NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.). TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HĨA HỌC   TRƯƠNG THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) Chuyên ngành : Hóa học hữu Mã số: 62.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2014 Cơng trình hồn thành tại: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt nam Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phan Văn Kiệm GS TS Nguyễn Văn Tuyến Phản biện 1: GS.TSKH Trần Văn Sung Phản biện 2: GS TS Đinh Thị Ngọ Phản biện 3: PGS TS Lê Mai Hương Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt nam Thư viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt nam Thư viện Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt nam 1 I.GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Thế giới thực vật nguồn tài nguyên phong phú vô quý giá hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt phân lập đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh Việt Nam nước nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng phong phú Việc sử dụng nguồn tài ngun để phịng, chữa bệnh nâng cao sức khoẻ cho người có q trình lịch sử hàng nghìn năm ngày trở nên quan trọng Đến nay, có hàng trăm thuốc chứng minh giá trị chữa bệnh chúng Cây dấu dầu nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) thuốc thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) thường sử dụng trị số bệnh như: trị tổn thương ngã, gãy xương, thấp khớp, viêm thận, phù thũng, dùng chữa chấn thương, ngứa, eczema Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học hoạt tính sinh học dấu dầu nhẵn, làm sở khoa học cho nghiên cứu để tạo sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng góp phần giải thích tác dụng chữa bệnh vị thuốc này, lựa chọn đề tài: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học dấu dầu nhẵn Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.” Đối tượng nghiên cứu luận án Đối tượng nghiên cứu luận án gồm: mẫu mẫu vỏ thân dấu dầu nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) thuộc chi Tetradium, họ Cam quýt (Rutaceae) Những đóng góp luận án 3.1 Lần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học mẫu vỏ thân dấu dầu nhẵn thuộc chi Tetradium mọc Việt nam Từ vỏ thân dấu dầu nhẵn, phương pháp sắc ký kết hợp phân lập hai sáu hợp chất, có hợp chất lần phân lập từ tự nhiên, tetraglabrifolioside mười năm hợp chất lần phân lập từ chi Tetradium 3.2 Đã đánh giá hoạt tính kháng lao hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn Kết cho thấy amide N-isobutyl-2E,4Etetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E-decadienamide(TG19), N-isobutyl-2E,4E,8E-tetradecatrienamide (TG20) thể hoạt tính kháng lao, đó: hợp chất TG18 ức chế chủng lao thử nghiệm M.bovis với giá trị MIC 22 µg/mL 3.3 Lần phân lập epimedoside C (TG12) với khối lượng lớn từ dấu dầu nhẵn (21,54g) thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào: ung thư đại tràng (SW480), ung thư phổi (LU-1), ung thư tiền liệt tuyến (LNCaP) với giá trị IC50 là: 10,47; 7,73; 6,69 µg/mL thể hoạt tính chống oxi hóa tốt (58,74 mL) Bố cục luận án Luận án gồm: 155 trang với 37 bảng số liệu, 94 hình, 144 tài liệu tham khảo 17 phụ lục Bố cục luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (27 trang); Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (9 trang); Chương 3: Thực nghiệm kết (11 trang); Chương 4: Kết Thảo luận (87 trang); Kết luận (1 trang); Kiến nghị (1 trang); Các cơng trình cơng bố (1 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (52trang) II NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 3 CHƯƠNG TỔNG QUAN Phần tổng quan tập hợp nghiên cứu nước quốc tế vấn đề: - Đặc điểm thực vật, phân bố ứng dụng chi Tetradium; - Các nghiên cứu