NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC. LUẬN ÁN TIẾN SĨ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Mai Hương PGS.TS Trần Liên Hà Hà Nội - 2015 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi; số liệu, kết quả, hình ảnh nêu Luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình tác giả khác Hà Nội, ngày TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Giáo viên HD PGS.TS Lê Mai Hƣơng Cồ Thị Thuỳ Vân CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Mai Hương, Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam PGS.TS Trần Liên Hà, Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu để tơi hồn thành Luận án này; Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội truyền đạt cho tơi kiến thức q báu giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập trường; Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới giúp đỡ, cộng tác cán phịng Nghiên cứu – Trung tâm cơng nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp; cán phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam; Tôi xin cảm ơn GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt cho lời khuyên dẫn cho nhiều kiến thức nấm lớn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc tồn thể cán cơng nhân viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình học tập, nghiên cứu để tơi hoàn thành nhiệm vụ học tập giao Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Cồ Thị Thùy Vân CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ MỤC LỤC TRANG MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng nấm dƣợc liệu 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm dược liệu 1.1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng nấm dược liệu chăm sóc sức khỏe cộng đồng 10 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học nấm dược liệu 15 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học nấm dược liệu nước ta 16 1.2 Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers 17 1.2.1 Giới thiệu nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers 17 1.2.2 Vị trí nấm Đầu khỉ phân loại nấm học 18 1.2.3 Đặc điểm hình thái thể số đặc tính sinh học nấm Đầu khỉ 18 1.2.4 Thành phần hóa học nấm Đầu khỉ H erinaceus 19 1.2.4.1 Một số thành phần dinh dưỡng nấm Đầu khỉ 1.2.4.2 Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ 1.2.5 Tình hình ni trồng nấm Đầu khỉ giới nước 19 20 25 1.2.6 Một số phương pháp sử dụng để tách polysaccharide từ 30 thể hệ sợi nấm dược liệu 1.2.6.1 Phương pháp tách chiết cồn 30 1.2.6.2 Phương pháp tách chiết nước nóng 30 1.2.6.3 Phương pháp tách chiết kiềm nóng kết hợp với hỗ trợ lị vi sóng siêu âm 31 1.2.6.4 Phương pháp tách chiết nước nóng kết hợp với hỗ trợ lị vi sóng siêu âm 32 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Vật liệu 34 2.2 Các loại môi trƣờng 36 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ i 39 CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 2.3.1.1 Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 39 2.3.1.2 Phân lập giống nấm Đầu khỉ 40 2.3.1.3 Nghiên cứu độ tuổi thể nấm thích hợp để phân lập giống gốc 41 2.3.1.4 Nghiên cứu điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 41 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể cấp 42 2.3.2.1 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp (dung tích 200 ml) 42 2.3.2.2 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp (dung tích 2000 - 5000 ml) 43 2.3.2.3 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng nuôi trồng nấm Đầu khỉ nguồn chất tổng hợp (dung tích 120 lít) 44 2.3.2.4 Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể 45 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ nguồn chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể 46 2.3.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 46 2.3.3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ nguồn chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể 47 2.3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 47 2.3.4 Phương pháp xác định số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit amin nấm Đầu khỉ 49 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide thể nấm Đầu khỉ 49 2.3.5.1 Phương pháp thu nhận polysaccharide mẫu thể nấm nấm Đầu khỉ 49 2.3.5.2 Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 50 2.3.5.3 Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp 50 nấm 50 2.3.5.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 50 2.3.5.