BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thu Trang NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT Chun ngành: Hố sinh học Mã số: 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Chu Nhật Huy Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Phạm Bích Ngọc Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) thuốc phổ biến nước ta, phân bố chủ yếu tỉnh miền Trung, Kon tum, Đồng Nai, Phú Quốc Vườn quốc gia Bái Tử Long Cây Bá bệnh dùng bồi bổ sức khoẻ, tăng lượng testosterone nam giới, có hoạt tính kháng viêm mạnh, chống ung thư tốt số tác dụng khác chữa sốt rét, chống loãng xương, trị tiểu đường Các cơng trình nghiên cứu Bá bệnh cho thấy có chứa nhiều hoạt chất alkaloid có giá trị kháng sốt rét, chống viêm, gây độc tế bào ung thư tăng cường sinh lực… Hiện nay, Bá bệnh bị khai thác mức tự nhiên nhu cầu sử dụng thảo dược ngày tăng Hơn nữa, Bá bệnh khó ni trồng nhân rộng, với thời gian thu hoạch rễ có chất lượng phải cần 5-6 năm dẫn tới nguồn nguyên liệu cung cấp cho sản xuất dược phẩm cịn gặp nhiều khó khăn Đến nay, ni cấy rễ xem giải pháp thay đầy tiềm để thu nhận ổn định lượng lớn sinh khối thời gian ngắn từ 3040 ngày làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất dược liệu Công nghệ nuôi cấy mô sẹo hay nuôi cấy huyền phù tế bào cần phải bổ sung chất điều hoà sinh trưởng (CĐHST) Tuy nhiên, tồn dư CĐHST ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người sử dụng Vấn đề khắc phục ni cấy sinh khối rễ tơ rễ tơ sinh trưởng phát triển liên tục không cần bổ sung CĐHST Hơn thế, rễ tơ có nhiều ưu điểm khác sản xuất lượng lớn hợp chất thứ cấp có di truyền ổn định nuôi cấy tế bào huyền phù mô sẹo Trong ni cấy in vitro, việc gây kích kháng hay bổ sung elicitor giúp tăng đáng kể khả tích lũy hợp chất thứ cấp q trình nhân nhanh sinh khối rễ Nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh in vitro, dù môi trường giàu dinh dưỡng giúp rễ phát triển nhanh, hàm lượng alkaloid phân tích thấp Hơn nữa, q trình tích lũy số chất không diễn thiếu số yếu tố kích kháng, dẫn đến hàm lượng alkaloid nội sinh thấp so với rễ thu tự nhiên Kể từ stress thay đổi ánh sáng, nhiệt độ hay tác động từ tác nhân gây hại trồng phát làm kích thích tích lũy hợp chất thứ cấp thơng qua đường truyền tín hiệu elicitor jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE)… kích hoạt biểu gen phịng vệ, đồng thời sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp Các elicitor ứng dụng rộng rãi vào nuôi cấy để gia tăng hoạt chất saponin ni cấy nhiều lồi dược liệu quý Việc nghiên cứu bổ sung elicitor việc tăng cường khả tích lũy hợp chất thứ cấp nuôi cấy in vitro chưa có Kỹ thuật ni cấy mơ đời mở cách mạng nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy mơi trường thạch khó đáp ứng nhu cầu giống trồng cung cấp thị trường, giá thành lại cao; việc phải cấy chuyền, tách mẫu bên tủ cấy thực tay, tốn nhiều lao động lại dể bị nhiễm Chính cần phải có hệ thống ni cấy tự động hóa giúp giảm thiểu nhân công, thời gian số lượng nhiều Trong nuôi cấy lỏng người ta chia ba loại nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc nuôi cấy bioreactor, tất dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào, phát sinh quan Hiện có xu hướng dùng bioreactor để nhân sinh khối rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp Xuất phát từ sở khoa học luận trên, tơi tiến hành thực đề tài nhằm tìm kiếm alkaloid có hoạt tính sinh học đồng thời nghiên cứu hoạt tính từ alkaloid từ nghiên cứu ni cấy tăng tích luỹ hàm lượng alkaloid cách bổ sung elicitor Sau đó, rễ tơ nghiên cứu nhân sinh khối lớn phục vụ định hướng làm dược liệu cách tối ưu hố hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) ni cấy hệ thống bioreactor 20 lít” Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát hoạt tính sinh học alkaloid phân lập từ rễ tơ Bá bệnh để tìm hoạt tính Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu để rễ tơ Bá bệnh sinh trưởng phát triển Xác định nồng độ ba elicitor (Salicylic acid, Jasmonic acid Yeat extract) lên q trình sản xuất tích luỹ alkaloid phân lập từ rễ tơ Bá bệnh in vitro Xây dựng hệ thống bioreactor 20 lít để nhân sinh khối rễ tơ Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thành phần hoá học hoạt tính sinh học cao chiết alkaloid sinh khối rễ tơ Bá bệnh Nội dung 2: Nghiên cứu số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ tơ tích luỹ alkaloid (1) 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1propenoic acid) (7-MCPA), (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9- hydroxycanthin-6-one rễ tơ Bá bệnh Nội dung 3: Xây dựng kỹ thuật nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống bioreactor 20 lít Đánh giá hàm lượng alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one có sinh khối thu ni cấy hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Bá bệnh Bá bệnh, gọi mật nhân, bách bệnh, mật nhơn, bá bịnh có tên khoa học Eurycoma longifolia Jack, thuộc họ Simaroubaceae Về đặc điểm hình thái thực vật, Bá bệnh loại gỗ nhỏ, thân nhỏ, cao 2-8 m phân cành, lúc nhỏ có nhánh, vỏ rễ đắng Lá dài, gồm 10 cặp chét, mọc đối, hình bầu dục, cuống ngắn, gốc thuôn, đầu nhọn, mặt bóng, mặt có lơng màu xám Tồn (trừ chín) có vị đắng 1.2 Ứng dụng Bá bệnh Y học cổ truyền Bá bệnh dùng nhiều y học cổ truyền để chữa bệnh đau lưng, khó tiêu, thuốc bổ sau sinh đẻ, sử dụng để điều trị sốt, vàng da, suy mòn cổ chướng Bá bệnh thuốc dân gian phổ biến cho tác dụng kích thích tình dục điều trị sốt rét Nước nấu sử dụng trị ngứa da, sử dụng chữa kiết lỵ, vỏ sử dụng loại thuốc tẩy giun Rễ sử dụng để chữa rối loạn chức tình dục, lão hóa… 1.3 Ni cấy sinh khối rễ tơ 1.3.1 Giới thiệu nuôi cấy sinh khối rễ tơ Rễ tơ tên gọi dùng để rễ nhỏ có lơng sản sinh mạnh mẽ vị trí bị nhiễm vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Kỹ thuật nuôi cấy mô đời mở cách mạng nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy môi trường thạch khó đáp ứng nhu cầu giống trồng cung cấp thị trường, giá thành lại cao Năm 1981, Takayama Misawa đề xuất hệ thống ni cấy lỏng có hệ thống sục khí chủ động từ bên vào với tên gọi Bioreactor Hệ thống bioreactor thường dùng nhiều, chủ yếu để nuôi cấy huyền phù tế bào sản xuất hoạt chất thứ cấp nhiều đối tượng nghiên cứu khác có xu hướng dùng bioreactor để nuôi cấy rễ tơ nhằm thu nhận hoạt chất thứ cấp 1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả tổng hợp HCTC nuôi cấy rễ tơ Sự lựa chọn dịng, hình thái rễ tơ sau chuyển gen, tương tác thực vật vi sinh vật, giai đoạn phát triển rễ tơ q trình ni cấy, yếu tố khác… 1.3.3.Ảnh hưởng elicitor đến tích luỹ HCTC q trình ni cấy rễ tơ Elicitor hợp chất kích thích dạng tự vệ thực vật Định nghĩa rộng elicitor bao gồm chất yếu tố gây bệnh (ngoại sinh) giải phóng thực vật phản ứng với yếu tố gây bệnh (nội sinh) Các elicitor gây loạt phản ứng phòng vệ dẫn đến gen biểu kích thích tích luỹ HCTC điều kiện không gây ảnh hưởng thực vật hay nuôi cấy tế bào 1.3.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước ni cấy sinh khối rễ tơ thu nhận HCTC Ở giới có số tác giả nghiên cứu rễ tơ số loài khác nhau, nhiên chưa có nghiên cứu rễ tơ loài Bá bệnh Các nghiên cứu nước Bá bệnh dừng lại phân tích thành phần hóa học tác dụng dược lý, nghiên cứu rễ tơ số lồi cịn hạn chế Việc nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ tơ loài dược liệu thu nhận HCTC không dừng quy mơ phịng thí nghiệm mà cơng nghiệp hố ni cấy bioreactor CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chúng sử dụng sinh khối khô rễ tơ Bá bệnh (90 g) rễ tơ Bá bệnh ni