NHÂN GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS

Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới 5 Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng một đơn vị diện tích 1 mẫu trong một năm 6 Hình 1.3: Sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

=====***=====

Cồ Thị Thùy Vân

NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG

DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM

ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ

POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Hà Nội - 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi; các số liệu, kết quả, hình ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình của tác giả nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

TM tập thể Giáo viên hướng dẫn

Giáo viên HD 1

Nghiên cứu sinh

PGS.TS Lê Mai Hương Cồ Thị Thuỳ Vân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Lê Mai Hương, Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Trần Liên Hà, Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để tôi hoàn thành Luận án này;

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học

và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu cũng như giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại trường; Đồng thời xin được gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ, cộng tác của các cán bộ phòng Nghiên cứu – Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp; các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam;

Tôi xin cảm ơn GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt đã cho tôi những lời khuyên và chỉ dẫn cho tôi rất nhiều kiến thức về nấm lớn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập được giao

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Cồ Thị Thùy Vân

MỤC LỤC

TRANG

1.1.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu 5 1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu 15 1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính

sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta 16

1.2.1 Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers 17 1.2.2 Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học 18 1.2.3 Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm

1.2.4 Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H erinaceus 19 1.2.4.1 Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ 19 1.2.4.2 Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho

hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 31 1.2.6.4 Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự

hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm 32

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập

2.3.1.1 Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ 39 2.3.1.2 Phân lập giống nấm Đầu khỉ 40 2.3.1.3 Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân

2.3.1.4 Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ 41 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu

khỉ dạng dịch thể các cấp 42 2.3.2.1 Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể 46 2.3.3.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ 46 2.3.3.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ

trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể 47 2.3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 47 2.3.4 Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ 49 2.3.5.1 Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H erinaceus 50

3.1.1 Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ

3.1.1.1 Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ nghiên cứu tuyển chọn 51 3.1.1.2 Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo

3.1.1.3 Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu 57 3.1.1.4 Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm

b Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi 66

c Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng của sợi nấm 68 3.1.2.4 Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ 70

3.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm

sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 3.2.1.4 Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển sang môi trường dịch thể 76 3.2.1.5 Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian

3.2.1.6 Chế độ nuôi giống 77

a Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc 80

b Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ 81 3.2.1.7 Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm

Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể 82 3.2.2 Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích

thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2 87 3.2.2.4 Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển

sang môi trường dịch thể 88 3.2.2.5 Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung

3.2.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng 95 3.2.3.3 Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch

thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít 96

3.2.3.4 Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên

104

3.3.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá trình nuôi trồng thu quả thể

107

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ 111 3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu

He1 trong từng thời điểm nuôi 122 3.4.3 Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm

Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng 124 3.4.4 Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được 125 3.4.4.1 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial

3.4.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay) 126

3.4.4.3 Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid 127 3.4.4.4 Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế

phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm 128

a Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1 128 a1 Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ 129 a2 Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế

a3 Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên thỏ khi dùng HT1 6 tuần 131 a4 Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT,

a5 Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ 134

b Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

7 FAO Tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới

8 PGA Potato glucose agar

9 PSF Dịch kháng sinh: 100đơn vị/ ml Penicilin, 100 g /ml Streptomycin

14 IC50 Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế tối thiểu 50%

15 LD50 Lethal dose 50, Liều độc cấp tính

16 MEME Minimum Essential Medium with Eagle’s salt

17 MTĐC Môi trường đối chứng

18 NAA Nonessential Amino Axit

19 NCS Nghiên cứu sinh

20 QTCN Qui trình công nghệ

21 TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

22 TCPTN Tiêu chuẩn phòng thử nghiệm

23 TSB Trypcase Soya Broth

24 YF Quả thể nấm khi còn non

25 YM Hệ sợi nấm

26 YE Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ

27 SKS Sinh khối sợi

28 XPĐ Xuất phát điểm

DANH MỤC CÁC BẢNG

TRANG

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm Đầu khỉ 19

Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ H

Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể của các giống nấm Đầu khỉ H

erinaceus khảo nghiệm trên môi trường PGA và CTNT 1 55

Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống nấm Đầu khỉ khảo

Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu

Bảng 3.10: Đặc điểm của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các môi trường

Bảng 3.11: Đặc điểm của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết nuôi

trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 70 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh

Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh

trưởng của giống dịch thể trung gian cấp 1 74

Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi

nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 76 Bảng 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm

Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8 76 Bảng 3.16: Ảnh hưởng của chế độ nuôi lắc và khuấy đến sự sinh trưởng của

giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8 79 Bảng 3.17: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hình thái và sinh khối hệ sợi nấm Đầu