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư người ni cấy invitro 2.3.5.7 Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u chiều thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo 2.3.5.8 Phương pháp nghiên cứu động vật thực nghiệm 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 51 52 53 54 ii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H erinaceus 55 50 3.1.1 Kết so sánh, đánh giá khảo nghiệm giống nấm Đầu khỉ H erinaceus diện hẹp 51 3.1.1.1 Một số đặc trưng hình thái giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn 51 3.1.1.2 Thời gian sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm 52 3.1.1.3 Đánh giá khả chống chịu loại sâu bệnh hại giống Đầu khỉ nghiên cứu 57 3.1.1.4 Kết phân tích số thành phần dinh dưỡng nấm Đầu khỉ He1 59 3.1.2 Kết phân lập lại giống nấm Đầu khỉ 61 3.1.2.1 Ảnh hưởng phương pháp phân lập đến mọc hệ sợi nấm Đầu khỉ 61 3.1.2.2 Xác định thời điểm phân lập 63 3.1.2.3 Kết nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ 65 a Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hệ sợi giống gốc 65 b Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng hệ sợi 66 c Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng sợi nấm 68 3.1.2.4 Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 70 3.2 Kết nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 73 3.2.1 Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể (dung tích 200ml) 73 3.2.1.1 Kết nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 73 3.2.1.2 Kết nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 74 3.2.1.3 Ảnh hưởng pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến 76 iii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 3.2.1.4 Kết xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp cấy chuyển sang môi trường dịch thể 76 3.2.1.5 Kết nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 77 3.2.1.6 Chế độ nuôi giống 77 a Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp máy lắc 80 b Nghiên cứu chế độ nuôi giống máy khuấy từ 81 3.2.1.7 Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 82 3.2.2 Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể (dung tích 2000ml – 5000ml) 85 3.2.2.1 Kết nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 85 3.2.2.2 Kết nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống trung gian cấp nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 86 3.2.2.3 Kết nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 87 3.2.2.4 Kết xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp cấy chuyển sang mơi trường dịch thể 88 3.2.2.5 Kết nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít 89 3.2.2.6 Kết nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít 90 3.2.2.7 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng giống trung gian cấp dạng dịch thể 92 3.2.3 Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 95 3.2.3.1 Kết nghiên cứu thành phần mơi trường nhân giống thể tích 120 lit 95 3.2.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 95 3.2.3.3 Kết nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp dạng dịch thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít 96 iv CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 3.2.3.4 Kết nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120 lít 97 3.2.3.5 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng nuôi trồng dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men) 98 3.3 Kết nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ ni trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 104 3.3.1 Ảnh hưởng độ ẩm chất phối trộn đến khả nhiễm bệnh môi trường nuôi cấy sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đầu khỉ 104 3.3.2 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng phối trộn phương pháp khử trùng đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ q trình ni trồng thu thể 107 3.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đầu khỉ 111 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi trồng 113 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành phát triển thể 114 3.3.6 Hiệu kinh tế mang lại áp dụng qui trình cơng nghệ ni trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 116 3.4 Kết tách chiết thử hoạt tính sinh học polysaccaride từ nấm Đầu khỉ H erinaceus 120 3.4.1 Nghiên cứu quy trình tách chiết 120 3.4.1.1 Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 120 3.4.1.2 Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH 120 3.4.2 Xác định hàm lượng polysaccharide thể nấm Đầu khỉ He1 thời điểm nuôi 122 3.4.3 Kết kiểm tra hàm lượng polysaccharide thể nấm Đầu khỉ khô thu hái sau thời gian bảo quản tháng 124 3.4.4 Kết thử hoạt tính polysaccharide thu nhận 125 3.4.