cấy mơi trường thạch Phịng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp Rễ tự nhiên Bá bệnh thu thập vườn Quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn - Kỳ Thượng, Hoành Bồ, Quảng Ninh 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập xác định cấu trúc hoá học chất từ cao chiết alkaloid rễ tơ Bá bệnh Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học hợp chất xác định kết hợp phương pháp phổ đại phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY) Phân lập chất từ cao chiết alkaloid Alkaloid (651mg) SKC SiO2, Grad CH2Cl2 /MeOH (25:1) F1 F3 F2 SKC SiO2, Grad MeOH/H20 (3:1) F2.2-F2.4 F2.1 Rửa kết tinh n-hexane F4 F5-F11 F12 Rửa kết tinh CH2Cl2 Chất 15 mg 9-hydroxycanthin-6-one Chất 96 mg SKC SiO2, Grad CH2Cl2 /MeOH (20:1) Chất 29,6 mg Chất 7-methoxy-(9H-β-carbolin-1yl)-(E)-3-propenoic acid 9-methoxycanthin-6-one 2.2.2 Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học in vitro 2.1.2.1 Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) Phép thử thực theo phương pháp A Monks (1991) Phép thử xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo thành phần protein tế bào nhuộm Sulforhodamine B (SRB) 2.1.2.2 Thử khả ức chế sản xuất IL-6 TNF-α tế bào đại thực bào RAW264.7, chuột THP-1 kích thích LPS Dịng tế bào nuôi đĩa 48 giếng, chứa 5x105 tế bào/ml Lấy ml tế bào thêm vào µl mẫu thử cho nồng độ cuối chất thử (1, 3, 10, 30 µM) Ủ hỗn hợp 37o C, 5% CO2 30 phút trước kích thích với µg/mL LPS (Sigma, Tokyo, Japan) Dịch thu sau 24 Nồng độ cytokine IL-6 TNF-α tế bào đại thực bào chuột, RAW264.7, THP-1 xác định ELISA (Quantikine ELISA R&D) theo hướng dẫn nhà sản xuất Số liệu biểu diễn dạng giá trị trung bình lần lặp lại Giá trị IC50 xác định nhờ vào phần mềm máy tính ImageJ 1.50i 2.2.3 Thực nghiệm phương pháp định lượng alkaloid thông qua phương pháp HPLC-DAD Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh: kí hiệu ĐK-Bb Cột sắc ký Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 250 mm, µm) Detector DAD, bước sóng phát 272 nm Nhiệt độ cột 25oC Tốc độ dòng 0,5 ml/ph Nồng độ mẫu 10 mg/ml Thể tích tiêm mẫu 10 µl Pha động ACN-H2O, chương trình gradient dung mơi: Thời gian (phút) 10 35 45 60 ACN (% thể tích) 10 20 50 90 90 Định lượng chất (1), (2), (3) cách so sánh diện tích pic mẫu thử với giá trị diện tích pic đường chuẩn => Định lượng chất (1), (2), (3) cách so sánh diện tích pic mẫu thử với giá trị diện tích pic đường chuẩn 2.2.4 Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh bình tam giác 500 ml Một số yếu tố trạng thái môi trường, ánh sáng, chiều dài mẫu ban đầu, khối lượng rễ cấy chuyển, elicitor jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), yeast extract (YE) đánh giá ảnh hưởng đến sinh trưởng tích luỹ hợp chất (1), (2), (3) ni cấy rễ tơ 2.2.5 Xây dựng quy trình ni cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống Bioreactor 20 lít Dựa hệ thống bioreactor lên men vi sinh vật có sẵn thiết kế số mẫu bioreactor sử dụng cho thí nghiệm ni cấy sinh khối với dung tích – 20 lit Dựa vào tài liệu tham khảo, lựa chọn mơ hình bioreactor dạng sủi bọt dạng cầu để nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh Ống tiếp mơi trường Ống khí Ống dẫn khí Màng lọc khí ống nối Đầu sục khí Hình 2.5 Mơ phận hệ thống bioreactor 20 lít sủi bọt dạng cầu tự tạo CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định cấu trúc hoá học chất phân lập từ cao chiết alkaloid Đây lần thành phần hóa học cao chiết alkaloid rễ tơ Bá bệnh nghiên cứu Kết phân lập xác định cấu trúc hợp chất từ cao chiết alkaloid cho thấy có chứa hợp chất β-Carboline alkaloids (7-methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid), hợp chất Canthin-6-one alkaloids (9-methoxycanthin-6-one 9-hydroxycanthin-6one) Chất (1): 7-methoxy- Chất (2): 9- Chất (3): 9(9H-β-carbolin-1-il)methoxycanthin-6-one methoxycanthin-6(E)-1-propenoic acid one 3.2 Hoạt tính sinh học chất 7-MCPA , 9-methoxycanthin-6-one, 9hydroxycanthin-6-one 3.2.1 Khả gây độc tế bào ung thư chất thử (1), (2), (3) Các kết thử nghiệm cho thấy: hợp chất (2) thể hoạt tính gây độc tế bào tốt chất (3) dòng KB, LU-1, MCF-7, HepG2 (bảng 3.1) So sánh cấu trúc hợp chất (2) (3) cho thấy chất khác nhóm 10 methoxy hydroxy gắn vị trí cacbon số Có thể nói, nhóm chức methoxy đóng vai trị quan trọng hoạt tính ức chế dịng tế bào KB, MCF7, LU-1, HepG2 chất (2) Chất (1) có hoạt tính gây độc tế bào tốt dòng MCF-7 với IC50 đạt 6,3 (µg/ml) Bảng 3.1 Kết thử hoạt tính độc tế bào chất thử (1), (2), (3) STT Chất thử (1) (2) (3) Dòng tế bào % ức chế nồng độ 100 20 0,8 MCF-7 98,8 90,6 27,7 2,9 IC50 (µg/ml) KB 95,7 73,9 20,8 9,1 10,3 LU-1 MCF-7 HepG2 KB LU-1 MCF-7 HepG2 97,0 98,2 96,9 95,4 92,8 75,5 84,2 76,5 72,8 66,7 47,2 61,3 36,6 39,9 25,2 29,8 32,3 14,2 32,3 19,4 15,1 9,3 8,5 9,2 0,11 11,4 9,8 9,2 8,6 8,4 9,3 23,5 11,2 39,7 34,2 6,3 KB: Ung thư biểu mô; LU-1 ung thư phổi; MCF-7 ung thư vú; HepG2 ung thư gan 3.2.2 Thử khả ức chế sản xuất IL-6 TNF-α tế bào đại thực bào chuột người kích thích LPS chất (1), (2), (3) Các kết bảng 3.2 cho thấy b-carboline alkaloid 7-MCPA (1), 9-methoxycanthin-6-one (2) phân lập từ nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh ức chế sản xuất IL-6 TNF-α ba dòng đại thực bào RAW264.7, chuột người THP-1 kích thích LPS Chất 7-MCPA nhóm nghiên cứu Dang cs, năm 2016 làm sáng tỏ chế phân tử hoạt động chống viêm thông qua đường p38 MAPK phụ thuộc ROS hiệu ứng chống viêm kết hợp với hoạt hóa đường Nrf2/HO-1 Cần tiếp tục nghiên cứu hoạt chất 9methoxycanthin-6-one có tương tác với đường NF-κB đại thực bào kích thích LPS hay không Chất (3) thể ức chế IL-6 11 TNF-α hai dòng đại thực bào RAW264.7 chuột, ức chế dòng THP-1 Bảng 3.2 Kết xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 TNF-α tế bào Nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 TNF-α tế bào IC50 (µM) STT IL-6 Chất thử TNF-α RAW 264.7 ĐTB chuột THP1 RAW 264.7 ĐTB chuột THP1 (1) 4,5 12,8 9,9 6,6 12,4 16,0 (2) 4,2 3,7 17,2 10,2 3,5 10,0 (3) 1,4 4,1 53,7 10,1 0,95 45 3.3 Xây dựng đường chuẩn định lượng alkaloid mẫu Bá bệnh phương pháp HPLC-DAD Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3) Chất chuẩn (1) 7-MCPA TT Chất chuẩn (2) 9methoxycanthin-6one Nồng Diện tích độ pic (µg/ml) (mAU.s) Chất chuẩn (3) 9hydroxycanthin6one Nồng Diện tích độ pic (µg/ml) (mAU.s) Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) 0 0 0 44,62 10 371,63 10 427,03 310,79 25 1004,75 25 1049,06 10 504,07 50 1848,17 75 3692,95 25 1434,35 125 4285,08 125 6549,70 50 2821,10 250 8528,45 250 12948,40 12 (A) (B) © Hình 3.10 Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan diện tích pic với nồng độ chất chuẩn A) Chất chuẩn (1); B) Chất chuẩn (2); C) Chất chuẩn (3) Kết khảo sát cho thấy có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ chất phân tích diện tích pic đáp ứng khoảng nồng độ khảo sát hợp chất nghiên cứu Định lượng: Các mẫu cao chiết rễ tơ rễ tự nhiên Bá bệnh bơm vào hệ thống sắc ký với điều kiện phân tích (ĐK-Bb) trình bày phần phương pháp Kết hàm lượng chất tính tốn cách so sánh diện tích pic mẫu thử với giá trị diện tích pic đường chuẩn 3.4 Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng trưởng tích luỹ chất (1), (2), (3) rễ tơ bình tam giác 500 ml 3.4.