Bảng 3.18: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy từ đến hình thái và sinh khối hệ sợi

Nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 81 Bảng 3.19: So sánh giống dịch thể trung gian cấp 1 khi nuôi ở 2 chế độ: nuôi

Bảng 3.20: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh

dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml) 85 Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong các môi

trường dinh dưỡng khác nhau 86 Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến kích thước và đặc điểm hệ sợi

Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm

Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể trong CT12 88 Bảng 3.24: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể

Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ

Bảng 3.26 Sự sinh của giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12

Bảng 3.27: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh

dưỡng trong bình lên men 120lit 95 Bảng 3.28: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong nồi lên men 120 lít ở từng thời

Bảng 3.29: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu và phương pháp

khử trùng đến tỷ lệ nhiễm 107 Bảng 3.30: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu nuôi trồng đến sự

sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ và năng suất nấm thương phẩm 110 Bảng 3.31: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh

trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3 112 Bảng 3.32 So sánh tổng thời gian nuôi trồng và năng suất nấm Đầu khỉ khi sử

dụng giống dịch thể và giống trên cơ chất hạt 113 Bảng 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trên

Bảng 3.34: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự hình thành và phát triển

quả thể nấm Đầu khỉ trên CTNT3 117 Bảng 3.35: Hoạch toán đầu vào cho 1 tấn nguyên liệu đã xử lý để nuôi trồng

Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide trong hai mẫu Đầu khỉ mới thu hái và

Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu

Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình DII khi dùng

HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 129 Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) ở đạo trình DII khi dùng

HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 130 Bảng 3.49: Sự xuất hiện sóng điện tim bệnh lý thỏ ở đạo trình DII khi dùng

HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 130 Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 1012/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các

thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 131 Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l)ở thỏ khi dùng HT1 ở các

thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 131 Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các

thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 132 Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 109/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các

thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 132 Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời

điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 133

Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời

điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 133 Bảng 3.56: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin của thỏ khi dùng HT1 ở các thời

điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8) 134 Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 khi dùng 30 ngày liều

Bảng 3.58: Số lượng tế bào ở nhóm chuột nhắt trắng dưới tác dụng của chiếu xạ

Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới 5 Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng

một đơn vị diện tích (1 mẫu) trong một năm 6 Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011 7 Hình 1.4: Một số hình ảnh mô tả các công đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống

nấm dạng dịch thể ở một số công ty Hàn Quốc 9 Hình 1.5: Liên kết β -1, 3 và β -1, 6 trong chuỗi polysaccharide 12

Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus trong tự nhiên 17 Hình 1.7: Hình thái quả thể nấm Đầu khỉ nuôi trồng nhân tạo 18 Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại trên nấm Đầu khỉ trong giai đoạn ươm sợi và ra

mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng 63 Hình 3.6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết khi

sử dụng quả thể phân lập ở các giai đoạn phát triển khác nhau 64 Hình 3.7: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung thêm các nguồn các bon khác nhau 66 Hình 3.8: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung các nguồn nito khác nhau 68 Hình 3.9: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau 69 Hình 3.10: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các công

thức môi trường dinh dưỡng khác nhau 70 Hình 3.11: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 71 Hình 3.12: Qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ 72 Hình 3.13: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau 75 Hình 3.14: Sinh khối sợi nấm trong các công thức môi trường khác nhau 75 Hình 3.15: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường CT8 ở chế độ nuôi

lắc tạo thành dạng khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai xung quanh 76 Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi

Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu

khỉ trong môi trường CT8 78

trên máy khuấy từ khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít, thời gian nuôi 7 ngày

Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể

trong môi trường CT12 và mức độ tạo bọt 91 Hình 3.28: Tác dụng của chất phá bọt trong quá trình lên men có sục khí, chế độ

sục khí 0,4 - 5,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút 93 Hình 3.29: Đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng

dịch thể trung gian cấp 2 94 Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể,

Hình 3.31: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng

của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể 96 Hình 3.32: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển

sang thể tích 120lit đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT16

97

Hình 3.33: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển

sang bình dung tích 120 lít đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trương CT16

99

Hình 3.34: Đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường

Hình 3.35: Sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong bình lên men dung tích 120 lít, sau

Hình 3.38: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tỷ lệ nhiễm bịch nguyên

liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên CTNT1 106 Hình 3.39: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tốc độ phát triển của hệ

sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT1 109 Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi

trồng khác nhau khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng dịch thể

Hình 3.48: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian của quả thể nấm Đầu khỉ He1 124 Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn