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay) 125 3.4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 126 v CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ 3.4.4.3 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u thạch mềm phân đoạn polisaccarid 127 3.4.4.4 Kết thử nghiệm in vivo tính an tồn hiệu lực chế phẩm polysaccharide tổng HT1 động vật thực nghiệm 128 a Kết nghiên cứu an toàn chế phẩm HT1 128 a1 Tác dụng HT1 trọng lượng thể thỏ 129 a2 Tác dụng HT1 điện tim thỏ dùng chế phẩm HT1 tuần 129 a3 Tác dụng HT1 đến số số huyết học thỏ dùng HT1 tuần 131 a4 Tác dụng HT1 hoạt độ enzym SGOT, SGPT thỏ 133 a5 Tác dụng HT1 hàm lượng Creatinin thỏ 134 b Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ chế phẩm HT1 134 c Tác dụng HT1 trình tạo máu 135 Chƣơng KẾT LUẬN 138 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ TRONG PHẠM VI LUẬN ÁN 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 Phụ lục 149 vi CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CT CTĐC CTNT CSH DMEM DMSO FAO PGA PSF Công thức Công thức đối chứng Công thức nuôi trồng Chứng sinh học Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethylsulfoxide Tổ chức Nông nghiệp Thực phẩm giới Potato glucose agar Dịch kháng sinh: 100đơn vị/ ml Penicilin, 100 g /ml Streptomycin sulfate, 0,25 g /ml Amphotericin B Polysaccharide tách chiết từ Hericium erinaceus Sắc ký lỏng cao áp 10 11 HEP HPLC 12 KH&CN Khoa học Công nghệ 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 KLC IC50 LD50 MEME MTĐC NAA NCS QTCN TCVN TCPTN TSB YF Khuẩn lạc cầu Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Lethal dose 50, Liều độc cấp tính Minimum Essential Medium with Eagle’s salt Môi trường đối chứng Nonessential Amino Axit Nghiên cứu sinh Qui trình cơng nghệ Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn phòng thử nghiệm Trypcase Soya Broth Quả thể nấm non 25 YM Hệ sợi nấm 26 27 28 YE SKS XPĐ Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ Sinh khối sợi Xuất phát điểm vii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng thể nấm Đầu khỉ 19 Bảng 1.2: Thành phần hàm lượng axit amin thể nấm Đầu khỉ H erinaceus 20 Bảng 1.3: Hàm lượng số thành phần hóa sinh nấm Đầu khỉ 20 Bảng 1.4: Một số thành phần có hoạt tính sinh học mang lại lợi ích sức khỏe H erinaceus 21 Bảng 2.1: Thành phần môi trường phân lập nấm Đầu khỉ 37 Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 37 Bảng 2.3: Thành phần môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 38 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 38 Bảng 2.5: Thành phần môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ 38 Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi thể giống nấm Đầu khỉ H erinaceus khảo nghiệm môi trường PGA CTNT 55 Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm 57 Bảng 3.3: Thành phần mức độ sâu bệnh hại bốn giống nấm Đầu khỉ 57 Bảng 3.4: Kết phân tích thành phần dinh dưỡng vitamin cuả nấm Đầu khỉ He1 59 Bảng 3.5: Kết phân tích thành phần axit amin cuả nấm Đầu khỉ He1 60 Bảng 3.6: Ảnh hưởng phương pháp phân lập đến mọc hệ sợi nấm Đầu khỉ môi trường khiết 62 Bảng 3.7: Ảnh hưởng độ tuổi thể nấm đến chất lượng giống gốc 64 Bảng 3.8: Ảnh hưởng nguồn cacbon sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ 65 Bảng 3.9: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ 67 Bảng 3.10: Đặc điểm hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ môi trường dinh dưỡng khác 69 Bảng 3.11: Đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ môi trường khiết nuôi điều kiện nhiệt độ khác 70 Bảng 3.12: Ảnh hưởng chế độ khử trùng đến chất lượng mơi trường dinh dưỡng (dungtích 200 ml) 73 Bảng 3.13: Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng giống dịch thể trung gian cấp 74 viii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.14: Ảnh hưởng pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ môi trường CT8 76 Bảng 3.15: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp môi trường CT8 76 Bảng 3.16: Ảnh hưởng chế độ nuôi lắc khuấy đến sinh trưởng giống Đầu khỉ trung gian cấp môi trường CT8 79 Bảng 3.17: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến hình thái sinh khối hệ sợi nấm Đầu khỉ môi trường CT8 80 Bảng 3.18: Ảnh hưởng tốc độ khuấy từ đến hình thái sinh khối hệ sợi Nấm Đầu khỉ môi trường CT8 81 Bảng 3.19: So sánh giống dịch thể trung gian cấp nuôi chế độ: nuôi lắc, nuôi khuấy từ 81 Bảng 3.20: Ảnh hưởng chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml) 85 Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp môi trường dinh dưỡng khác 86 Bảng 3.22: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến kích thước đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ CT12 87 Bảng 3.23: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy đến sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể CT12 88 Bảng 3.24: Ảnh hưởng chế độ sục khí đến sinh trưởng giống dịch thể môi