Nghiên cứu qui trình phần lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm đầu khỉ (hericium erinaceus (bull fr ) pers ) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =====***===== Cồ Thị Thùy Vân NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 62420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Mai Hƣơng PGS.TS Trần Liên Hà Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi; số liệu, kết quả, hình ảnh nêu Luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình tác giả khác Hà Nội, ngày TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn tháng năm 2015 Nghiên cứu sinh Giáo viên HD PGS.TS Lê Mai Hƣơng Cồ Thị Thuỳ Vân LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Mai Hương, Phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam PGS.TS Trần Liên Hà, Bộ mơn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu để tơi hồn thành Luận án này; Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội truyền đạt cho tơi kiến thức q báu giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập trường; Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới giúp đỡ, cộng tác cán phòng Nghiên cứu – Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nơng nghiệp; cán phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam; Tôi xin cảm ơn GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt cho lời khuyên dẫn cho nhiều kiến thức nấm lớn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc toàn thể cán công nhân viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi suốt trình học tập, nghiên cứu để tơi hồn thành nhiệm vụ học tập giao Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Cồ Thị Thùy Vân MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất sử dụng nấm dƣợc liệu 1.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất nấm dược liệu 1.1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng nấm dược liệu chăm sóc sức khỏe cộng đồng 1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học nấm dược liệu 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết hợp chất có hoạt tính sinh học nấm dược liệu nước ta 1.2 Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers 1.2.1 Giới thiệu nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers 1.2.2 Vị trí nấm Đầu khỉ phân loại nấm học 1.2.3 Đặc điểm hình thái thể số đặc tính sinh học nấm Đầu khỉ 1.2.4 Thành phần hóa học nấm Đầu khỉ H erinaceus 1.2.4.1 Một số thành phần dinh dưỡng nấm Đầu khỉ 1.2.4.2 Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ 1.2.5 Tình hình ni trồng nấm Đầu khỉ giới nước 1.2.6 Một số phương pháp sử dụng để tách polysaccharide từ thể hệ sợi nấm dược liệu 1.2.6.1 Phương pháp tách chiết cồn 1.2.6.2 Phương pháp tách chiết nước nóng 1.2.6.3 Phương pháp tách chiết kiềm nóng kết hợp với hỗ trợ lị vi sóng siêu âm 1.2.6.4 Phương pháp tách chiết nước nóng kết hợp với hỗ trợ lị vi sóng siêu âm Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.2 Các loại môi trƣờng 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập giống nấm Đầu khỉ 2.3.1.1 Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 2.3.1.2 Phân lập giống nấm Đầu khỉ 2.3.1.3 Nghiên cứu độ tuổi thể nấm thích hợp để phân lập i TRANG 5 10 15 16 17 17 18 18 19 19 21 25 29 29 30 30 31 33 33 35 38 38 38 39 40 giống gốc 2.3.1.4 Nghiên cứu điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể cấp 2.3.2.1 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp (dung tích 200 ml) 2.3.2.2 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp (dung tích 2000 - 5000 ml) 2.3.2.3 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng nuôi trồng nấm Đầu khỉ nguồn chất tổng hợp (dung tích 120 lít) 2.3.2.4 Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch thể 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ nguồn chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể 2.3.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 2.3.3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ nguồn chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể 2.3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3.4 Phương pháp xác định số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit amin nấm Đầu khỉ 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide thể nấm Đầu khỉ 2.3.5.1 Phương pháp thu nhận polysaccharide mẫu thể nấm nấm Đầu khỉ 2.3.5.2 Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 2.3.5.3 Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp 2.3.5.4 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide mẫu nấm 2.3.5.