc độ hình thành thể mẫu giống A 17 ngày 54 ngày vượt trội hẳn mẫu giống C So sánh thời gian hình thành mầm thể thời gian thu hoạch thể hai giống nấm khác tiêu thu thập có khác biệt rõ rệt Kết nghiên cứu trình bày bảng sau Bảng 3.7: Kết nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng thể Mẫu A (quả thể) C (bào tử) Kích thước thể (mm) Chiều dài thể Đường kính thể 64,31 2,33 60,11 4,43 Mặc dù thời gian hình thể giống A (54 ngày) nhanh giống C (64 ngày) tận ngày số lượng thể giống C lại tăng lên đường kính thể lớn gấp lần giống A Và đặc điểm hình thái hai giống nấm có khác biệt Hình 3.20: Qủa thể sau ni trồng Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 33 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” Tiếp tục quan sát thấy giống C cho hình thái thể bắt mắt như: thể có màu cam Quả thể có màu cam nhạt, hình trụ thn dài, đầu thể nhọn, thể dẹt Còn giống A cho thể có màu cam nhạt, hình trụ thn dài, đầu thể nhọn, thể dẹt Qua nhận thấy rằng, giống nấm C phân lập từ bào tử cho hệ sợi phát triển chậm thời gian nuôi trồng chậm so với giống nấm A phân lập từ mơ tế bào suất hình thái thể C lại vượt trội hẳn giống A Do đó, nên chọn giống C phân lập từ bào tử để đảm bảo chất lượng suất sản phẩm Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 34 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” KẾT LUẬN Kết luận Mơi trường phân lập thích hợp hai giống nấm môi trường MP300 Môi trường nhân giống cấp hiệu CT2: : 200g/l Khoai tây + 25g/l Bột bắp – cám gạo + 200g/l giá đỗ + 20g/l glucose + 5g/l pepton + 0,25g/l K 2HPO4 + 0,25g/l MgSO4 + 20g/l agar Hệ sợi ăn lan nhanh nhất, khỏe ăn lan đồng khắp bề mặt môi trường Môi trường nhân giống cấp thích hợp cho việc nhân ni thu sinh khối sợi tốt 20g/l glucose + 5g/l pepton + 5g/l cao nấm men + 0,25g/l KH 2PO4 + 0,25g/l MgSO4 với tốc độ lắc 150 vòng/phút Qua q trình ni trồng, nhận thấy nên chọn phương pháp phân lập giống nấm từ bào tử cho suất chất lượng thể vượt trội hẳn so với giống nấm từ mô tế bào Kiến nghị Từ số kiết thu q trình nghiên cứu tơi đưa kiến nghị cho số đinh hương nghiên cứu tương lai sau: - Tiếp tục nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng hình thể như: hàm lượng khống, hàm lượng nitơ, nguồn cacbon so sánh tốc độ sinh trưởng thể giống sinh từ mô tế bào sinh từ bào tử đơn - Cần đánh giá đặc điểm di truyền qua hệ Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 35 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Quang Thu (2013), Đông trùng hạ thảo nghiên cứu nuôi trồng thể Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghê phục vụ phát triển sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr 45-50 [2] Trịnh Tam Kiệt (2011), Nấm lớn Việt Nam Tập Hà Nội: Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ, tr.101 [3] Nguyễn Mậu Tuấn, Nguyễn Thái Huy, Trương Phi Hùng, Lê Thị Thơ, Nguyễn Kim Chi, (2013), Một số kết nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Lâm Đồng, Hội thảo quốc tế Khoa học Công nghệ phục vụ phát triển sản xuất nông nghiệp công nghệ cao tỉnh Lâm Đồng, tr.51-55 [4] Hur, H (2008), Chemical ingredient of Cordyceps militaris, Mycobiology, 36(4), pp 233-235 [5] Shrestha, B., Y J Park, S K Han, S K Choi and I M Sung, (2004), "Instability in invitro fruiting of Cordyceps militaris," Joural Murshroom , no Sci Pro 2(3), pp 140144 [6] Trịnh Tam Kiệt (2012) Nấm lớn Việt Nam, Tập 2, Hà Nội: Nxb Khoa học tự nhiên Công nghệ [7] Chen, Y.S., Liu, B.L and Chang, Y.N., (2011), Effects of light and heavy metals on Cordyceps militaris fruit body growth in rice grain-based cultivation, Korean J Chem Eng, 28, pp 875-879 [8] Gao, X.H., WU, W., Qian, G.C and Wei, C (2000), Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris, Acta Agric Shanghai, 16, pp 93-98 [9] Hong, I.P., Kang, P.D., Kim, K.Y., Nam, S.H., Lee, M.Y., Choi, Y.S., Kim, N.S., Kim, H.K., Lee, K.G and Humber, R.A (2010) Fruit body formation on silkworm by Cordyceps militaris, Mycobiology, 38, pp.128-132 [10] Hassan, F.R.H., Ghada, M., Medany and Kady, E (2012) Mycelial biomass production of Enoke mushroom (Flamulina velutipes) by submerged culture, Australian journal of basic and applied science, 6(7):603-610 Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 36 Đề tài: “Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris” [11] Phạm Thị Thùy (2010) Kết điều tra nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps sp Việt Nam, Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 5:55-58 [12] Choi, Y.W, Hyde, K D & Ho, W.H (1999), Single spore isolation of fungi Fungal diversity [13] Nguyễn Thị Thanh Lan, Đinh Thị Ngọc Thúy, Nguyễn Thị Thanh Bình, (2016) Phân lập nấm ký sinh trùng Cordyceps spp giàu hoạt chất Beauricin từ vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 14(3), tr 533-538 [14] Trần Văn Tú (2011) Nghiên cứu thành phần lồi nấm Đơng trùng hạ thảo Vườn Quốc gia Hoàng Liên - Sapa - Lào Cai, luận văn Thạc sĩ, Trường Đại Học Thái Nguyên, 79tr [15] Nguyễn Thị Hồng (2019), Nghiên cứu phân lập – nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) Việt Nam, Luận văn Thạc sĩ, Trường Đại học Lâm Nghiệp [16] Nguyễn Công Khẩn, Nguyễn Thị Thắm, Hà Thị Anh Đào, Lê Hồng Dũng, Lê Bạch Mai, Nguyễn Văn Sĩ (2007), Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, NXB Y Học Tr 118 Sinh viên: Nguyễn Đức Bảo Trân Giáo viên hướng dẫn: TS.Trần Thị Phú 37 ... tài: ? ?Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris? ?? TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Quang Thu (2013), Đông trùng hạ thảo nghiên cứu nuôi trồng. .. Đề tài: ? ?Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris? ?? [11] Phạm Thị Thùy (2010) Kết điều tra nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps. .. ? ?Nghiên cứu môi trường phân lập - nhân giống nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris? ?? Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng môi trường mơi trường dinh dưỡng đến q trình phân