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh Bảng 3.4 Sự phát triển rễ tơ Bá bệnh môi trường lỏng thạch Trạng CT thái môi trường CT1 Thạch CT2 Lỏng KLK (g) 0,49 ± 0,04 0,63 ± 0,03 Số nhánh Chiều dài Hình thái rễ trung bình rễ trung sau 30 ngày rễ bình (cm) ni cấy 7,1 ± 1,2 7,7 ± 1,5 5,3 ± 1,3 7,5 ± 2,1 13 Rễ nhỏ, màu vàng Rễ to, màu vàng Môi trường thạch thạch Môi trường Môi trườngMôi lỏngtrường lỏng Hình 3.11 Sự phát triển rễ tơ môi trường lỏng thạch Rễ tơ phát triển môi trường lỏng cho tốc độ tăng trưởng cao môi trường thạch với tiêu khối lượng khô (0,63 ± 0,03 g) so với môi trường thạch (0,49 ± 0,04 g) có ý nghĩa thống kê cao với p < 0,001 Về mặt hình thái, rễ phát triển môi trường lỏng (5,3 ± 1,3 nhánh) phân nhánh môi trường thạch (7,1 ± 1,2 nhánh) rễ rễ nhánh to so với rễ nuôi môi trường thạch Rễ nuôi cấy mơi trường lỏng thích hợp cho nhân sinh khối rễ tơ, phục vụ cho mục đích ni cấy tạo sinh khối rễ để làm nguồn dược liệu 3.4.2 Ảnh hưởng ánh sáng đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh Ánh sáng ức chế trình phát triển rễ tơ Bá bệnh điều kiện ni tối thích hợp cho sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh Bảng 3.5 Sự phát triển rễ tơ điều kiện tối sáng Điều Chiều dài Số Hình thái rễ CT kiện ánh KLK (g) rễ TB nhánh sau 30 ngày sáng (cm) TB /rễ nuôi cấy CT1 Sáng 0,38 ± 0,07 4,3 ± 0,9 CT2 Tối 0,66 ± 0,04 8,1 ± 0,8 14 4,3 ± 1,5 6,0 ± 1,0 Rễ nhỏ, vàng đậm Rễ to, vàng tươi Điều kiện sáng Điều kiện tối Hình 3.12 Sự phát triển rễ tơ điều kiện tối sáng 3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh Bảng 3.6 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Chiều CT dài rễ (cm) KLK (g) Chiều Số Tỷ lệ sống dài rễ nhánh sót sau 10 TB (cm) TB/1 rễ ngày (%) CT1 0,2-0,4 0,35 ± 0,05 8,1 ± 0,5 6,1 ±1,4 32 CT2 0,6-0,8 0,57 ± 0,03 8,2 ± 0,6 6,5 ± 1,0 61 CT3 1,0-1,2 0,74 ± 0,05 8,2 ± 0,5 6,3 ± 1,3 97 0,2 – 0,4 cm 0,6 – 0,8 cm 1,0- 1,2 cm Hình 3.14 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ 15 Trong thí nghiệm mẫu rễ cắt với kích thước từ 1-1,2 cm cho tỷ sống cao (97 %) KLK thu cao đạt (0,74 ± 0,05 g), CT3 có ý nghĩa thống kê so với công thức với p < 0,001 Như vậy, rễ cắt với kích thước 1-1,2 cm thích hợp cho thu sinh khối 3.4.4 Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh Công thức có 0,3 g lượng rễ tơ ban đầu lựa chọn cơng thức thích hợp cho sinh trưởng phát triển rễ tơ nuôi cấy 100 ml môi trường phục vụ nuôi cấy hệ thống bioreactor Bảng 3.7 Sự phát triển rễ tơ 100 ml môi trường với khối lượng rễ ban đầu khác KLT rễ CT ban đầu KLT (g) (g) Tỷ lệ tăng Chiều dài rễ Số nhánh trưởng trung bình trung (lần) (cm) bình/1 rễ CT1 0,1 3,0 ± 0,13 30 8,0 ± 0,45 6,4 ± 0,8 CT2 0,2 5,8 ± 0,1 29 8,1 ± 0,63 6,0 ± 0,4 CT3 0,3 7,9 ± 0,18 26,3 8,1 ± 0,31 6,1 ± 0,56 CT4 0,4 7,8 ± 0,14 19,5 7,8 ±0,4 6,1 ± 0,4 Hình 3.15 Sự phát triển rễ tơ 100 ml môi trường với lượng ban đầu khác 3.4.5 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tăng trưởng tích luỹ hợp chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6one rễ tơ Bá bệnh 16 Bảng 3.8 Ảnh hưởng mơi trường khống đến sinh trưởng phát triển rễ tơ 20 30 CT 10 ngày 15 25 KLK-SH 0,03 ± 0,06 ± 0,07 ± (g) 0,006 0,02 0,02 KLK-WP 0,03 ± 0,06 ± 0,08 ± (g) 0,006 0,01 0,02 KLK-MS 0,03 ± 0,06 ± 0,05 ± (g) 0,006 0,01 0,01 0,25 ± 0,50 ± 0,78 ± 0,79 ± 0,02 0,03 0,04 0,03 0,26 ± 0,23 ± 0,58 ± 0,59 ± 0,01 0,01 0,02 0,05 0,22 ± 0,38 ± 0,68 ± 0,67 ± 0,01 0,02 0,03 0,04 KLK thu sau 30 ngày nuôi cấy môi trường SH (0,79 ± 0,03) đạt giá trị cao có ý nghĩa thống kê so với ni cấy môi trường WP (0,59 ± 0,05 g) MS (0,67 ± 0,04 g) với P < 0,05 Hình thái rễ ba môi trường thuôn dài, phân nhánh nhiều màu vàng trắng Tuy nhiên, môi trường SH rễ kéo dài to mơi trường MS WP Như môi trường SH mơi trường thích hợp cho sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh (bảng 3.8) Bảng 3.9 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tích luỹ chất 7-MCPA CT 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 0,0057 ± 7-SH 0,0006 7WP - - 0,0057 ± 0,0013 ± 0,007 ± 0,0006 0,0011 0,0015 - - 0,01 ± - - - 0,02 ± 0,009 ± 0,0069 