trường CT12 Bảng 3.25: Ảnh hưởng chất phá bọt trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp 89 91 Bảng 3.26 Sự sinh giống Đầu khỉ trung gian cấp môi trường CT12 thời điểm nuôi 92 Bảng 3.27: Ảnh hưởng chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng bình lên men 120lit 95 Bảng 3.28: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ nồi lên men 120 lít thời điểm ni 98 Bảng 3.29: Ảnh hưởng công thức phối trộn nguyên liệu phương pháp khử trùng đến tỷ lệ nhiễm 107 Bảng 3.30: Ảnh hưởng công thức phối trộn nguyên liệu nuôi trồng đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ suất nấm thương phẩm 110 Bảng 3.31: Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đầu khỉ CTNT3 112 Bảng 3.32 So sánh tổng thời gian nuôi trồng suất nấm Đầu khỉ sử dụng giống dịch thể giống chất hạt 113 Bảng 3.33: Ảnh hưởng nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ CTNT3 114 ix CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.34: Ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường đến hình thành phát triển thể nấm Đầu khỉ CTNT3 117 Bảng 3.35: Hoạch toán đầu vào cho nguyên liệu xử lý để nuôi trồng nấm Đầu khỉ 119 Bảng 3.36: Bảng tổng hợp suất trung bình ni trồng nấm Đầu khỉ qua lần sản xuất lặp lại 119 Bảng 3.37: Bảng tổng hợp hiệu kinh tế thu nuôi trồng nấm đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 120 Bảng 3.38 Khả chiết loại dung dịch kiềm khác 120 Bảng 3.39 Độ chiết (tương ứng với độ nhớt) thay đổi theo nồng độ NaOH 121 Bảng 3.40: Hàm lượng polysaccharide mẫu nấm thu hái thời điểm khác 123 Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide hai mẫu Đầu khỉ thu hái qua bảo quản 124 Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu 125 Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm cuả hai phân đoạn polysaccharide thu 125 Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào dòng ung thư người hai phân đoạn polysaccharide thu 126 Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm phân đoạn polisaccaride 127 Bảng 3.46 : Sự thay đổi trọng lượng thể thỏ dùng HT1 tuần (n = 8) 129 Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) đạo trình D II dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 129 Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) đạo trình DII dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 130 Bảng 3.49: Sự xuất sóng điện tim bệnh lý thỏ đạo trình D II dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 130 Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 1012/l) thỏ dựng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 131 Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l)ở thỏ dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 131 Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 109/l) thỏ dựng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 132 Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 109/l) thỏ dựng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 132 Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT thỏ dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 133 x CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT thỏ dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 133 Bảng 3.56: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin thỏ dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) 134 Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ HT1 dùng 30 ngày liều 0,5g/kg/24 134 Bảng 3.58: Số lượng tế bào nhóm chuột nhắt trắng tác dụng chiếu xạ chiếu xạ + HT1 135 xi CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DANH MỤC HÌNH TRANG Hình 1.1: Sản lượng ni trồng nấm giới Hình 1.2: Hiệu kinh tế canh tác số sản phẩm nông nghiệp đơn vị diện tích (1 mẫu) năm Hình 1.3: Sản lượng số loại nấm chủ lực nuôi trồng Việt Nam năm 2011 Hình 1.4: Một số hình ảnh mơ tả cơng đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống nấm dạng dịch thể số cơng ty Hàn Quốc Hình 1.5: Liên kết β -1, β -1, chuỗi polysaccharide 12 Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus tự nhiên 17 Hình 1.7: Hình thái thể nấm Đầu khỉ ni trồng nhân tạo 18 Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại nấm Đầu khỉ giai đoạn ươm sợi thể 58 Hình 3.2: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) 61 Hình 3.3: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) dày đặc, đảm hình chuỳ mang bào tử với mụn gai bề mặt 61 Hình 3.4: Hệ sợi nấm Đầu khỉ phân lập từ bào tử mơ nấm 62 Hình 3.5: Các giai đoạn phát triển thể nấm Đầu khỉ tính từ xuất mầm thể bịch nguyên liệu nuôi trồng 63 Hình 3.6: Sự sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ môi trường khiết sử dụng thể phân lập giai đoạn phát triển khác 64 Hình 3.7: Hệ sợi phát