NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ***** NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC Mã số: 62.73.15.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Người cam đoan, Nguyễn Hữu Lạc Thủy i MỤC LỤC MỤC LỤC i BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học Trinh nữ hoàng cung 1.2 Tổng quan hóa học chi Crinum Trinh nữ hoàng cung 1.3 Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum Trinh nữ hoàng cung 14 1.4 Chiết hoạt chất từ dược liệu dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn 21 1.5 Các phương pháp nghiên cứu hóa học Trinh nữ hoàng cung 22 1.6 Phương pháp thiết lập chất đối chiếu 24 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên vật liệu 27 2.2 Trang thiết bị 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid phân đoạn flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung 40 3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 46 3.3 Thiết lập chất đối chiếu 69 3.4 Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính định lượng alcaloid flavonoid TNHC 82 3.5 Đề xuất số tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột Trinh nữ hoàng cung 99 ii CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 102 4.1 Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ Trinh nữ hoàng cung 102 4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 107 4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung 111 4.4 Quy trình định lượng alcaloid flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung 112 4.5 Các tiêu cần thiết Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC 117 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN PHỤ LỤC iii BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á) AL-NK Phân đoạn alcaloid chiết từ TNHC phương pháp ngấm kiệt AL-SA Phân đoạn alcaloid chiết từ TNHC sóng siêu âm AL-SFE Phân đoạn alcaloid chiết từ TNHC phương pháp SFE AR-96 Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% As Hệ số bất đối CĐC Chất đối chiếu CE Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area (Diện tích pic chuẩn hóa) CZE Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) d doublet (đỉnh đôi) DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxyd DVT Dấu vân tay ESI Electrospray Ionization (Ion hóa cách phun ion) FL-NK Phân đoạn flavonoid chiết từ TNHC phương pháp ngấm kiệt FL-SA Phân đoạn flavonoid chiết từ TNHC sóng siêu âm FL-SFE Phân đoạn flavonoid chiết từ TNHC phương pháp SFE FR-96 Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% GC Gas Chromatography (Sắc ký khí) GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared (Hồng ngoại) iv J Coupling constant (Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) L-SFE Cao toàn phần chiết từ TNHC phương pháp SFE MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PĐ Phân đoạn PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phịng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Rs độ phân giải pic có thời gian lưu nhỏ lớn kề bên S Diện tích pic (µV x giây) s singlet (Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết chất lỏng siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TCKN Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TR Thời gian lưu (phút) TM Thời gian di chuyển (phút) TNHC Trinh nữ hoàng cung TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân khơng) v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hình vẽ TNHC Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học alcaloid khung crinin Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) khung tazettin (B) Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) cấu trúc khung galanthamin (D) Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) cấu trúc khung cheryllin (F) Hình 1.6: Cấu trúc hóa học flavonoid chi Crinum Hình 1.7: Cấu trúc hóa học hợp chất flavonoid TNHC 10 Hình 3.1: Hình cụm hoa TNHC (Crinum latifolium L.) 40 Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.) 