0,0021 0,0051 0,0007 ±0,0009 0,0057 ± 7-MS 0,0006 - - - - Sau đánh giá tăng trưởng tăng sinh khối rễ tơ giai đoạn tăng trưởng khác nhau, phân tích HPLC tiến hành để xác định hàm lượng ba chất (1), (2), (3) giai đoạn tăng trưởng rễ tơ Kết cho thấy có diện chất (2), (3) tất nghiệm thức với 17 thay đổi hàm lượng chất khác giai đoạn, chất (1) có khơng có nghiệm thức khác Bảng 3.10 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tích luỹ 9methoxycanthin-6-one CT 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 0,04 ± 0,011 ± 0,022 ± 0,023 ± 0,133 ± 0,106 ± 9Me-SH 0,014 0,012 0,015 0,015 0,032 0,037 9Me- 0,04 ± 0,057 ± 0,088 ± 0,089 ± 0,143 ± 0,429 ± WP 0,014 0,023 0,012 0,022 0,033 0,059 0,04 ± 0,055 ± 0,042 ± 0,106 ± 0,126 ± 0,145 ± 9Me-MS 0,014 0,017 0,017 0,054 0,055 0,012 0,102 ± 0,024 0,241 ± 0,068 0,057 ± 0,034 Bảng 3.11 Ảnh hưởng môi trường khống đến tích luỹ 9hdroxycanthin-6-one CT 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 9Hy- 0,075 ± 0,018 ± 0,027 ± 0,026 ± 0,05 ± 0,05 ± 0,066 ± 0,002 0,003 0,003 0,003 0,005 0,005 0,044 ± 0,031 ± 0,15 ± 0,005 0,005 0,018 0,025 ± 0,039 ± 0,005 0,004 SH 0,005 9Hy- 0,075 ± WP 0,005 9Hy- 0,075 ± MS 0,005 0,137 ± 0,147 ± 0,07 0,011 0,3 ± 0,036 0,087 ± 0,089 ± 0,091 ± 0,037 ± 0,006 0,08 0,007 0,04 Hình 3.16 Ảnh hưởng mơi trường khống đến sinh trưởng phát triển rễ tơ sau 30 ngày nuôi cấy 18 Rễ tơ nuôi cấy 30 ngày môi trường WP tạo hàm lượng chất (1) cao ngày thứ 20 (0,02 ± 0,0051 % KLK) (bảng 3.9), chất (2) cao 25 ngày (0,429 ± 0,059 % KLK) (bảng 3.10), chất (3) cao 30 ngày (0,3 ± 0,036 % KLK) (bảng 3.11) 3.4.6 Ảnh hưởng jasmonic acid (JA) lên sinh trưởng tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6one rễ tơ Bá bệnh Bảng 3.12 Ảnh hưởng JA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid có rễ tơ Bá bệnh % Khối lượng khô JA KLK (mg/l (g) Chất (1) Chất (2) Chất (3) ) 0,67 ± 0,04 0,018 ± 0,007 0,337 ± 0,100 0,26 ± 0,040 0,61 ± 0,06 - 0,388 ± 0,051 0,111 ± 0,064 0,6 ± 0,07 - 0,513 ± 0,114 0,147 ± 0,021 0,54 ± 0, 05 - 0,874 ± 0,125 0,465 ± 0,043 16 0,41 ± 0,06 - 0,119 ± 0,056 0,052 ± 0,009 16 (mg/l) Hình 3.18 Ảnh hưởng JA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh Elicitor dẫn truyền tín hiệu (JA) có nguồn gốc từ hormone nội sinh có hiệu lớn lên khả tích lũy alkaloid, ức chế tăng trưởng rễ Chính vậy, môi trường nuôi cấy bổ sung 0,8 mg/l JA thích hợp cho tích luỹ chất (2) 9-methoxycanthin-6-one (0,874 ± 0,125 % DW) (3) 9- 19 hydroxycanthin-6-one (0,465 ± 0,043 % DW), khơng thích hợp cho tích luỹ chất (1) Trong nghiên cứu cần tìm hiểu thêm elicitor khác có khả tích luỹ chất (1) nhiều q trình ni cấy 3.4.7 Ảnh hưởng salicylic acid (SA) lên sinh trưởng tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6one rễ tơ Bá bệnh Bảng 3.13 Ảnh hưởng SA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ % Khối lượng khô SA KLK Chất (mg (g) (7-MCPA) /l) 30 ngày 20 ngày 0,67 ± 0,04 0,018 ± 0,007 0,66 ± 0,1 - 0,912 ± 0,034 0,464 ± 0,034 10 0,65 ± 0,09 - 0,245 ± 0,076 0,208 ± 0,087 20 0,54 ± 0,08 - 0,083 ± 0,006 0,084 ± 0,009 40 0,43 ± 0,10 - 0,083 ± 0,005 0,182 ± 0,058 Chất (9- Chất (9- methoxycanthin hydroxycanthin-6-one) 25 ngày 0,337 ± 0,100 6-one ) 30 ngày 0,26 ± 0,04 Elicitor dẫn truyền tín hiệu (SA) có nguồn gốc từ hormone nội sinh có hiệu lớn lên khả tích lũy alkaloid, ức chế tăng trưởng rễ, vậy, mơi trường ni cấy bổ sung mg/l SA thích hợp cho tích luỹ chất (2) 9-methoxycanthin-6-one (3) 9-hydroxycanthin-6-one ức chế tích luỹ chất (1) 7-MCPA 10 20 40 (mg/l) Hình 3.21 Ảnh hưởng SA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 20 3.4.8 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men (YE) lên tăng trưởng tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin6-one rễ tơ Bá bệnh Bảng 3.14 