thành phần hóa học chi Tetradium; - Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập từ chi Tetradium; - Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng nghiên cứu thành phần hóa học; hoạt tính sinh học dấu dầu nhẵn CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật Mẫu vỏ thân mẫu dấu dầu nhẵn thu hái vào tháng năm 2011 Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc Mẫu tiêu lưu trữ Viện Hóa sinh biển Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.2 Phương pháp phân lập chất Các phương pháp thiết bị nghiên cứu chủ yếu gồm: Sắc ký lớp mỏng (TLC); Sắc ký lớp mỏng điều chế; Sắc ký cột (CC) 2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học Phương pháp xác định cấu trúc hố học kết hợp xác định thơng số vật lý với phương pháp phổ đại gồm: Điểm nóng chảy (MP); Độ quay cực [α]D; Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS); Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1DNMR): 1H-NMR, 13C-NMR hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC 2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào in vitro dòng tế bào: SW480 (ung thư tuyến đại tràng người), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến), KB (ung thư tế bào biểu mô), F1 (ung thư màng tử cung) RD (ung thư màng tim) 4 Hoạt tính kháng lao: M bovis M smegmatis Hoạt tính chống oxi hóa (theo phương pháp DPPH); Hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: chủng vi khuẩn gram (+); chủng gram (-); chủng nấm mốc chủng nấm men CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Phân lập hợp chất từ dấu dầu nhẵn Phần trình bầy cụ thể trình phân lập hợp chất từ mẫu mẫu vỏ thân dấu dầu nhẵn Lần lượt mẫu (3,5kg) mẫu vỏ thân (2,4 kg ) phơi khô, nghiền bột chiết methanol sau chiết phân bố với n-hexane ethylacetate Các dịch chiết n-hexane, ethylacetate lớp nước cất thu hồi dung môi phân lập cột chiết hệ dung mơi thích hợp thu 11 hợp chất từ mẫu 15 hợp chất thu từ mẫu vỏ Các quy trình phân lập mẫu mẫu vỏ thân dấu dầu nhẵn trình bầy hình hình 3.2 Hằng số vật lý số liệu phổ hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương trình bày cách xác định cấu trúc hợp chất phân lập kết thử hoạt tính sinh học chất 4.1 Phân lập hợp chất từ dấu dầu nhẵn 4.2 Xác định cấu trúc hợp chất Phần trình bày chi tiết kết phân tích phổ xác định cấu trúc 26 hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn, Trong số đó, có hợp chất lần phân lập từ tự nhiên 15 hợp chất lần phân lập từ chi Tetradium, Phân lập hợp chất từ mẫu dấu dầu nhẵn Hình Sơ đồ phân lập hợp chất từ mẫu dấu dầu nhẵn 6 Phân lập hợp chất từ mẫu vỏ thân dấu dầu nhẵn Hình Sơ đồ phân lập hợp chất từ mẫu vỏ dấu dầu nhẵn 7 Dưới trình bày phương pháp xác định cấu trúc hợp chất điển hình 4.2.1 Hợp chất TG1 (chất mới): Tetraglabrifolioside O O 6'' OH OH O O 6'' OH COOH COOH O 1'' 5'' O ' O OH ' 6' 5' 5'' 6' O O HO HO 3'' 1'' O HO HO HO HO 1' O 5' O O 2' OH OH 1' OH TG1 HO TG1a Hình Cấu trúc tương tác HMBC hợp chất TG1 cấu trúc hợp chất tham khảo TG1a Hợp chất TG1 phân lập dạng chất bột màu trắng Công thức phân tử xác định C16H28O10 Dựa phổ khối lượng phân giải cao HR ESI MS (Error! Reference source not found.) xuất pic ion giả phân tử m/z 379,1609 ([M–H]–) (tính tốn lý thuyết cho công C16H27O10: 379,1604) Trên phổ 1H-NMR TG1 xuất tín hiệu proton anome δH 4,34 (d, J = 8,0 Hz), nhóm methyl bậc δH 1,36 (s), nhóm methyl bậc δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) nhóm methyl bậc δH 0,96 (t, J = 7,5 Hz) Phổ 13C-NMR DEPT TG1 cho thấy xuất hai nhóm cacbonyl δC 172,63 (C-1′′) 178,50 (C-5′′), cacbon bậc bốn 70,88 (C-3′′), nhóm oxymethine δC 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′), 75,26 ′ (C-2), 77,92 (C-3′), 79,07 (C-2) 103,93 (C-1′); bốn nhóm methylen δC 30,25 (C-3), 46,99 (C-2′′), 47,26 (C-4′′) 64,73 (C-6′); ba nhóm methyl δC 9,98 (C-4), 21,48 (C-1) 27,81 (C-6′′) Các tín hiệu cacbon δC 103,93 (C-1′), 75,26 (C-2′), 77,92 (C-3′), 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′) 64,73 (C-6′) với số tương tác proton JH-1′-H-2′ = 8,0 Hz lớn, gợi ý có mặt đơn vị đường β-D-glucopyranoside Thủy phân hợp chất TG1 môi trường acid để thu phần đường; sau thực phản ứng với trimethylsilylimidazole Cơ quay sản phẩm phản ứng chiết phân bố n-hexane H2O thu phân lớp n-hexane Lớp n-hexane phân tích máy GC với điều kiện: cột SPB-1 (0,25 mm × 30 m); detector FID, nhiệt độ cột 210 °C, nhiệt độ buồng bơm 270 °C, nhiệt độ buồng bơm 300 °C, khí mang heli (tốc độ dòng mL/phút) thu pic tín hiệu thời gian lưu 14,11 phút Tiến hành tương tự cho mẫu chuẩn D-glucose L-glucose thu thời gian lưu persilylated D-glucose L-glucose 14,11 14,26 phút Bằng so sánh thời gian lưu xác định xác phần đường hợp chất TG1 D-glucose Bảng Dữ kiện phổ NMR TG1 hợp chất tham khảo TG1a δC# C 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 103,0 75,9 78,6 72,4 75,9 6′ 65,5 1′′ 173,6 2′′ 48,0 3′′ 71,7 4′′ 48,7 5′′ 6′′ 180,9 28,7 # TG1 δC DEPT δH (J = Hz) 21,48 CH3 1,21 (d, 6,5) 79,07 CH 3,74 (m) 1,50 (m) 30,25 CH2 1,62 (m) 9,98 CH3 0,96 (t, 7,5) 103,93 CH 4,34 (d, 8,0) 75,26 CH 3,18 (t, 8,5) 77,92 CH 3,36* 71,74 CH 3,33* 75,05 CH 3,47 (m) 4,21 (dd, 6,0, 11,5) 64,73 CH2 4,45 (dd, 1,5, 11,5) 172,63 C 2,64 (d, 15,0) 46,99 CH2 2,68 (d, 15,0) 70,88 C 2,48 (d, 15,0) 47,26 CH2 2,59 (d, 15,0) 178,50 C 27,81 CH3 1,36 (s) HMBC 2, 1′, 4, 1, 2, 2, 2′, 3′ 1′, 3′, 4′ 2′, 4′, 5′ 2′, 3′, 5′, 6′ 1′, 3′, 5′, 6′ 1′′, 4′, 5′ 1′′, 4′, 5′ 1′′, 3′′, 4′′, 6′′ 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 2′′, 3′′, 5′′, 6′′ 2′′, 3′′, 4′′ δC thu từ hợp 1-[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β-D- glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid [119], * tín hiệu chập Hình Phổ 1H-NMR TG1 Hình Phổ 13C-NMR TG1 Trên phổ HMBC thấy có tương tác δH 1,36 (s) với C-3′′ (δC 70,88)/C-2′′ (δC 46,99)/C-4′′ (47,26); proton nhóm methylen δH 2,64 (d, J = 15,0 Hz)/2,68 (d, J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C-1′′ (δC 172,63); proton nhóm methylen δH 2,48 (d, J = 15,0 Hz)/2,59 (d, J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C-4′′ (δC 178,50) khẳng định tồn 10 nhánh 3-hydroxy-3-methylglutaric acid [118] Các tín hiệu cịn lại phổ đặc trưng cho nhóm 2-butyl với tín hiệu hai nhóm methyl C-1 (δC 21,48)/δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) C-4 (δC 9,98)/δH 0,96 (t, J = 7,5Hz); nhóm methylen δC 30,25 (C-3)/δH 1,50 (m) 1,62 (m) nhóm oxymethine C-2 (δC 79,07)/δH 3,74 (m) khẳng định thêm tương tác phổ HMBC Tương tác HMBC proton anome H-1′ (δH 4,34) C-2 (δC 79,07); H-2 (δH 3,74) C-1′ (δC 103,93) cho phép khẳng định nhóm 2-butyl liên kết với C-1 đường qua cầu oxy Vị trí este hóa nhánh glutaric acid C-6′ khẳng định tương tác proton H-6′ (δH 4,21 4,45) cacbonyl C-1′′ (δC 172,63) Từ chứng phổ nêu trên, hợp chất TG1 xác định 2-butyl-O-β-D-glucopyranosyl(1→6)-3hydroxyl-3-methylglutaric acid Cấu hình tương đối TG1, xác định sở phù hợp giá trị độ dịch chuyển hóa học 1H- 13CNMR giá trị số tương tác proton TG1 với số liệu vị trí tương đồng công bố hợp chất 1[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β-D-glucopyranosyl]-3hydroxyl-3-methyl-glutaric acid (TG1a) [119] hợp chất có cấu trúc tương tự TG1 khác chỗ thay gốc 2-butanol gốc (2R)-4-(4hydroxyphenyl)-2-butanol Như vậy, TG1 xác định (2R*,3S*)2-butyl-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid, hợp chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên đặt tên tetraglabrifolioside 4.2.7 Hợp chất TG7: 12α-Hydroxyevodol Hợp chất TG7 thu dạng bột vô định hình, màu