triển MTĐC có bổ sung thêm nguồn bon khác 66 Hình 3.8: Hệ sợi phát triển MTĐC có bổ sung nguồn nito khác 68 Hình 3.9: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng mơi trường dinh dưỡng khác 69 Hình 3.10: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ công thức môi trường dinh dưỡng khác 70 Hình 3.11: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm điều kiện nhiệt độ khác 71 Hình 3.12: Qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ 72 Hình 3.13: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ môi trường dinh dưỡng khác 75 Hình 3.14: Sinh khối sợi nấm cơng thức mơi trường khác 75 Hình 3.15: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng môi trường CT8 chế độ ni lắc tạo thành dạng khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai xung quanh 76 Hình 3.16: Ảnh hưởng tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm mơi trường CT8 77 Hình 3.17: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ môi trường CT8 78 xii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ mơi trường CT8 chế độ ni 79 Hình 3.19: Sự phát triển giống trung gian cấp nuôi máy lắc lắc nuôi máy khuấy từ cấy chuyển sang bình lên men lít, thời gian ni ngày 82 Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng giống Đầu khỉ môi trường nuôi dưỡng CT8 82 Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể, dung tích 200ml Hình 3.22: Mơi trường khử trùng 115oC thời gian 30, 40, 50, 60, 70phút 84 85 Hình 3.23: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng môi trường khử trùng 115oC thời gian 70 phút môi trường khử trùng 115oC thời gian 70 phút 87 Hình 3.24: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng công thức môi trường dinh dưỡng khác 88 Hình 3.25: Ảnh hưởng tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm mơi trường CT12 89 Hình 3.26: Giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp môi trường CT12 sau ngày ni 90 Hình 3.27: Ảnh hưởng chế độ sục khí đến sinh trưởng giống dịch thể môi trường CT12 mức độ tạo bọt 91 Hình 3.28: Tác dụng chất phá bọt q trình lên men có sục khí, chế độ sục khí 0,4 - 5,5lit khí/1lit dịch ni/phút 93 Hình 3.29: Đường cong sinh trưởng giống môi trường nuôi dưỡng dạng dịch thể trung gian cấp 94 Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể, dung tích 5000ml 95 Hình 3.31: Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ mơi trường dịch thể 96 Hình 3.32: Ảnh hưởng tuổi giống trung gian cấp sử dụng để cấy chuyển sang thể tích 120lit đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ mơi trường CT16 97 Hình 3.33: Ảnh hưởng tỉ lệ giống trung gian cấp sử dụng để cấy chuyển sang bình dung tích 120 lít đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ môi trương CT16 99 Hình 3.34: Đường cong sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ mơi trường CT16 dung tích 120lit 100 Hình 3.35: Sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng bình lên men dung tích 120 lít, sau ngày nuôi cấy 102 xiii CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hình 3.36: Qui trình sản xuất giống nấm cấp 103 Hình 3.37: QTCN lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít 105 Hình 3.38: Ảnh hưởng độ ẩm chất phối trộn đến tỷ lệ nhiễm bịch nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ CTNT1 106 Hình 3.39: Ảnh hưởng độ ẩm chất phối trộn đến tốc độ phát triển hệ sợi nấm Đầu khỉ CTNT1 109 Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ công thức nuôi trồng khác sử dụng giống cấy dạng hạt giống cấy dạng dịch thể 99 Hình 3.41: Giống dạng hạt giống dạng dịch thể phát triển CTNT3 112 Hình 3.42: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ CTNT3 113 Hình 3.43: Quả thể nấm Đầu khỉ cơng thức CTNT nuôi trồng khoảng nhiệt độ khác 115 Hình 3.44: QTCN ni trơng nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể 116 Hình 3.45: So sánh QT sử dụng giống dạng hạt QT sử dụng giống dạng dịch thể nuôi trồng nấm Đầu khỉ 118 Hình 3.46: Qui trình chiết polysaccharide 121 Hình 3.47: Phổ MS Polysaccharide thu 122 Hình 3.48: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian thể nấm Đầu khỉ He1 124 Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u thạch mềm phân đoạn Polysaccharide 127 Hình 3.50: Thử nghiệm HT1 chuột 136 Hình 3.51: Kết thử hoạt tính in vivo chiết phẩm nấm Đầu khỉ 136 xiv CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ MỞ ĐẦU Nấm lớn có ý nghĩa quan trọng đời sống, chúng có vai trị kinh tế, khoa học tham gia vào chu trình chuyển hóa vật chất - lượng tự nhiên Nhiều loài nấm lớn sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, số sử dụng làm dược phẩm để chữa trị số bệnh nguy hiểm tim mạch, béo phì, giải độc bảo vệ tế bào gan, phịng điều trị lỗng