40 Hình 3.3: SKĐ hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid 48 Hình 3.4: SKĐ hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR flavonoid 48 Hình 3.5: Cấu trúc hóa học liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) (2) 58 Hình 3.6: Cấu trúc hóa học 6-ethoxyundulatin 58 Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC crinamidin HPLC 71 Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC 72 Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC lycorin HPLC 72 Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC hippadin HPLC 73 Hình 3.11: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC astragalin HPLC 73 Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC isoquercitrin HPLC 74 Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC 85 Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp HPLC 89 Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE 92 vi Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp CE 95 Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC 97 Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC 98 Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic 113 Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient 113 Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích CZE MEKC 114 Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha methanol 115 Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha đệm dinatri tetraborat 25 mM 115 Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha dung dịch acid H3PO4 115 Hình 4.7: SKĐ so sánh khả rửa giải mẫu flavonoid TNHC HPLC với pha động methanol acetonitril 116 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ TNHC 29 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ TNHC kết hợp hai phương pháp SFE phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70% 32 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid PĐ flavonoid từ TNHC 42 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid flavonoid từ rễ TNHC 42 Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid flavonoid bột kết hợp hai phương pháp chiết 45 Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE 50 Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA flavonoid FL-SA 82 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Alcaloid TNHC Crinum latifolium L 11 Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất phương pháp ngấm kiệt 41 Bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết 43 Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng áp suất lên hiệu suất chiết 44 Bảng 3.4: Kết tách phân đoạn mẫu AL-SFE FL-NK VLC 46 Bảng 3.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập từ cao chiết TNHC 47 Bảng 3.6: Kết phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1 48 Bảng 3.7: Kết triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo 49 Bảng 3.8: Kết phân lập (2) (3) từ PĐ n–hexan 49 Bảng 3.9: Kết phân lập (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK 51 Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) hợp chất (2) 56 Bảng 3.11: Các tương tác proton phổ COSY, HMBC hợp chất (2) 57 Bảng 3.12: Kết độ tinh khiết; hàm ẩm phân tích nhiệt trọng lượng 69 Bảng 3.13: Thành phần pha động bước sóng phát quy trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu CĐC phương pháp HPLC 70 Bảng 