vàng Phổ 1H-NMR xuất tín hiệu proton nhóm oxymethine δH 3,83 (br s), 4,06 (s), 4,08 (br s) 5,46 (s); nhóm oxymethylen δH 4,58 (d, J = 12,5 Hz) 4,68 (d, J = 12,5 Hz); nhóm methyl bậc ba δH 0,86 (s), 0,91 (s), 1,35 (s) 1,47 (s); proton olefin δH 7,47 (s), 7,61 (s) 6,49 (s) gợi ý có mặt vòng furan β 11 O O 21 22 20 OH OH O 18 O O 17 O O 13 11 O 26 19 24 15 10 O O O O O O O O 25 24 OH OH Hình 32 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC TG7 Phổ 13 C-NMR phổ DEPT TG7 xuất tín hiệu 26 nguyên tử cacbon có 11 cacbon bậc bốn, cacbon methine, cacbon methylen cacbon methyl Những tín hiệu phổ NMR TG7 gợi ý hợp chất có khung dạng limonoid Vị trí proton liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng xác định phổ HSQC Cấu trúc TG7 khẳng định dựa kết phân tích phổ HMBC Các tương tác HMBC H-1 (δH 4,08) với C-3 (δC 169,83)/C-19 (69,31); tương tác proton Ha-2 (δH 2,92)/ Hb-2 (δH 2,78) với C-1 (δC 79,00)/ C-3 (δC 169,83)/C-10 (δC 46,87) cho phép dự đốn TG7 có vịng ester nội phân tử C-3/C-19 Các nguyên tử cacbon vòng epoxy-lacton xác định thông qua tương tác HMBC H-15 (δH 4,06) với C-14 (δC 64,90)/ C16 (δC 166,59) H-17 (δH 5,46) với C-13 (δC 42,14)/ C-14 (δC 64,90)/ C-18 (δC 12,91) Tương tác proton methyl H-18 (δH 0,86) với C-12 (δC 65,95)/ C-13 (δC 42,14)/C-14 (δC 64,90)/C-17 (δC 76,63) cho thấy có nhóm hydroxy vị trí C-12 Tương tác HMBC H-21 (δH 7,74) với C-20 (δC 119,74)/C-22 (δC 110,45)/ C-23 (δC 142,93); tương tác H-22 (δH 6,50) với C-20 (δC 119,74)/ C-21 (δC 141,71)/ C-23 (δC 142,93); tương tác proton H-23 (δH 7,62) với C-20 (δC 119,74)/C-21 (δC 141,71)/ C-22 (δC 110,45) khẳng định có mặt vịng furan Vịng furan xác định liên kết với vòng epoxy- 12 lacton vị trí C-17 thơng qua tương tác HMBC H-17 (δH 5,46) với C-20 (δC 119,74)/ C-21 (δC 141,71)/ C-22 (δC 110,45) C 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 Bảng 14 Dữ kiện phổ NMR TG7 hợp chất tham khảo DEPT HMBC δH (J = Hz) *δC δC 79,0 79,00 CH 4,08 (br s) 3, 9, 19 35,0 34,95 CH2 2,92 (dd, 2,0, 17,0) 1, 3, 10 2,78 (dd, 2,0, 17,0) 169,7 169,83 C 81,1 81,12 C 140,3 140,30 C 141,9 141,93 C 195,3 195,32 C 47,3 47,29 C 42,8 42,88 CH 2,79 (d, 12,0) 1, 7, 8, 10, 11, 12, 19, 26 46,9 46,87 C 31,9 31,82 CH2 1,90 (ddd, 4,5, 12,0, 14,0) 8, 9, 12, 13 1,59 (d, 14,0) 65,9 65,95 CH 3,83 (br s) 42,2 42,14 C 64,4 64,90 C 50,6 50,63 CH 4,06 (s) 14, 16 166,5 166,59 C 76,6 76,63 CH 5,46 (s) 12, 13, 14, 18, 20, 21, 22 12,9 12,91 CH3 0,86 (s) 12, 13, 14, 17 69,3 69,31 CH2 4,68 (d, 12,5) 1, 3, 9, 10 4,58 (d, 12,5) 119,7 119,74 C 141,6 141,71 CH 7,74 (s) 20, 22, 23 110,4 110,45 CH 6,50 (s) 20, 21, 23 142,9 142,93 CH 7,62 (s) 20, 21, 22 25,5 25,54 CH3 1,47 (s) 4, 5, 25 25,0 25,03 CH3 1,35 (s) 4, 5, 24 17,5 17,05 CH3 0,91 (s) 7, 8, 9, 14 Giá trị #δC 12- hydroxyevodol đo DMSO [3] Kết hợp so sánh liệu phổ 1H- C-NMR TG7 với 13 hợp chất 12α-hydroxyevodol tài liệu tham khảo [3] cho thấy có 13 phù hợp tất vị trí tương ứng Đặc biệt, cấu hình lập thể H12 xác định β thông qua việc so sánh độ chuyển dịch cacbon số tương tác J với hợp chất 12α-hydroxyevodol Từ phân tích trên, hợp chất TG7 xác định 12α-hydroxyevodol, hợp chất phân lập từ loài Tetradium rutacarpum thuộc chi Tetradium Hình 34 Phổ 1H-NMR giãn TG7 Hình 35 Phổ 13C-NMR TG7 14 4.2.12 Hợp chất TG12: Epimedoside C 4"' 5'' 3'' OH OH HO 1"' 6" 4' O HOHO O 1" 3" OH O 1' O HO HO HO O O OH 10 OH O OH OH OH O Hình 60 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC TG12 Hợp chất TG12 thu dạng tinh thể hình kim, mầu vàng Phổ 1H-NMR (Phụ lục 5) TG12 thấy có xuất tín hiệu hai cặp proton vòng thơm para δH 6,94 (d, J = 9,0 Hz) 8,05 (d, J = 9,0 Hz) proton thơm δH 6,59 (s) cho phép dự đoán hợp chất dạng flavone Đồng thời, phổ cịn quan sát thấy tín hiệu proton anome δH 4,99 (d, J = 7,5 Hz) đặc trưng cho có mặt phần đường glycoside xuất tín hiệu proton olefin δH 5,21 (t, J = 7,0 Hz), hai nhóm methyl bậc ba δH 1,62 (s) 1,76 (s) cho phép dự đốn có mặt đơn vị isopren Trên phổ 13 C-NMR DEPT xuất tín hiệu 26 nguyên tử cacbon, có 11 nguyên tử cacbon bậc 4, 11 nhóm methine, nhóm methylene nhóm methyl Trong tín hiệu đặc trưng cho phân tử đường glucose với tín hiệu cacbon oximethine anome δc 100,50 tín hiệu đặc trưng cho vịng thơm 1,4 δc 129,55 115,49 Sự xuất tín hiệu cacbon methine δc 97,43 tín hiệu cacbon bậc δc 135,77 cho phép khẳng định xuất nhóm vị trí C-8 có mặt nhóm hydroxy vị trí C-3 Vị trí liên kết phân tử đường nhánh isoprenyl khẳng định lại dựa kết phân tích phổ chiều HSQC HMBC Trên phổ HMBC, thấy xuất tương tác tín hiệu proton methilen δH 3,43/3,64 (H-1′′′) với C-7 (δc 160,07)/ C-8 (δc 108,08)/ C-9 (δc 152,70) cho phép khẳng định nhánh isoprenyl liên kết với C-8 15 Bảng 19 Dữ kiện phổ NMR TG12 hợp chất tham khảo C 10 1′ 2′,6′ 3′,5′ 4′ 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ δC 147,4 135,8 176,3 158,6 97,4 160,0 108,0 152,7 104,4 121,85 129,55 115,49 159,35 100,50 73,4 76,6 69,70 77,2 60,7 δC 147,50 135,77 176,37 158,55 97,43 160,07 108,08 152,70 104,46 121,85 129,55 115,49 159,35 100,50 73,39 76,64 69,70 77,18 60,69 1′′′ 21,40 21,44 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 122,4 131,0 25,5 18,0 122,42 131,06 25,45 17,88 * DEPT δH (J = Hz) C C C C CH 6,59 (s) C C C C C CH 8,05 (d, 9,0) CH 6,94 (d, 9,0) C CH 4,99 (d,7,5) CH 3,32 (m) CH 3,31 (m) CH 3,17 (m) CH 3,42 (m) CH2 3,46 (m) 3,71 (dd, 5,5, 11,5) CH2 3,43* 3,64 (dd, 7,0, 14,5) CH 5,21 (t, 7,0) C CH3 1,62 (s) CH3 1,76 (s) HMBC 7, 8, 10 2, 4′ 1′, 4′, 3’, 5’ 7, 8, 9, 2′′′, 3′′′ 1′′′, 4′′′, 5′′′ 2′′′, 3′′′, 5′′′ 2′′′, 3′′′, 4′′′ Giá trị #δC epimedoside C [127], *: tín hiệu bị trùng lấp Dựa vào tương tác tín hiệu proton anome đường δH,4,99 với C-7 (δc 160,07); tín hiệu proton singlet 6,59 với C-5 (δc 158,88)/ C-7 (δc 160,07) /C-8 (δc 108,08)/C-10 (δc 104,46) cho phép khẳng định vị trí liên kết phân tử đường với C-7 Số liệu phổ NMR TG12 giống với số liệu phổ TG11 ngoại trừ xuất liên kết đôi C-2/C3 Từ số liệu phổ, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo công bố hợp chất epimedoside C [127] thấy hoàn toàn phù hợp Từ đó, cho phép khẳng định hợp chất TG12 epimedoside C 16 Phụ lục Phổ 1H-NMR TG12 Phụ lục Phổ 13C-NMR TG12 Kết luận: Đã phân lập 26 hợp chất từ dấu dầu nhẵn, số có 1t hợp chất lần phân lập từ tự nhiên 15 hợp chất lần phân lập từ chi Tetradium Cấu trúc hóa học tên gọi trình bày bảng 34 hình 93 17 O OH O O O O H3CO COOH O O HO HO O N RO OH HO N N O O O O O O O O O O O HO OH OH TG6 TG5 O O O HO TG4 OH O O O TG9 TG8 TG7 OH OH HO HO O HO HO O O O HO HO O O OH OH OH OH O OH TG10 O N OCH3 R TG2: H TG3: CH O TG1 N H N O OCH3 O OH O TG11 R1 O OH OH TG12 OH HO HO O O OR2 OH TG17 O O TG18 R1 R2 H Glc H Glc-6''-Rha H Gla H OH TG13: TG14: TG15: TG16: H N HO HO HO H3CO O TG21 H N OH R OCH3 OH O TG19 R O H N TG22 OH OCH3 TG20 O OCH3 HO HOHO O O O OH TG23 O OH HOHO TG24 H HO HO HO O O OH TG25 TG26 hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn Bảng 34 Thống kê hợp chất phân lập từ phận dấu dầu nhẵn KH TG1 TG2 TG3 Hợp chất Lớp chất Tetraglabrifolioside 6-Acetonyl-Nmethyldihydrodecarine 6-Acetonyl glycosid ester alkaloid Lá Vỏ Khối Lượng (mg) 10 11 alkaloid VT Dạng mẫu Hình 93 Các Tính M * 18 TG4 TG5 TG6 TG7 TG8 TG9 TG10 TG11 TG12 TG13 TG14 TG15 TG16 TG17 TG18 TG19 TG20 TG21 TG22 TG23 TG24 TG25 TG26 dihydrochelerythrine Decarine Iwamide Rutaecarpine 12α-Hydroxyevodol Rutaevine Lupeol Friedelan-3-one Phellamurin Epimedoside C Astragalin Nicotiflorin Trifolin Quercetin α-Tocopherol N-Isobutyl-2E,4Etetradecadienamide N-isobutyl-2E,4Edecadienamide