Hình 3.50: Thử nghiệm HT1 trên chuột 136 Hình 3.51: Kết quả thử hoạt tính in vivo chiết phẩm của nấm Đầu khỉ 136

MỞ ĐẦU

Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh

tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự nhiên Nhiều loài nấm lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc

và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương… Trên thế giới có khoảng hơn 2000 loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu quả và năng suất cao Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai [16]

Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây

là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh đó điều kiện tự nhiên của nước ta rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến cũng như thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu Công nghệ nhân giống

và nuôi trồng nấm ở nước ta hiện nay chỉ sử dụng giống nhân trên cơ chất rắn như nhân giống trên môi trường thạch, trên mùn cưa, thóc, que sắn; đây là phương pháp truyền thống tuy được sử dụng một cách phổ biến do quá trình sản suất đơn giản nhưng lại có một số nhược điểm sau:

+ Thời gian nhân giống các cấp kéo dài;

+ Giống nấm nhân trên cơ chất rắn có chất lượng không ổn định, tuổi giống không đồng nhất trong toàn bộ chai giống hay túi giống;

+ Phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn gặp nhiều khó khăn trong việc sản xuất giống với số lượng lớn do hệ số nhân giống thấp;

+ Thao tác cấy chuyển giống khó tự động hóa, chịu nhiều tác động của yếu tố ngoại cảnh làm tăng nguy cơ nhiễm Việc kiểm soát nhiễm đối với giống nấm nhân trên cơ chất rắn cũng gặp nhiều khó khăn;

+ Nguyên liệu nhân giống đắt, chi phí nhân công, chi phí khấu hao điện năng, khấu hao nhà xưởng cao;

Hiện nay, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống trên cơ chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội như:

+ Chu kỳ phát triển của giống nấm trong môi trường dịch thể nhanh, qua đó rút ngắn được thời gian nhân giống các cấp và nuôi trồng nấm;

+ Tuổi giống nấm dạng dịch thể đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định do được kiểm soát một cách nghiêm ngặt với các phương pháp thử đơn giản, có kết quả tức thì, độ chính xác cao;

+ Sinh lực giống khỏe do giống phát triển trong môi trường dịch thể được cung cấp đầy đủ dinh dưỡng và được sử dụng trong đúng giai đoạn sinh trưởng mạnh nhất của hệ sợi;

+ Công nghệ nhân giống dạng dịch thể đáp ứng được mọi nhu cầu về giống từ qui

mô nhỏ đến lớn, với hệ số nhân giống cao;

+ Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên vật liệu nhân giống, điện năng, nhân công

Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công nghiệp

Đối tượng nghiên cứu của Luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.)

Pers., đây là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để hỗ trợ điều trị hiệu quả một số bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh về đường tiêu hóa, bệnh mất trí nhớ… Với các lợi ích lớn về giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đang rất quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống, nuôi trồng, chế biến sau thu hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe cộng đồng

Nhận định được tầm quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ mới vào sản xuất giống nấm và nấm thương phẩm, góp phần thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa ngành sản xuất nấm trong nước, qua đó tạo ra nguồn nguyên liệu có giá trị dược học cao cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm, tạo ra các sản phẩm chức năng phục

vụ mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng, Nghiên cứu sinh đã lựa chọn thực hiện Luận án:

“Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ

(Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học”

Luận án là một phần nội dung của Đề tài thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm

cấp nhà nước KC.06/11-15 do Bộ Khoa học và Công nghệ chủ trì: “Nghiên cứu xây dựng

qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể để sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu”; mã

số KC06.01/11-15; thời gian thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014, do Nghiên cứu

sinh làm chủ nhiệm và Đề tài nghị định thư cấp nhà nước: “Nghiên cứu quá trình chuyển

hóa các polymer tự nhiên bởi enzyme từ nấm Việt Nam”, thời gian thực hiện 2011-2013,

do PGS.TS Lê Mai Hương làm chủ nhiệm

Mục tiêu của Luận án

- Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H erinaceus;

- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H erinaceus dạng dịch

thể các cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít;

- Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H erinaceus trên nguồn

cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể;

- Đưa ra được qui trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu

khỉ H erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này;

Nội dung của luận án

- Xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ tuyển chọn, phân lập lại giống nấm

Đầu khỉ H erinaceus nhằm lựa chọn được giống nấm Đầu khỉ có chất lượng tốt, năng suất

cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam, chủ động trong việc nhân giống, duy trì, bảo tồn nguồn giống ổn định cung cấp cho sản xuất;

- Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể các cấp (giống trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000

ml, giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít) để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp;