3.14: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC 70 Bảng 3.15: Kết xác định độ tinh khiết sắc ký (%) CĐC HPLC 74 Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS điểm chảy CĐC 75 Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR CĐC 75 Bảng 3.18: Kết đánh giá đồng lô CĐC sau đóng gói 77 Bảng 3.19: Kết phân tích robust A CĐC crinamidin 79 Bảng 3.20: Kết phân tích robust A CĐC 6-hydroxycrinamidin 79 Bảng 3.21: Kết phân tích robust A CĐC hippadin 80 Bảng 3.22: Kết phân tích robust A CĐC lycorin 80 Bảng 3.23: Kết phân tích robust A CĐC astragalin 81 viii Bảng 3.24: Kết phân tích robust A CĐC isoquercitrin 81 Bảng 3.25: Kết xác định giá trị ấn định giá trị công bố CĐC 81 Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng alcaloid HPLC 83 Bảng 3.27: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC (n = 6) 83 Bảng 3.28: Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC (n = 6) 86 Bảng 3.29: Kết khảo sát tỷ lệ phục hồi quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC (n = 9) 87 Bảng 3.30: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình đinh lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp HPLC (n = 6) 88 Bảng 3.31: Kết khảo sát độ xác quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC HPLC (n = 6) 90 Bảng 3.32: Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp HPLC (n = 9) 90 Bảng 3.33: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE (n = 6) 91 Bảng 3.34: Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE (n = 6) 93 Bảng 3.35: Kết khảo sát tỷ lệ phục hồi quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE (n = 9) 93 Bảng 3.36: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC CE (n = 6) 94 Bảng 3.37: Kết khảo sát độ xác quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC CE (n = 6) 96 Bảng 3.38: Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp CE (n = 9) 96 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L – Amaryllidaceae) dược liệu sử dụng phổ biến thực phẩm chức dạng bào chế thuốc cổ truyền thuốc đại Công dụng quan tâm thử nghiệm lâm sàng điều trị u xơ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt cho tác dụng thành phần alcaloid với chế phẩm Crila, Tadimax [16], [26] Kế đến cơng dụng kháng viêm, chống oxi hóa in vitro nhóm flavonoid nghiên cứu [16], [95] Tuy nhiên, nhà khoa học kỳ vọng vào tác dụng kháng khối u loài Cho đến có nhiều cơng trình nghiên cứu khả kháng ung thư từ cao toàn phần như: cao ethanol (có thành phần alcaloid) làm chậm phát triển khối u gây tế bào Sarcoma TG 180 [11]; cao methanol ức chế NF-κB [103]; cao chiết nước kích thích sinh sản hoạt hóa tế bào lympho T [139]; khả ức chế phát triển tế bào ung thư hồi phục chức miễn dịch (in vitro) cao chiết nước tác dụng đáng ý giải thích tính kháng ung thư loài Crinum latifolium [31], [95], [139] Các hợp chất alcaloid tinh khiết phân lập từ Trinh nữ hoàng cung (TNHC) lycorin, pratorimin, undulatin, crinafolin crinafolidin thực nghiệm chứng minh có khả ngăn chặn chọn lọc phát triển tế bào ung thư thực nghiệm Thành phần hóa học tác dụng sinh học TNHC nhiều tác giả quan tâm nhiều cơng trình nghiên cứu công bố hai lĩnh vực – năm 2013, có khoảng 30 cơng trình cơng bố dạng báo khoa học Tuy nhiên nghiên cứu lĩnh vực kiểm nghiệm hạn chế (khoảng cơng trình): phương pháp quang phổ định lượng alcaloid toàn phần [22]; phương pháp GC định danh thành phần alcaloid [11], [106]; phương pháp HPLC định lượng alcaloid dựa chất đối chiếu [12], [24], [27] Chưa có nghiên cứu ứng dụng phương pháp CE chưa có cơng trình cơng bố việc định lượng đồng thời số alcaloid hay flavonoid TNHC Dược điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận TNHC Do đó, vấn đề quản lý đảm bảo chất lượng nguyên liệu chế phẩm có thành phần TNHC chưa thực cách chặt chẽ Nguyên nhân chủ yếu thành phần hóa học dược liệu chưa nghiên cứu toàn diện; chất đánh dấu nguyên liệu chưa xác định hồn tồn chưa có chất đối chiếu có nguồn gốc từ dược liệu phân phối thị trường Với mong muốn góp phần giải bất cập góp phần vào công tác “Đảm bảo chất lượng” cho dược liệu Trinh nữ hồng cung, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid flavonoid cho Trinh nữ hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” với mục tiêu sau: Chiết xuất cao cồn, phân đoạn alcaloid, phân đoạn flavonoid phân lập hợp chất tinh khiết từ Trinh nữ hoàng cung Thiết lập số chất đối chiếu hóa học có nguồn gốc từ Trinh nữ hoàng cung Xây dựng quy trình định tính, định lượng alcaloid flavonoid Trinh nữ hoàng cung phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao điện di mao quản Đề xuất số tiêu cần thiết cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Trinh nữ hoàng cung 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN THỰC VẬT HỌC CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG 1.1.1 Họ Amaryllidaceae chi Crinum Họ Amaryllidaceae có tên gọi theo đa số tài liệu nhà thực vật học Việt nam họ Thủy tiên [4], [5], [21], Loa kèn đỏ [1], Náng [7] hay Lan Huệ Vị trí chi Crinum thuộc họ Thủy tiên theo hệ thống phân loại ngành thực vật hạt kín A L Takhtajan công bố năm 1987 sửa đổi năm 2009 [4], [36] sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Hành (Liliidae) Liên hành (Lilianae) Bộ Thủy tiên (Amaryllidales) Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) Chi Crinum L Đặc điểm hình thái họ Thủy tiên: thân cỏ, sống nhiều năm nhờ hành hay thân rễ Lá mọc từ gốc, mỏng hay mọng nước, gân song song Đối với chi Crinum, bẹ hợp thành thân giả cao 10-15 cm Cụm hoa dạng chùm, tán, hay nhiều hoa có mo bao lại Trục cụm hoa dài mọc từ mặt đất Hoa đều, lưỡng tính, vịng, mẫu Bao hoa: phiến màu dạng cánh hoa, dính thành ống dài, rời Vài loại có tràng phụ Bộ nhị: nhị đính vịng Chỉ nhị rời hay dính Bao phấn thẳng hay lắc lư Bộ nhụy: noãn tạo thành bầu ơ, chứa nhiều nỗn, đính nỗn trung trụ; vịi nhụy, đầu nhụy chia thùy Quả: thơng thường nang nứt lưng Hạt có nội nhũ [5] Chi Crinum có khoảng 130 lồi vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới vùng nóng Ở Việt Nam, chi Crinum có lồi trồng làm cảnh làm thuốc: Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr., Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F [4] 1.1.2 Cây Trinh Nữ Hoàng Cung (TNHC) Tên khoa học: Crinum latifolium L Tên thông thường: Trinh Nữ Hoàng Cung [11], Hoàng Cung Trinh Nữ [17], Tỏi lơi rộng [1], [4], Náng rộng [4], [7], [9] Đặc điểm hình thái: nhiều nhà thực vật học Việt nam mô tả chi tiết [1], [4], [5], [7], [11], [14], [17], [21] Tài liệu [7] phù hợp với hầu hết tài liệu khác: cỏ nhiều năm; thân hành, hình cầu, phía ngồi có áo mỏng, phía có thân giả ngắn bẹ ôm sát làm thành Phiến dạng bản, kích thước 60-90  7-10 cm, màu xanh nhạt, nạc, mặt lõm xuống thành hình máng, mép lượn sóng, gân lồi lên mặt dưới, gân bên song song, chóp nhọn, gốc dạng bẹ Cụm hoa tán, có 10-20 hoa; cuống cụm dài 60-90 cm, chiều ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, gốc tím nhạt Lá bắc tổng bao 2, dạng mo, mỏng, kích thước 7,5-10,0  2,5-3,0 cm Hoa đều, lưỡng tính, màu tím hồng, đứng thẳng; cuống hoa ngắn Bao hoa dài 15-20 cm, mảnh, dạng tràng, phần dính thành ống dài 9-10 cm, thẳng đứng cong lên, phần thùy, hình mũi giáo, lưng có dải màu tím hồng, đậm hơn, nhạt dần phía mép, chóp nhọn ngắn, có mũi màu hồng Nhị 6, rời nhau; nhị dài 6-7 