N-Isobutyl-2E,4E,8Etetradecatrienamide Syringin Saikolignannisode A Picraquassioside D Stigmatsterol Daucosterol 5-Hydroxymethyl furfural alkaloid alkaloid alkaloid tritrerpenoid tritrerpenoid tritrerpenoid tritrerpenoid flavonoid flavonoid flavonoid flavonoid flavonoid flavonoid DX methyl phenol amide VT VT VT VT L VT VT L L L L L L VT 25 11 10 13 21540 30 20 10 10 10 VT 11 * amide VT 13 * amide VT 10 * benzenoid benzenoid benzenoid sterol sterol fufural L L L VT VT L 21 20 10 * * * * * * * * * * * (Mới): Hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên, * lần đầu phân lập từ chi Tetradium; L: mẫu lá, VT: mẫu vỏ thân 4.3 Kết thử hoạt tính sinh học 4.3.1 Kết kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào in vitro Trong nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào in vitro hợp chất phân lập từ dấu dấu nhẵn tiến hành xác định sáu dòng tế bào ung thư: SW480 (ung thư tuyến đại tràng người), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến), KB (ung thư tế bào biểu mô), F1 (ung thư màng tử cung) RD (ung thư màng tim) Kết trình bày bảng 35 Bảng 35 Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro IC50 (µg/mL) Hợp chất SW480 LU-1 LNCaP KB F1 RD > 50 34,57 > 50 > 50 > 50 > 50 TG1 > 50 > 50 > 50 3,55 4,42 4,54 TG2 > 50 > 50 > 50 25,70 27,16 26,23 TG3 > 50 > 50 > 50 49,80 49,92 34,66 TG5 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 TG10 21,94 8,85 12,49 > 50 > 50 > 50 TG11 10,47 7,73 6,69 > 50 > 50 > 50 TG12 19 TG13 TG15 TG17 TG18 TG19 TG20 TG21 TG22 TG23 Ellipticine > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 35,89 > 50 0,63 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 22,12 > 50 0,77 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 30,32 > 50 0,83 > 50 > 50 > 50 42,74 20,60 16,63 > 50 > 50 > 50 0,77 > 50 > 50 > 50 49,24 29,10 18,27 > 50 > 50 > 50 0,93 > 50 > 50 > 50 49,34 21,66 17,96 > 50 > 50 > 50 0,81 IC50>50: hoạt tính; ellipticine: chất đối chứng dương tính Kết nghiên cứu cho thấy, alkaloid TG2 thể hoạt tính mạnh dịng tế bào KB, F1 RD với IC50 3,55; 4,42 4,52 µg/mL Hợp chất TG12, flavonoid phân lập khối lượng lớn từ dấu dầu nhẵn thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh ba dòng tế bào SW480, LU-1, LNCaP với IC50 10,47; 7,73 6,69 µg/mL Cũng ba dòng tế bào này, hợp chất TG11, TG22 thể hoạt tính gây độc tế bào với giá trị IC50 khong 8,85 ữ 35,89 àg/mL.Hp cht TG2, TG3, TG5, TG18-TG20 thể hoạt tính gây độc ba dịng tế bào KB, F1 RD mức độ trung bình với giá trị IC50 khoảng 16,63 ÷ 49,34 µg/mL 4.3.2 Kết kiểm tra hoạt tính kháng lao Các hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn thử nghiệm hoạt tính kháng lao chủng vi khuẩn lao thử nghiệm Mycobacterium bovis Mycobacterium smegmatis Kết thử nghiệm cho thấy, ba hợp chất amide lần phân lập từ chi Tetradium N-isobutyl-2E,4E-tetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E- decadienamide (TG19), N-isobutyl-2E,4E,8E-tetradecatrienamide (TG20) thể hoạt tính kháng lao, đó: TG18 ức chế chủng lao thử nghiệm M bovis với giá trị MIC 22 µg/mL; hai hợp chất TG19, TG20 ức chế chủng lao thử nghiệm M bovis với giá trị MIC 47 45 µg/mL Hợp chất 6-acetonyl-N-methyldihydrodecarine (TG2) ức chế hai chủng lao M bovis M smegmatis với giá trị MIC 50 100 µg/mL 4.3.3 Kết kiểm tra hoạt tính chống oxi hóa Từ kết thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa tiêu diệt gốc tự DPPH hợp chất sử dụng curcumin sử dụng chất đối chứng dương với giá trị EC50 51,08 μg/mL Kết cho thấy hợp chất thể hoạt tính chống oxi hóa mạnh chủ yếu thuộc lớp chất flavonoid Phellamurin TG11 quercetin TG16 thể hoạt tính chống oxi hóa DPPH với giá trị EC50 19,41 11,56 µg/mL Các hợp chất TG12, TG13, TG14 TG15 α-tocopherol TG17 thể hoạt tính chống oxi hóa