Nghiên cứu tăng cường tích lũy một số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ cây bá bệnh (eurycoma longifolia jack) nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 20 lít)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THU TRANG NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội-2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thu Trang NGHIÊN CỨU TĂNG CƯỜNG TÍCH LUỸ MỘT SỐ ALKALOID CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ SINH KHỐI RỄ TƠ CÂY BÁ BỆNH (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) NUÔI CẤY TRÊN HỆ THỐNG BIOREACTOR 20 LÍT Chun ngành: Hố sinh học Mã sỗ: 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Chu Nhật Huy PGS.TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội, 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu tăng cường tích luỹ số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy hệ thống bioreactor 20 lít” cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, phần tác giả công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Tôi xin chịu trách nhiệm tính xác trung thực luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS Trần Thu Trang i LỜI CẢM ƠN Trong biển kiến thức bao la, thực tìm thuyền lớn để theo đuổi đam mê nghiên cứu khoa học Với vai trò đầu tàu, Thầy, TS Chu Nhật Huy Cơ, PGS.TS Phạm Bích Ngọc chèo lái, hướng dẫn giúp đỡ biết hệ sinh viên tiến đến với ước mơ gặt hái thành công sống đường nghiên cứu khoa học phục vụ cho phát triển nước nhà Cảm ơn Thầy, Cô tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu, không ngừng giúp đỡ để tôi, dẫn hướng cho nghiên cứu, ln nhắc nhở để tơi hồn thành tốt chương trình học luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy PGS.TS Chu Hoàng Hà gợi ý, dẫn, giúp đỡ năm học vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán nghiên cứu Phòng Cơng nghệ Tế bào Thực Vật, Phòng Cơng nghệ Lên men, Phòng Thử nghiệm sinh học, Phòng Dược liệu biển, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sở đào tạo, Khoa Công nghệ sinh họcHọc viện khoa học công nghệ,Viện Công nghệ sinh học hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian học tập Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cảm ơn GS T.Kishimoto, trường Đại học Osaka, Nhật Bản giúp đỡ thực phần cơng trình nghiên cứu luận án Đặc biêt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn vơ hạn tới thành viên đại gia đình thân u tơi Nhờ động viên, khích lệ, đồng hành chia sẻ khó khăn người thân gia đình mà tơi ln có tâm nghị lực cao trình nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả NCS Trần Thu Trang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Bá bệnh 1.1.1 Đặc điểm sinh học phân bố 1.1.2 Thành phần hoá học hoạt tính sinh học alkaloid Bá bệnh 1.1.3 Tác dụng dược lý Bá bệnh 1.2 Ứng dụng Bá bệnh Y học cổ truyền 13 1.3 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 14 1.3.1 Giới thiệu nuôi cấy sinh khối rễ tơ 14 1.3.2 Nuôi cấy rễ tơ quy mô Bioreactor để thu nhận hợp chất thứ cấp .18 1.3.3 Ảnh hưởng elicitor đến tích luỹ HCTC q trình ni cấy rễ tơ Bá bệnh 20 1.3.4 Tình hình nghiên cứu ngồi nước ni cấy sinh khối rễ tơ thu nhận HCTC .23 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu .27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28 2.1.2 Thiết bị hoá chất nghiên cứu .28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Phương pháp định tính sắc ký lớp mỏng 30 2.2.2 Thực nghiệm chiết cao alkaloid tách chất 31 2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học 33 iii 2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính sinh học alkaloid phân lập từ rễ tơ Bá bệnh 33 2.2.5 Thực nghiệm phương pháp định lượng alkaloid thông qua phương pháp HPLC-DAD 36 2.2.6 Đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh bình tam giác 500 ml 37 2.2.7 Xây dựng quy trình ni cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống Bioreactor 20 lít 41 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 42 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Xác định cấu trúc hoá học chất phân lập từ cao chiết alkaloid 43 3.2 Kết khảo sát hoạt tính sinh học chất phân lập từ cao chiết alkaloid cảu rễ tơ Bá bệnh .47 3.2.