- Nghiên cứu xây dựng qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng

hợp sử dụng giống dạng dịch thể, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn;

- Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ thành phẩm, đánh giá một số hoạt tính sinh học của hợp chất này

Kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn như sau:

- Ý nghĩa khoa học:

+ Đánh giá một số đặc tính sinh học và đưa ra một số kỹ thuật tuyển chọn, phân lập, nhân giống, nuôi trồng nấm Đầu khỉ là cơ sở cho việc định hướng tuyển chọn nguồn giống nấm dược liệu mới phù hợp để triển khai sản xuất đại trà trong điều kiện môi trường sinh thái của nước ta

+ Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể

để nuôi trồng nấm Đầu khỉ góp phần làm thay đổi phương thức nhân giống nấm, sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm theo định hướng công nghiệp, áp dụng công nghệ sinh học vào sản xuất để dần thay thế phương pháp nhân giống nấm truyền thống (nhân giống trên

cơ chất rắn như mùn cưa, thóc, đậu tương, đỗ xanh, kê, que gỗ…); đây là phương pháp nhân giống mới đang được các nước có ngành sản xuất nấm phát triển quan tâm nghiên cứu, ứng dụng do phương pháp nhân giống này có rất nhiều ưu điểm so với phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn

+ Đưa ra qui trình tách chiết polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm Đầu khỉ nhằm khẳng định giá trị dược liệu của loại nấm này, kết quả nghiên cứu của luận án là tiền

đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực sản xuất các thực phẩm chức năng từ nấm dược liệu phục vụ nền y học hiện đại, nâng cao sức khỏe cộng đồng

- Ý nghĩa thực tiễn:

+ Kết quả của luận án phù hợp với định hướng chính sách phát triển ngành nông nghiệp công nghệ cao, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất nông nghiệp nhằm tạo ra nguồn sản phẩm hàng hoá ổn định, thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp đặc biệt là tại các vùng nông thôn;

+ Kết quả của luận án là cơ sở thúc đẩy sự phát triển nghề trồng nấm ở Việt Nam, góp phần xúc tiến quá trình tuần hoàn sinh học có ích trong nông nghiệp (tận dụng phế thải

từ nông, lâm nghiệp có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường) đồng thời tạo nên nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và có giá trị dược liệu, giá trị kinh tế cao

Những đóng góp mới của Luận án:

Công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm không thực sự là công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt Nam hiện nay thì đây thực sự là hướng mới cần được ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm từng bước thay đổi phương thức sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm, mang lại hiệu quả kinh tế cao theo hướng sản xuất qui mô công nghiệp, dần dần đưa máy móc vào sản xuất nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích người lao động cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương phẩm một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm Hơn nữa việc

áp dụng công nghệ mới vào sản xuất sẽ tạo ra một khối lượng lớn các sản phẩm nấm phục

vụ cho tiêu dùng và cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm chức năng; Vậy những đóng góp mới của luận án là:

- Đã tuyển chọn được chủng nấm Đầu khỉ có khả năng phát triển tốt trong điều kiện nuôi trồng ở Việt Nam, hoàn thiện phương pháp phân lập lại chủng nấm này có cơ sở để bảo quản và sử dụng lâu dài;

- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể từ quy mô phòng thí

nghiệm đến quy mô 120 lít để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ H erinaceus trên

nguồn cơ chất tổng hợp, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với giống nấm dạng rắn;

- Đưa ra được qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống dạng dịch thể

- Đã tách chiết và bước đầu nghiên cứu tác dụng của polysaccharide từ nấm Đầu khỉ bao gồm: hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy invitro, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy trên thạch mềm, kiểm tra độ an toàn và khả năng bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm

Luận án được thực hiện tại:

- Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm -Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội

- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng nấm dược liệu

1.1.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm dược liệu

Hiện nay, nghề trồng nấm ăn – nấm dược liệu phát triển ở mọi Châu lục; có gần 80 nước nuôi trồng các loại nấm Mỡ, nấm Hương, nấm Sò, Mộc nhĩ … trong đó ở các nước công nghiệp phát triển như Mỹ, Đức, Pháp, Nhật Bản,… đã nuôi trồng nhiều loại nấm và lượng tiêu dùng hàng năm cũng rất lớn, qui mô sản xuất nấm đã được cơ giới hoá từ khâu sử

lý nguyên liệu đến thu hái; năng suất nấm tươi trung bình đạt 45 - 50% so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu [16] Thị trường tiêu thụ nấm ăn lớn nhất hiện nay là Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan và các nước Châu Âu Mức tiêu thụ bình quân tính theo đầu người hàng năm ở Châu Âu, Châu Mỹ là 2 - 3kg/người/năm; Đức, Nhật Bản là khoảng 4kg/người/năm [4]