cm, dạng sợi, màu trắng, thẳng đứng chỗi ra, đính họng ống bao hoa; bao phấn màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, ơ, hình dải, đính lưng, hướng trong, mở khe dọc Bầu hạ, hình thoi, ơ, 5-6 nỗn; vịi nhụy dài 15-18 cm, dạng sợi, dài, mảnh, phía màu tím thẫm nhạt dần xuống phía dưới; đầu nhụy nhỏ, dạng cầu Quả nang, hình cầu, đường kính 4-5 cm Tài liệu [17] mơ tả nhị TNHC có màu đỏ, tài liệu khác [7], [11] mơ tả phận có màu trắng Các tài liệu cịn lại khơng đề cập chi tiết Phân bố - Sinh thái: TNHC trồng rộng rãi Ấn Độ, Thái lan, Trung Quốc, Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào Ở Việt Nam, trồng chủ yếu tỉnh từ Quảng Nam-Đà Nẵng trở vào Mùa hoa quả: tháng 8-9 Là loại ưa ẩm, sáng phần bóng mát Sinh trưởng phát triển khí hậu nóng ẩm vùng nhiệt đới Mỗi năm cho 6-8 đẻ thêm 3-5 hành Cây hoa hàng năm vào khoảng tháng 6-8 Bộ phận dùng chủ yếu thân hành [1] 5 Cây TNHC nghiên cứu nhân giống phương pháp cấy mơ [20] Hình 1.1: Hình vẽ TNHC: Cây với thân hành Cụm hoa; Một phần bao hoa nhị; Bộ nhụy “Nguồn: Nguyễn Thị Đỏ, 2007” [7] Năm 2012, thứ loài TNHC nhóm tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Trần Cơng Khánh xác định quần thể Crinum Việt nam “Trinh nữ Crila” có tên khoa học Crinum latifolium L var Crilae Tram & Khanh, var n [32] 1.2 TỔNG QUAN HÓA HỌC CỦA CHI CRINUM VÀ CÂY TNHC Thành phần hóa học lồi chi Crinum nghiên cứu từ năm 1950 Nhóm hợp chất alcaloid, nhóm non-alcaloid, đặc biệt hợp chất phenolic [116] Chi Crinum xem đại diện cho họ Amaryllidaceae thành phần hóa học có hầu hết hợp chất chi khác họ Khoảng 180 alcaloid thuộc nhiều nhóm cấu trúc khác phân lập định danh Phần lớn chúng thuộc khung alcaloid crinin (5,10 b-enthanophenanthridin), lycorin (benzopyrano-(3,4 g)indol) tazettin (2-benzopyrano-(3,4 c)-indol) [116] Khoảng 100 hợp chất non-alcaloid phân lập định danh, chúng thuộc nhóm flavonoid, chromon, coumarin, terpenoid, steroid, ionon, alcohol, aldehyd, ceton, acid, ester hydrocarbon mạch dài Phenolic nhóm chiếm ưu nhóm hợp chất non-alcaloid [107], [116] Thân hành phận nghiên cứu nhiều nhất, hợp chất alcaloid flavonoid tìm thấy chủ yếu từ phận 6 1.2.1 Thành phần hóa học loài chi Crinum 1.2.1.1 Alcaloid chi Crinum Alcaloid khung crinin: nhóm đại diện cho alcaloid Crinum phần lớn alcaloid thuộc khung với 80 alcaloid phân lập Cấu trúc alcaloid khung thay đổi theo cấu trúc sau [107], [116]: Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học alcaloid khung crinin Alcaloid khung lycorin: lycorin nhóm xếp thứ hai sau nhóm crinin số lượng alcaloid với khoảng 40 alcaloid phân lập Đại diện lycorin, tìm thấy 30 lồi Crinum Kế đến hippadin, pratorimin pratorinin [107], [116] Alcaloid khung tazettin: khoảng 13 alcaloid thuộc khung này, đại diện tazettin criwellin tìm thấy 6-7 loài Crinum Cấu trúc alcaloid khung tazettin thay đổi vị trí R1, R2, R3, R4, số (3 alcaloid) có cấu trúc vịng methylendioxy mở thay nhóm CH3O- (ornamin - C18H21NO3); nhóm -OH (ornazidin-C16H20NO3); nhóm -OH nhóm acetyl (ornazamin - C18H22NO4) R1 N R2 O R3 O O R4 (A) (B) Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) khung tazettin (B) Alcaloid kiểu khung belladin: alcaloid tìm thấy, đại diện belladin [57], latisodin latisolin [55] phân lập từ C asiaticum C latifolium 7 Alcaloid khung galanthamin: galanthamin alcaloid đại diện cho khung này, tìm thấy thân hành lồi Crinum Các alcaloid cịn lại (khoảng alcaloid) có cấu trúc thay đổi theo khung Galanthamin (C) (D) Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) cấu trúc khung galanthamin (D) Alcaloid khung lycorenin: alcaloid có cấu trúc thay đổi vị trí R1, R2, R3, R4 Riêng hippeastrin