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.3.5.6 Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người ni cấy invitro 2.3.5.7 Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u chiều thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo 2.3.5.8 Phương pháp nghiên cứu động vật thực nghiệm 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H erinaceus 3.1.1 Kết so sánh, đánh giá khảo nghiệm giống nấm Đầu khỉ H erinaceus diện hẹp 3.1.1.1 Một số đặc trưng hình thái giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn ii 40 41 41 42 43 44 45 45 46 46 47 48 48 48 49 49 49 50 51 51 53 54 54 54 54 3.1.1.2 Thời gian sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ khảo nghiệm 3.1.1.3 Đánh giá khả chống chịu loại sâu bệnh hại giống Đầu khỉ nghiên cứu 3.1.1.4 Kết phân tích số thành phần dinh dưỡng nấm Đầu khỉ He1 3.1.2 Kết phân lập lại giống nấm Đầu khỉ 3.1.2.1 Ảnh hưởng phương pháp phân lập đến mọc hệ sợi nấm Đầu khỉ 3.1.2.2 Xác định thời điểm phân lập 3.1.2.3 Kết nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập giống nấm Đầu khỉ a Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng hệ sợi giống gốc b Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sinh trưởng hệ sợi c Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng sợi nấm 3.1.2.4 Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 3.2 Kết nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 3.2.1 Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể (dung tích 200ml) 3.2.1.1 Kết nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 3.2.1.2 Kết nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 3.2.1.3 Ảnh hưởng pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 3.2.1.4 Kết xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp cấy chuyển sang mơi trường dịch thể 3.2.1.5 Kết nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 3.2.1.6 Chế độ nuôi giống a Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp máy lắc b Nghiên cứu chế độ nuôi giống máy khuấy từ 3.2.1.7 Kết nghiên cứu đường cong sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể 3.2.2 Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp dạng dịch thể (dung tích 2000ml – 5000ml) 3.2.2.1 Kết nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng 3.2.2.2 Kết nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống iii 56 57 59 60 61 63 65 65 66 68 70 73 73 73 74 76 76 77 78 79 80 82 85 85 86 trung gian cấp nấm Đầu khỉ dạng dịch thể 3.2.2.3 Kết nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp dạng dịch thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 3.2.2.4 Kết xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp cấy chuyển sang mơi trường dịch thể 3.2.2.5 Kết nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung tích 2-5 lít 3.2.2.6 Kết nghiên cứu tác dụng chất phá bọt trình nhân giống Đầu khỉ trung gian cấp (cho bình lên men dung tích 2-5 lít) 3.2.2.7 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng giống trung gian cấp dạng dịch thể 3.2.3 Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít 3.2.3.1 Kết nghiên cứu thành phần mơi trường nhân giống thể tích 120 lit 3.2.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 3.2.3.3 Kết nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp dạng dịch thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít 3.2.3.4 Kết nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên men thể tích 120 lít 3.2.3.5 Kết xây dựng đường cong sinh trưởng ni trồng dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men) 3.3 Kết nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ ni trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 3.3.1 Ảnh hưởng độ ẩm chất phối trộn đến khả nhiễm bệnh môi trường nuôi cấy sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đầu khỉ 3.3.2 Ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng phối trộn phương pháp khử trùng đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ q trình ni trồng thu thể 3.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sinh trưởng, phát triển hệ sợi nấm Đầu khỉ 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng hệ sợi nấm Đầu khỉ nuôi trồng 3.3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hình thành phát triển thể 3.3.6 Hiệu mang lại áp dụng qui trình cơng nghệ ni trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể 3.4 Kết tách chiết thử hoạt tính sinh học polysaccaride từ iv 87 88 89 90 92 95 96 96 96 97 98 104 104 107 110 112 113 115 118 nấm Đầu khỉ H erinaceus 3.4.1 Nghiên cứu quy trình tách chiết 3.4.1.1 Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp 3.4.1.2 Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH 3.4.2 Xác định hàm lượng polysaccharide thể nấm Đầu khỉ He1 thời điểm nuôi 3.4.3 Kết kiểm tra hàm lượng polysaccharide thể nấm Đầu khỉ khô thu hái sau thời gian bảo quản tháng 3.4.4 Kết thử hoạt tính polysaccharide thu nhận 3.4.