xương… Trên giới có khoảng 2000 loại nấm ăn dùng làm thuốc, nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta trồng 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu suất cao Nhiều nhà khoa học cho nấm thực phẩm quan trọng thông dụng người tương lai [16] Việt Nam nước nông nghiệp, giàu tiềm lâm nghiệp nguồn phế liệu từ nơng, lâm nghiệp rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… dồi dào, nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh điều kiện tự nhiên nước ta phù hợp với việc nuôi trồng nấm Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu nước ta có bước tiến đáng kể chậm phát triển nhiều so với nước giới đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến thiết bị sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu Công nghệ nhân giống nuôi trồng nấm nước ta sử dụng giống nhân chất rắn nhân giống môi trường thạch, mùn cưa, thóc, que sắn; phương pháp truyền thống sử dụng cách phổ biến trình sản suất đơn giản lại có số nhược điểm sau: + Thời gian nhân giống cấp kéo dài; + Giống nấm nhân chất rắn có chất lượng khơng ổn định, tuổi giống khơng đồng tồn chai giống hay túi giống; + Phương pháp nhân giống chất rắn gặp nhiều khó khăn việc sản xuất giống với số lượng lớn hệ số nhân giống thấp; + Thao tác cấy chuyển giống khó tự động hóa, chịu nhiều tác động yếu tố ngoại cảnh làm tăng nguy nhiễm Việc kiểm soát nhiễm giống nấm nhân chất rắn gặp nhiều khó khăn; + Ngun liệu nhân giống đắt, chi phí nhân cơng, chi phí khấu hao điện năng, khấu hao nhà xưởng cao; Hiện nay, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể hướng nghiên cứu nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm giống nấm dạng dịch thể so với giống chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có nhiều ưu điểm vượt trội như: + Chu kỳ phát triển giống nấm môi trường dịch thể nhanh, qua rút ngắn thời gian nhân giống cấp nuôi trồng nấm; + Tuổi giống nấm dạng dịch thể đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định kiểm soát cách nghiêm ngặt với phương pháp thử đơn giản, có kết tức thì, độ xác cao; CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ + Sinh lực giống khỏe giống phát triển môi trường dịch thể cung cấp đầy đủ dinh dưỡng sử dụng giai đoạn sinh trưởng mạnh hệ sợi; + Công nghệ nhân giống dạng dịch thể đáp ứng nhu cầu giống từ qui mô nhỏ đến lớn, với hệ số nhân giống cao; + Giá thành sản xuất giống thấp trình sản xuất tiết kiệm nguyên nhiên vật liệu nhân giống, điện năng, nhân cơng Ngồi ra, phương pháp cịn thuận lợi việc sản xuất nấm qui mô công nghiệp Đối tượng nghiên cứu Luận án nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers., loại nấm q có giá trị dinh dưỡng dược liệu cao, sử dụng để hỗ trợ điều trị hiệu số bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh đường tiêu hóa, bệnh trí nhớ… Với lợi ích lớn giá trị dinh dưỡng, dược liệu kinh tế mà loại nấm mang lại, nhà khoa học nước giới quan tâm nghiên cứu nhằm hồn thiện qui trình nhân giống, ni trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo sản phẩm phục vụ cơng tác phịng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe cộng đồng Nhận định tầm quan trọng việc ứng dụng công nghệ vào sản xuất giống nấm nấm thương phẩm, góp phần thúc đẩy q trình cơng nghiệp hóa ngành sản xuất nấm nước, qua tạo nguồn nguyên liệu có giá trị dược học cao cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm dược phẩm, tạo sản phẩm chức phục vụ mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng, Nghiên cứu sinh lựa chọn thực Luận án: “Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) tách chiết số polysaccharide có hoạt tính sinh học” Luận án phần nội dung Đề tài thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC.06/11-15 Bộ Khoa học Cơng nghệ chủ trì: “Nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ nhân giống dạng dịch thể để sản xuất nấm ăn nấm dược liệu”; mã số KC06.01/11-15; thời gian thực từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014, Nghiên cứu sinh làm chủ nhiệm Đề tài nghị định thư cấp nhà nước: “Nghiên cứu trình chuyển hóa polymer tự nhiên enzyme từ nấm Việt Nam”, thời gian thực 2011-2013, PGS.TS Lê Mai Hương làm chủ nhiệm Mục tiêu Luận án - Đưa qui trình cơng nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H erinaceus; - Đưa qui trình cơng nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H erinaceus dạng dịch thể cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít; - Đưa qui trình cơng nghệ ni trồng nấm Đầu khỉ H erinaceus nguồn chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể; - Đưa qui trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ thể nấm Đầu khỉ H erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất này;