có cấu trúc vịng methylendioxy vị trí R1 R2 (E) (F) Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) cấu trúc khung cheryllin (F) Các kiểu khung lại có số lượng alcaloid hơn: Alcaloid khung narciclasin: crinasiadin - C14H9NO3, crinasiatin - C22H17NO4 narcicrinin - C14H17NO5 Alcaloid khung cheryllin: cheryllin - C17H19NO3 latifin - C17H19NO3 Alcaloid khung phenanthridin: trisphaeridin - C14H9NO2 3-hydroxy-8,9methylendioxyphenanthridin Alcaloid khung augustamin: augustamin - C17H19NO4 Alcaloid khung latindin: latindin - C41H31N3O10 8 1.2.1.2 Các nhóm hợp chất non-alcaloid chi Crinum Khoảng 100 hợp chất định danh, flavonoid nhóm cơng bố với số hợp chất phân lập nhiều [107], [116] Nhóm flavonoid: 24 flavonoid phân lập từ thân hành hoa Hai flavonoid 3’4’-dihydroxyflavan 7-hydroxy-8-methoxyflavanon phân lập từ Crinum latifolium, lần tìm thấy họ Amaryllidaceae [104] Isoliquiritigenin (2’,4,4’-trihydroxychalcon) từ C bulbispermum cấu trúc chalcon tìm thấy chi Crinum [112] Flavonoid chi Crinum có cấu trúc thuộc nhóm sau: R4 R2 R1 OH R3 O OH O R2O R1 O (A) (B) Cấu trúc flavonoid nhóm flavan (A) Cấu trúc flavonoid nhóm flavanon (B) R6 R5 R3 R1 R2 O (C) OH R3 R2 OR4 O R4O R1 R1 OR7 OR3 OH O O (D) Cấu trúc flavonoid nhóm flavon (C) (D) R2 (E) Cấu trúc flavonoid nhóm chalcon (E) Hình 1.6: Cấu trúc hóa học flavonoid chi Crinum Nhóm coumarin: tìm thấy lồi C latifolium [104], hai hợp chất coumarin gồm 4-[(senecioyloxy)methyl]-3-4-dimethoxycoumarin - C17H20O6 4[(senecioyloxy)methyl]-6-7-dimethoxycoumarin - C17H20O6 Nhóm terpenoid sterol: steroid thực vật stigmasterol, sitosterol, dihydrositosterol tìm thấy vài lồi chi Crinum Nhóm acid béo: 20 acid béo linoleic, palmitic, arachidic, myristic, oleic, palmitic, stearic… định danh từ dịch chiết nước 9 Nhóm carbohydrat: gồm resin, pectin, hemicellulose, glucan polysaccharid Thân hành loài C amabile chứa 5,4% saccharid; 8,7% pectin, 8,2% hemicellulose Glucan A B từ loài C latifolium, glucan A chứa 12 đơn vị glucose 110 gốc glucose Glucose, arabinose, xylose, galacturonic glucuronic acid phân lập từ dịch chiết nước thân hành loài C bulbispermum 1.2.2 Thành phần hóa học TNHC - Crinum latifolium L - Thành phần hóa học lồi C latifolium khảo sát từ năm 1982 nhóm tác giả nước ngồi Ghosal S [53], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], [62], Kobayashi S [83], [84] thực - Những nghiên cứu Việt Nam thành phần hóa học lồi phải kể đến cơng trình tác giả Phan Tống Sơn [9], Nguyễn Công Hào [8], [33], [102], Nguyễn Hải Nam [103], [104], Võ Thị Bạch Huệ [11], [12], [13], [14] - Tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm với cơng trình nghiên cứu chủ yếu tác dụng sinh học [31], [106], [107], [139] Alcaloid TNHC: đến có 36 alcaloid phân lập định danh, phần lớn thuộc khung crinin lycorin (Bảng 1.1) - Thành phần hàm lượng alcaloid thay đổi đáng kể theo thời kỳ sinh trưởng, thời kỳ trước sau hoa [58], [62], [106] - Đã có 12 alcaloid phân lập từ TNHC trồng Việt nam, tài liệu [9] công bố nhiều với 12 alcaloid từ dịch chiết thân hành Alcaloid thuộc khung crinin chiếm số lượng nhiều nhất, gồm alcaloid: 6-hydroxybuphanidrin [9], ambellin [8], [9], [11]; crinin [8], [9]; powellin [9]; crinamidin [8], [9], [11]; 6-hydroxycrinamidin [8], [9], [11], [102]; 6-hydroxyundulatin [9]; khung lycorin có pratorinin [9], lycorin [8], [9]; hippadin [9], lycorin-1-OAc [9], khung augustamin có augustamin [9], [11] -Tài liệu [11] cơng bố alcaloid từ dịch chiết lá, 6-hydroxycrinamidin hợp chất alcaloid tự nhiên lần công bố (năm 1998) Nhóm carbohydrat: glucan A B [60]; lectin (methyl-α-mannopyranosid) phân lập từ dịch chiết thân hành [78]