Ảnh hưởng YE lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ % Khối lượng khô YE KLK Chất Chất (9- Chất (9- (mg (g) (7-MCPA) methoxycanthin hydroxycanthin- 20 ngày -6-one) 25 ngày 6-one ) 30 ngày /l) 0,67 ± 0,04 0,018 ± 0,007 0,337 ± 0,100 0,26 ± 0,04 10 0,77 ± 0,13 0,0112 ± 0,0065 0,381± 0,153 0,274 ± 0,095 20 0,82 ± 0,10 0,0239 ± 0,0056 0,694 ± 0,202 0,428 ± 0,019 40 0,72 ± 0, 0,0254 ± 0,0047 1,139 ± 0,341 0,657 ± 0,098 80 0,69 ± 0,12 0,0251 ± 0,0043 0,689 ± 0,220 0,578 ± 0,045 Elicitor YE có nguồn gốc từ nấm men có hiệu lớn lên khả tích lũy alkaloid tăng trưởng rễ, vậy, mơi trường ni cấy bổ sung 40 mg/l YE thích hợp cho tích alkaloid (1), (2), (3) Môi trường bổ sung 20 mg/l YE thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ Bá bệnh 10 20 40 (80 mg/l) Hình 3.22 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên sinh trưởng tích luỹ chất (1), (2), (3) rễ tơ Bá bện 3.5 Xây dựng quy trình nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống bioreactor 20 lít Tơi đưa quy trình cấy chuyền từ bình tam giác 500 ml sang hệ thống bioreactor 20 lít (hình 3.28) 21 Bình thuỷ tinh 20 lít Bình bioreactor 20 lít Bước 1: Chuẩn bị bình ni cấy khử trùng Bình 20 lít chứa 10 lít mơi trường Bước 2: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Bước 3: Chuyển môi trường từ bình 20 lít sang bình bioreactor 20 lít Bình tam giác 500 ml chứa 200 ml môi trường 30 g mẫu rễ tơ Bước 4: Chuẩn bị mẫu ni cấy Đóng nắp, quấn màng bọc Tiếp mẫu Hình bioreactor 20 lít thực tế sau chuyển mẫu Bước 5: Chuyển mẫu ni cấy vào bình 20 lít Hình 3.28.Quy trình ni cấy rễ tơ hệ thống Bioreactor 20 lít Kết sau 30 ngày ni cấy rễ tơ hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít Bảng 3.16 Kết sau 30 ngày nuôi cấy rễ tơ hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít Khối lượng Khối Bioreactor 20 lít lượng Khối tươi ban đầu tươi sau 30 khô lượng Tỷ lệ tăng sau (g) ngày (g) ngày (g) 30 850 ± 25 82 ± 2,2 30 trưởng (lần) 28,3 ± 0,8 Trong thí nghiệm này, rễ tơ Bá bệnh 30 g KLT cấy vào hệ thống bioreactor tự tạo 20 lít chứa 10 lít mơi trường Quan sát rễ sau ngày nuôi cấy rễ tơ bắt đầu mọc đầu sinh trưởng phát triển nhanh từ 5-20 ngày, rễ kéo dài từ cm - cm từ ngày thứ đến ngày thứ 20 Giai đoạn sau từ 20-30 ngày tốc độ sinh trưởng rễ chậm dần đến ngày thứ 30 rễ bắt đầu hố nâu (hình 3.28) Lúc rễ thu hoạch, rửa vòi nước, phơi cho nước cân 850 g KLT, sau 22 sấy khô 370C, cân rễ 82 g KLK (đạt 9,65 % so với KLT) Như vậy, tỷ lệ tăng trưởng rễ sau 30 ngày nuôi cấy đạt 28,3 lần Sinh khối tươi sau 30 ngày 850 (g) SinhSinh khốikhối tươitươi 650650 (g) (g) Sinh khối khô sau 30 ngày 52 (g) SinhSinh khốikhối khơkhơ 52 (g) Hình: kết thu sau 30 ngàySinh khối nuôi cấy Sinhhệ thống bioreactor 10ngày ngày Một số20 30 10 ngày 10 2020 ngày 30 ngày tươi 52 (g)bioreactor 20 l Hình: Một số kết thu được30 sau 30 ngày nuôi Sinh khối tươicấy 650650 (g) (g)trên hệSinhthống khốikhối khôkhô 52 (g) 10ngày ngày 10 ngày 2020ngày ngày 3030 ngày KLT (g) Sinh khối tươi sau 30850 ngày 850 (g) KLK 82ngày(g) Sinh khối khô sau 30 82 (g) số kết thu sau 30 ngày ni cấy hệ thống bioreactor 20 lít Hình:Hình: MộtMột số kết thu sau 30 ngày ni cấy hệ thống bioreactor 20 lít Hình 3.29 Ni cấy rễ tơ hệ thống bioreactor 20 lít KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Lần cao chiết alkaloid rễ tơ Bá bệnh phân lập xác định cấu trúc hoá học chất có chất bao gồm: Chất (1) (chất mới): 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid Chất (2): 9-methoxycanthin-6-one Chất (3): 9-hydroxycanthin-6-one Kết khảo sát hoạt tính chất phân lập (1), (2), (3) cho thấy: o Chất (1) ức chế việc sản xuất IL-6 TNF-a dòng tế bào chuột RAW264.7, đại thực bào chuột dòng tế bào người THP-1 có giá trị IC50 từ 4,5 –16,0 µg/ml Chất thể hoạt