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial assay) 3.4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 3.4.4.3 Kết thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u thạch mềm phân đoạn polisaccarid 3.4.4.4 Kết thử nghiệm in vivo tính an tồn hiệu lực chế phẩm polysaccharide tổng HT1 động vật thực nghiệm a Kết nghiên cứu an toàn chế phẩm HT1 a1 Tác dụng HT1 trọng lượng thể thỏ a2 Tác dụng HT1 điện tim thỏ dùng chế phẩm HT1 tuần a3 Tác dụng HT1 đến số số huyết học thỏ dùng HT1 tuần a4 Tác dụng HT1 hoạt độ enzym SGOT, SGPT thỏ a5 Tác dụng HT1 hàm lượng Creatinin thỏ b Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ chế phẩm HT1 c Tác dụng HT1 trình tạo máu Chƣơng KẾT LUẬN DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG PHẠM VI LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO Phụ lục v 118 118 118 120 122 122 122 123 124 126 126 127 127 128 130 131 131 132 135 136 138 144 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CT CTĐC CTNT CSH DMEM DMSO FAO PGA PSF 10 11 Công thức Công thức đối chứng Công thức nuôi trồng Chứng sinh học Dulbecco’s Modified Eagle Medium Dimethylsulfoxide Tổ chức Nông nghiệp Thực phẩm giới Potato glucose agar Dịch kháng sinh: 100đơn vị/ ml Penicilin, 100g /ml Streptomycin sulfate, 0,25g /ml Amphotericin B Polysaccharide tách chiết từ Hericium erinaceus Sắc ký lỏng cao áp 14 HEP HPLC KH&C N KLC IC50 15 LD50 Lethal dose 50, Liều độc cấp tính 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 MEME MTĐC NAA NCS QTCN TCVN TCPTN TSB YF YM Minimum Essential Medium with Eagle’s salt Môi trường đối chứng Nonessential Amino Axit Nghiên cứu sinh Qui trình cơng nghệ Tiêu chuẩn Việt Nam Tiêu chuẩn phòng thử nghiệm Trypcase Soya Broth Quả thể nấm non Hệ sợi nấm 26 27 28 YE SKS XPĐ Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ Sinh khối sợi Xuất phát điểm 12 13 Khoa học Công nghệ Khuẩn lạc cầu Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế tối thiểu 50% vi Bảng 3.52: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT thỏ dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) Nhóm NC Thời điểm XPĐ x SD Tuần III x SD Tuần VI x SD Nhóm chứng Nhóm HT1 89 93,76 14,65 17,16 88,47 9,36 90,5 14,32 > 0,05 81,65 18,97 95,05 15,08 > 0,05 pVI-I p2-1 > 0,05 > 0,05 > 0,05 So với nhóm chứng, tất thời điểm, hoạt độ enzym SGPT nhóm thuốc thử biến đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng nhóm (chứng, thử), hoạt độ enzym SGPT thỏ tuần thứ so với tuần thứ khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) a5 Tác dụng HT1 hàm lượng Creatinin thỏ Bảng 3.53: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin thỏ dùng HT1 thời điểm XPĐ, tuần (n = 8) Nhóm NC Thời điểm Nhóm chứng Nhóm HT1 p2-1 XPĐ x SD 100,11 6,08 102,99 14,39 > 0,05 Tuần III x SD 95,22 9,47 98,32 8,14 > 0,05 Tuần VI x SD 101,12 9,19 > 0,05 100,06 11,09 > 0,05 > 0,05 pVI-I So với nhóm chứng, tất thời điểm, hàm lượng Creatinin nhóm thuốc thử biến đổi khơng có ý nghĩa thống kê (p> 0,05); So sánh riêng nhóm (chứng, thử), hàm lượng Creatinin thỏ tuần thứ so với tuần thứ khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) b Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ chế phẩm HT1 Tác dụng bảo vệ phóng xạ HT1 xác định thông qua tiêu: Thời gian sống trung bình (TGSTB); Tỷ lệ (%) sống sót; Hệ số bảo vệ α, β nhóm CNT; Kết trình bày bảng 3.54 131 Bảng 3.54: Tác dụng bảo vệ phóng xạ HT1 dùng 30 ngày liều 0,5g/kg/24 Nhóm NC Liều CX 5,5 6,5 7,5 8,5 Đối chứng chiếu xạ TGSTB % sống n (ngày) sót 10 21,5 40 10 17,7 30 10 14,6 20 10 9,7 Chiếu xạ + HT1 0,5g/kg TGSTB % sống n (ngày) sót 10 25,2 70 10 24,8 70 10 18,8 40 10 12,4 20 Hệ số bảo vệ α β 0,50 0,52 0,24 0,20 0,48 0,50 0,30 0,10 Tính hệ số giảm liều HT1: HSGL = 7,4/5,8 = 1,27 Kết bảng 3.54 cho thấy thời gian sống trung bình tỷ lệ phần trăm sống sót sau chiếu xạ tất liều chiếu xạ nhóm thử cao nhóm chứng Kết khẳng định khả bảo vệ phóng xạ polysaccaride chiết xuất từ nấm Đầu khỉ; từ kết thử nghiệm mở hướng nghiên cứu sử dụng nấm Đầu khỉ cho bệnh nhân ung thư giai đoạn chiếu xạ sau chiếu xạ nhằm giảm thiểu tác hại xạ trị đến thể người bệnh; Bên cạnh đó, kết làm tiền đề cho nghiên cứu nhằm sản xuất loại thuốc có tác dụng bảo vệ thể hóa trị, xạ trị, sử dụng cho điều trị dự phòng phơi nhiễm phóng xạ c Tác dụng HT1 trình tạo máu Dưới tác dụng xạ ion hố tế bào tủy xương, tế bào lách nhạy cảm dễ bị tổn thương; Các tổn thương thể suy giảm số lượng tế bào hữu hình máu ngoại vi bao gồm loại tế bào hồng cầu (HC), bạch cầu (BC), tiểu cầu (TC), giảm mạnh; Trong BC giảm mạnh sau TC HC Dưới tác dụng HT1, biến đổi số lượng tế bào máu ngoại vi trình bày bảng 3.55 Bảng 3.55: Số lượng tế bào nhóm chuột nhắt trắng tác dụng chiếu xạ chiếu xạ + HT1 Thời điểm sau chiếu xạ Ngày thứ I Ngày thứ IV Ngày thứ IX Ngày thứ I Ngày thứ IV Ngày thứ IX Ngày thứ I Ngày thứ IV Ngày thứ IX Số lƣợng HC (x 10 12/L) Nhóm CX (n=10 ) CX + HT1 (n=10) 7,20 ± 0,80 7,50 ± 0,70 6,6 ± 0,60 7,30 ± 0,40 6,20 ± 0,50 7,10 ± 0,10 Số lƣợng bạch cầu (x 10 9/L) Nhóm CX (n=10) CX + HT1 (n=10) 1,50 ± 0,30 1,80 ± 0,30 0,60 ± 0,20 1,3 ± 0,20 0,88 ± 0,30 1,6 ± 0,40 Số lƣợng tiểu cầu (x 10 9/L) Nhóm CX (n=10 ) CX + HT1 (n=10) 4,30 ± 0,20 4,90 ± 0,60 3,80 ± 0,30 5,10 ± 0,70 4,10 ± 0,30 4,80 ± 0,50 132 p >0,05