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư chất thử (1), (2), (3) 47 3.2.2 Thử khả ức chế sản xuất IL-6 TNF-α tế bào đại thực bào chuột người kích thích LPS chất (1), (2), (3) 49 3.3 Xây dựng đường chuẩn định lượng alkaloid mẫu Bá bệnh phương pháp HPLC-DAD 54 3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tăng trưởng tích luỹ chất (1), (2), (3) rễ tơ bình tam giác 500 ml 57 3.4.1 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh 57 3.4.2 Ảnh hưởng ánh sáng đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh 58 3.4.3 Ảnh hưởng chiều dài rễ ban đầu đến sinh trưởng phát triển rễ tơ Bá bệnh 59 3.4.4 Ảnh hưởng khối lượng rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ câyBá bệnh 61 iv 3.4.5 Ảnh hưởng mơi trường khống đến khả sinh trưởng tích luỹ hợp chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one q trình ni cấy rễ tơ Bá bệnh 62 3.4.6 Ảnh hưởng jasmonic acid (JA) lên tăng sinh tích luỹ chất (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one q trình ni cấy rễ tơ Bá bệnh 69 3.4.7 Ảnh hưởng salicylic acid (SA) lên tăng sinh tích luỹ chất (1) 7MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one q trình ni cấy rễ tơ Bá bệnh 72 3.4.8 Ảnh hưởng dịch chiết nấm men (YE) lên tăng sinh tích luỹ chất (1) 7-MCPA, (2) 9-methoxycanthin-6-one, (3) 9-hydroxycanthin-6-one trình nuôi cấy rễ tơ Bá bệnh 76 3.5 Xây dựng quy trình ni cấy thu nhận sinh khối rễ tơ Bá bệnh hệ thống bioreactor 20 lít .82 3.5.1 Thiết lập hệ thống nuôi cấy .82 3.5.2 Đánh giá tích luỹ alkaloid (1), (2), (3) q trình ni cấy rễ tơ hệ thống bioreactor 20 lít so với rễ tự nhiên 87 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 90 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 MỤC LỤC 103 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon) H-1H-COSY : 1H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton) H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 7-MCPA : 7-methoxy-(9H-b-carbolin-1-il)-(E)-1-propenoic acid ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng thực vật Chất (1) : 7-MCPA Chất (2) : 9-methoxycanthin-6-one Chất (3) : 9-hydroxycanthin-6-one d : Dublet dd : Dublet dublet DEPT : Distortionless Enhancement By polarization Transfer (Phổ DEPT) ĐK-Bb : Xây dựng phương pháp phân tích mẫu Bá bệnh HPLC DMSO : Dimethyl sulfoxyde dq : Dublet quartet dt : Dublet triplet HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan HPLC : High performance liquid chromatography (sắc ký lỏng hiệu cao) HSQC : Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) IC50 : Nồng độ ức chế 50% phát triển cá thể nghiên cứu J(Hz) : Hằng số tương tác tính Hz JA : Jasmonic acid KB : Dòng tế bào ung thư biểu mơ vi KLK : Khối lượng khô KLT : Khối lượng tươi LPS : Escherichia coli 055:B5 LPS : Lipopolysaccharide LU-1 : Dòng tế bào ung thư phổi m : Multiplet MCF-7 : Dòng tế bào ung thư vú MS : Mơi trường Murashige Skoog – 1962 MS : Murashige & Skoog, 1962 MTT : (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl bromide) NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PBS : Huyết bò (fetal bovine serum) q Rễ TN : Quartet : Rễ tự nhiên S : singulet SA : Salicylic acid SH : Môi trường Schenk Hildebrandt - 1972 SH : Schenk and Hidebrandt, 1972 t : Triplet TCA : Acid tricloacetic TLC : Thin layer chromatography (sắc ký lớp mỏng) Trypsin EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid WPM : Môi trường McCown’s Woody Plant - 1981 WPM : McCown’s Woody Plant, 1981 YE : Yeast extract (dịch chiết nấm men) δ (ppm) : Độ chuyển dịch hóa học tính ppm vii tetrazolium DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thành phần hoá học phân lập từ Bá bệnh tác dụng dược lý chúng Bảng 1.2 Sản xuất hợp chất thứ cấp kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ từ số loài thuốc Bảng 3.1 25 Kết thử hoạt tính độc tế bào ung thư chất thử (1), (2), (3) Bảng 3.2 10 47 Kết xác định nồng độ ức chế sản xuất 50 % IL-6 TNF-α tế bào 51 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn ba alkaloid (1), (2), (3) 55 Bảng 3.4 Sự phát triển rễ tơ Bá bệnh môi trường lỏng thạch 57 Bảng 3.5 Sự phát triển rễ tơ điều kiện tối sáng 59 Bảng 3.6 Ảnh hưởng chiều dài rễ cấy chuyển đến sinh trưởng phát triển rễ tơ 60 Bảng 3.7 Sự phát triển rễ tơ 100 ml môi trường 62 Bảng 3.8 Ảnh hưởng môi trường khoáng đến sinh trưởng phát triển Bảng 3.9 rễ tơ 63 Ảnh hưởng môi trường khống đến tích luỹ chất 7MCPA 65 Bảng 3.10 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tích luỹ 9- methoxycanthin-6-one 65 Bảng 3.11 Ảnh hưởng mơi trường khống đến tích luỹ chất 9hdroxycanthin-6-one 66 Bảng 3.12 Ảnh hưởng JA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 70 Bảng 3.13 Ảnh hưởng SA lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 73 Bảng 3.14 Ảnh hưởng YE lên sinh trưởng tích luỹ alkaloid rễ tơ Bá bệnh 76 Bảng 3.15 Hiệu tác động elicitor lên tích luỹ alkaloid 80 viii ... tối ưu hố hệ thống bioreactor 20 lít "Nghiên cứu tăng cường tích luỹ số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy hệ thống bioreactor 20 lít”... Nội, 202 0 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án Nghiên cứu tăng cường tích luỹ số alkaloid có hoạt tính sinh học từ sinh khối rễ tơ Bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) nuôi cấy hệ thống bioreactor. .. phục ni cấy sinh khối từ rễ tơ Hình 1.2 Một số sản phẩm sản xuát từ Bá bệnh 1.3 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ 1.3.1 Giới thiệu nuôi cấy sinh khối rễ tơ Rễ tơ tên gọi dùng để rễ nhỏ có lơng sản sinh mạnh