tính gây độc dịng tế bào ung thư MCF-7 mức tốt với IC50 6,34 µg/ml o Chất (2) ức chế việc sản xuất IL-6 TNF-a dòng tế bào chuột RAW264.7, đại thực bào chuột dòng tế bào người THP-1 có giá trị IC50 từ 3,5 –11,6 µg/ml Chất (2) thể hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU mức tốt với IC50 từ 8,4 – 10,3 µg/ml o Chất (3) ức chế việc sản xuất IL-6 TNF-a dòng tế bào chuột RAW264.7 đại thực bào chuột có giá trị IC50 từ 0,95 - 23 10,1 µg/ml Chất (3) thể hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư LU-1 đạt IC50 11,2 µg/ml Xác định điều kiện mơi trường ni cấy thích hợp cho rễ tơ tăng trưởng để thu sinh khối: kích thước rễ (1,0-1,2 cm); khối lượng rễ (0,3 g); môi trường nuôi cấy (100 ml SH + 30 g/l sucrose, pH = 5,8 ± 0,1; điều kiện ni (tối, lắc 80 vịng/phút); thời gian thu sinh khối sau 30 ngày Xác định mơi trường có bổ sung elicitor thích hợp cho tích luỹ chất (1), (2), (3) là: môi trường (WPM + 30 g/l sucrose + 40 mg/l) YE, pH = 5,8 ± 0,1); Hàm lượng chất (1), (2), (3) đạt cao 0,0254 ± 0,0047; 1,139 ± 0,341; 0,657 ± 0,098 Xây dựng hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu 20 lít sử dụng cho nhân sinh khối rễ tơ Tỷ lệ tăng trưởng hệ thống bioreactor 20 lít 28,3 lần Hàm lượng chất (1) xác định có rễ tơ, khơng có rễ tự nhiên thu thập vườn Quốc gia Bái Tử Long phương pháp HPLC-DAD Chất (2) (3) có rễ tơ gấp lần 8,5 lần tương ứng so với hàm lượng có rễ tự nhiên Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu sâu hoạt tính gây độc tế bào ức chế cytokine gây viêm chất 9-methoxycanthin-6-one 9hydroxycanthin-6-one, đặc biệt 7-MCPA để ngăn ngừa điều trị bệnh viêm Ứng dụng nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh vào sản xuất quy mô công nghiệp để tạo nguồn nguyên liệu cho ngành cơng nghiệp dược phẩm thực phẩm NHỮNG ĐĨNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đã phân lập xác định cấu trúc hoá học chất (7MCPA ) từ cao chiết alkaloid rễ tơ Bá bệnh Đánh giá hoạt tính alkaloid (1) 7-MCPA, (2) 9methoxycanthin-one hoạt tính kháng viêm dịng tế bào chuột 24 RAW264.7, đại thực bào chuột dịng tế bào người THP-1 có giá trị IC50 từ 0,95–16,0 µM; hoạt tính gây độc chất (1) dòng tế bào MCF7; Chất (2) dòng tế bào ung thư KB, MCF-7, Hep-G2, LU-1 chất (3) dịng LU-1 Lần tìm điều kiện ni cấy thích hợp cho rễ tơ Bá bệnh tăng trưởng để thu sinh khối tăng tích luỹ ba hoạt chất 7-MCPA , 9-methoxycanthin-6-one 9-hydroxycanthin-6-one Xây dựng hệ thống bioreactor sục khí dạng cầu 20 lít sử dụng cho nhân sinh khối rễ tơ Bá bệnh với điều kiện tối ưu DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ P.B Ngoc, T.T Binh, N.H Dang, T.T Trang, C.H hà, C.V Minh, L Jeong-Hyung, N.T Dat, A new anti-inflammatory β-carboline alkaloid from the hairy-root cultures of Eurycoma longifolia, Natural Product Research, 2015, 13, 1-6, SCIE Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Nhật Huy,Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà, Khảo sát số hoạt tính sinh học cao chiết methanol từ rễ tơ rễ tự nhiên bá bệnh (Eurycoma Longifolia Jack), Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 2017, 33, 2, 67-73 T.T Trang, T.N Nam, B.P Ngoc, N.C Huy, D.N Trong, K Tadamitsu, V.C Minh and H.C Ha, Hairy Root Cultures of Eurycoma longifolia and Production of Antiinflammatory 9-Methoxycanthin-6one, Natural Product Communications, 2018, 13 (5), 537-542, SCIE Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Nhật Huy, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam, Huy, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam, Đánh giá số hoạt tính sinh học hợp chất 9-hydroxycanthin-6-one phân lập từ rễ tơ Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack), Tuyển tập báo cáo tồn văn Hội nghị Cơng nghệ Sinh học Tồn quốc năm 2019, 84-85 25