DPPH mức độ trung bình với giỏ tr EC50 khong 45,37ữ63,87 àg/mL Trong nghiờn cu này, hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn thể hoạt tính chống oxi 20 hóa mạnh thuộc lớp chất flavonoid vitamin E (α-tocopherol) Nhóm chất chứng minh có tác dụng chống oxi hóa nhờ khả trung hịa gốc tự hoạt động phân tử đồng thời ngăn chặn phân tử hoạt động khỏi phá hủy tế bào Tác dụng chống oxi hóa từ thuốc truyền thống loài thực vật giàu flavonoid sử dụng lâu đời trà xanh [145] Vì vậy, việc phát nhiều flavonoid (6/26 hợp chất), đặc biệt TG12 chiếm hàm lượng dấu dầu nhẵn mở hướng sử dụng việc sử dụng tạo sản phẩm chức chống lão hóa 4.3.4 Kết kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Các hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn kiểm tra hoạt tính kháng tám chủng vi sinh vật kiểm định Kết cho thấy, hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn, hai flavonoid phellamurin (TG11) trifoline (TG15) thể hoạt tính kháng vi sinh vật với chủng Staphylococcus aureus mức trung bình với giá trị IC50 109,63 32,0 µg/mL S aureus tụ cầu vàng gây nên nhiều bệnh lý khác nhiễm trùng da, viêm da, nặng dẫn đến nhiễm trùng quan sâu (viêm xương, viêm tủy xương, nhiễm trùng huyết, viêm màng não mủ…) bệnh độc tố dẫn đến ngộ độc thực phẩm nặng Kết luận: Các kết thử nghiệm hoạt tính hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn trình bày hình 94 O O O O N O N HO H3CO OCH3 O N OCH3 TG2 O HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 25,70 (KB), 27,16 (F1), 26,23 (RD) GlcO O O OH HO O OH OGlc OH TG5 HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 49,80 (KB), 49,92 (F1), 34,66 (RD) OH OH O O HO TG3 HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 3,55 (KB), 4,42 (F1), 4,54 (RD) HO O OH H3CO OH O OGlc OH TG11 TG12 HT kháng vi sinh vật IC50 (S aureus):109,63µg/mL HT độc tế bào (µg/mL) IC50 :21,94 (SW480), 8,85 (LU-1), 12,49 (LNCaP) HT chống oxi hóa EC50 :19,41 µg/mL HT độc tế bào (µg/mL): IC50 10,47 (SW480), 7,73 (LU-1), 6,69 (LNCaP) HT chống oxi hóa EC50 : 58,74 µg/mL O TG13 HT chống oxi hóa EC50 : 59,45 µg/mL 21 OH OH O HO O HO O HO OGlc-6''-O-Rha OH OH OH OH OGla O OH OH O O TG14 TG15 TG16 HT chống oxi hóa EC50 :63,87 µg/mL HT kháng vi sinh vật IC50 (S aureus): 32,00 µg/mL HT chống oxi hóa EC50 :45,37 µg/mL HT chống oxi hóa EC50 :11,56 µg/mL H N H N O H N O TG18 O TG19 HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 42,74 (KB), 49,24 (F1), 49,34 (RD) HT kháng lao – MIC (M bovis): 22 µg/mL HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 20,60 (KB), 29,10 (F1), 21,66 (RD) HT kháng lao –MIC (M bovis): 47 µg/mL TG20 HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 16,63 (KB), 18,27 (F1), 17,96 (RD) HT kháng lao -MIC (M bovis): 45 µg/mL OH TG22 HT độc tế bào (µg/mL) IC50: 35,89 (SW480), 22,12 (LU-1), 30,32 (LNCaP) OH H3CO HO HO HO O O OH OH OCH3 Hình 94 Kết thử hoạt tính hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn (HT: hoạt tính) Từ kết thực nghiệm hoạt tính nhận thấy: hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn thể hoạt tính: gây độc tế bào, hoạt tính kháng lao, hoạt tính chống oxi hóa hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mức độ khác Trong đáng ý hợp chất 6-acetonyl-N-methyldihydrodecarine (TG2) có hoạt tính mạnh dịng tế bào KB, F1 RD với IC50 3,55; 4,42 4,52 µg/mL Hợp chất TG12, flavonoid phân lập lượng lớn từ dấu dầu nhẵn thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh với dòng tế bào SW480, LU-1, LNCaP với IC50 10,47; 7,73 6,69 µg/mL Hợp chất TG11, TG16 thể hoạt tính chống oxi hóa mạnh giá trị ức chế có hiệu gốc tự DPPH đạt EC50 19,41 11,56 µg/mL Ba hợp chất amide ba hợp chất amide lần phân lập từ chi Tetradium N-isobutyl-2E,4Etetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E- decadienamide (TG19), N-isobutyl-2E,4E,8Etetradecatrienamide (TG20) thể hoạt tính kháng lao yếu KẾT LUẬN Từ vỏ thân dấu dầu nhẵn (Tetradium glabrifolium) phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất glycoside ester: tetraglabrifolioside (TG1) 25 hợp chất gồm: năm alkaloid: 6-acetonyl-N-methyldihydrodecarine 22 (TG2), 6-acetonyldihydrochelerythrine (TG3), decarine (TG4), iwamide (TG5) rutaecarpine (TG6); tritrerpenoid: 12α-hydroxyevodol (TG7), rutaevine (TG8), lupeol (TG9) friedelan-3-one (TG10); flavonoid: phellamurin (TG11), epimedoside C (TG12), astragalin (TG13), nicotiflorin (TG14), trifolin (TG15) quercetin (TG16); dẫn xuất phenol: α-tocopherol (TG17); amide: N-isobutyl-2E,4E-tetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E-decadienamide(TG19) N-isobutyl-2E,4E,8E- tetradecatrienamide (TG20); benzenoid: syringin (TG21), saikolignannisode A (TG22) picraquassioside D (TG23); sterol: stigmatsterol (TG24) daucosterol (TG25); fufural: 5-hydroxymethylfurfural (TG26) Trong đó, có 15 hợp chất lần đầu phân lập chi Tetradium Đã thử hoạt tính: gây độc tế bào ung thư in vitro, kháng lao, chống oxi hóa kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập từ dấu dầu nhẵn, kết thử hoạt tính cho thấy: - Hợp chất TG2 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư, KB, F1 RD với giá trị IC50 là: 3,55; 4,42 4,54 µg/mL; TG12 thể hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư SW480, LU-1, LNCaP với IC50 10,47; 7,73 6,69 µg/mL - Hợp chất N-isobutyl-2E,4E-tetradecadienamide (TG18) thể hoạt tính kháng vi khuẩn lao M bovis với giá trị MIC 22 µg/mL - Hợp chất TG11 TG16 thể hoạt tính tiêu diệt gốc tự DPPH với giá trị EC50 19,41 11,56 µg/mL - Hợp chất TG11 thể hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus với giá trị IC50 32,0 µg/mL KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thành phần hóa học dấu dấu nhẵn, chúng tơi nhận thấy lồi có tương đồng thành phần hóa học với lồi T ruticarpum, vị thuốc đơng y sử dụng từ lâu đời Trung Quốc Tuy nhiên dấu dầu nhẵn chưa ứng dụng khai thác nhiều Vì vậy, cần thêm nghiên cứu sinh học dược học để khẳng định thêm giá trị khoa học dấu dầu nhẵn, góp phần việc tạo sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Trương Thị Thu Hiền, Nguyễn Văn Thanh, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Tuyến, Đan Thúy Hằng, Ninh Khắc Bản, Nguyễn Xuân Cường, Các hợp chất flavonoid glycosit phân lâp từ Tetradium glabrifolium, Tạp chí Hóa học, 2011, 49(6), 733738 Trương Thị Thu Hiền, Hoàng Lê Tuấn Anh, Phạm Hải Yến, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, Nguyễn Xuân Nhiệm, Nguyễn Anh Hưng, Nguyễn Văn Tuyến, Phan Văn Kiệm, Các hợp chất limonoid triterpenoit phân lập từ dấu dầu nhẵn (Tetradium glabrifolium), Tạp chí Hóa học, 2013, 51(1), 96-102 Trương Thị Thu Hiền, Hoàng Lê Tuấn Anh, Phạm Hải Yến, Đan Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thị Cúc, Dương Thị Hải Yến, Dương Thị Dung, Vũ Mạnh Hà, Nguyễn Xuân Nhiệm, Nguyễn Văn Tuyến, Phan Văn Kiệm, Các hợp chất amit α-tocopherol phân lập từ vỏ dấu dầu nhẵn (Tetradium glabrifolium), Tạp chí Hóa học, 2013, 51(1), 127-131 Truong Thi Thu Hien, Hoang Le Tuan Anh, Pham Hai Yen, Dan Thi Thuy Hang, Nguyen Thi Cuc, Duong Thi Hai Yen, Duong Thi Dung, Vu Manh Ha, Nguyen Xuan Nhiem, Nguyen Van Tuyen, Phan Van Kiem, Alcaloids from the stem bark of Tetradium glabrifolium, Journal of Chemistry (Vietnamese), 2013, 51(2), 156161 Nguyễn Văn Thanh, Trương Thị Thu Hiền, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Tuyến, Đan Thúy Hằng, Ninh Khắc Bản, Tetraglabrifolioside, dẫn xuất acid glutaric phân lập từ Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl., Tạp chí Dược học, 2013, 477(53), 43-48