Các nước có công nghệ nuôi trồng nấm dược liệu phát triển rất chú ý tới việc nghiên cứu, chọn tạo theo nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra các giống nấm có giá trị dinh dưỡng, giá trị dược học và giá trị kinh tế cao để đưa vào sản xuất Các thành tựu khoa học kỹ thuật trong việc chọn tạo giống nấm đã tạo ra sự đa dạng các chủng loại nấm, nhiều giống nấm có năng suất cao, phẩm chất tốt, có tính chống chịu và thích nghi cao với điều kiện môi trường [25]

Nghiên cứu và công nghệ sản xuất nấm ăn trên thế giới ngày càng phát triển mạnh

và đã trở thành ngành công nghiệp thực phẩm thực thụ Hiện nay các nước Tây Âu như Anh, Pháp, Bỉ, Hà Lan… là các nước đi đầu trong lĩnh vực nuôi trồng, chọn tạo giống nấm, trồng nấm theo phương pháp công nghiệp, cơ giới hoá từ khâu xử lý đến thu hái và chế biến sản phẩm Các nước và các vùng lãnh thổ như Đài Loan, Indonesia, Singapore, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, nghề trồng nấm phát triển theo mô hình trang trại vừa

và nhỏ Ước tính chỉ riêng năm 2004 sản lượng nấm ăn trên thế giới đã đạt trên 10 triệu tấn nấm tươi [70]

Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới (tấn x 1000) [70]

Số lượng các nước trồng nấm cũng đang phát triển với tốc độ nhanh: năm 1939 toàn thế giới chỉ có 10 nước sản xuất nấm ăn, đến năm 1995 đã có trên 100 nước; Theo phân tích tốc độ phát triển tổng sản lượng nấm trên thế giới là trên 13% [2]; Với xu thế ngày càng phát triển về qui mô sản xuất, phương thức sản xuất, nguồn nguyên liệu sản xuất, loại hình sản phẩm và chủng loại sản phẩm cũng ngày càng đa dạng

Trung Quốc được đánh giá là một trong những nước có tổng sản lượng nấm cũng như mức độ tăng trưởng lớn nhất thế giới Theo số liệu thống kê của hội nấm ăn Trung Quốc, tính riêng trong năm 2011 tổng sản lượng nấm của Trung Quốc là 25,71 triệu tấn, chiếm khoảng 60% tổng sản lượng nấm ăn trên thế giới, mỗi năm Trung Quốc xuất khẩu hàng triệu tấn nấm sang các nước phát triển thu về nguồn ngoại tệ hàng tỷ đô la; sản lượng suất nấm ăn – nấm dược liệu của Trung Quốc liên tục tăng mạnh, trung bình mỗi năm tăng 1,58 triệu tấn [70, 73]

Hiệu quả kinh tế thu được từ việc nuôi trồng nấm so với các cây nông nghiệp chủ đạo khác cũng được phân tích đánh giá, kết quả cho thấy hiệu quả thu được từ việc canh tác nấm là cao hơn hẳn so với một số cây nông nghiệp khác;

Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng một đơn vị

diện tích (1 mẫu) trong một năm; đơn vị: Nhân dân tệ [73]

Theo sự đánh giá của các chuyên gia Trung Quốc thì nấm ăn có giá trị sản lượng ròng là 28.500 nhân dân tệ trong một mẫu (1 hecta bằng 15 mẫu) canh tác/ năm Giá trị sản lượng gấp 3,8 lần so với cà chua trồng trong nhà kính là 7.500 nhân dân tệ trong cùng một khu vực, gấp 29,4 lần so với bông (970 nhân dân tệ), gấp 53,8 lần so với ngô (530 nhân dân tệ), gấp 67,1 lần so với lúa mì (425 nhân dân tệ) [73]

Việt Nam bắt đầu nghiên cứu và sản xuất nấm từ những năm 1970 [11, 16] Trải qua nhiều thăng trầm, đến nay ở một số địa phương việc sản xuất nấm đã tạo ra nhiều công

ăn, việc làm, tận dụng được thời gian nông nhàn và đem lại nguồn thu đáng kể cho nông dân Mặc dù vậy trên thực tế việc sản xuất, chế biến và tiêu thụ nấm ăn - nấm dược liệu chủ yếu mới chỉ phát triển ở quy mô nhỏ, phân tán, sản phẩm nấm tiêu thụ trên thị trường nội địa là chính, chưa tương xứng với tiềm năng và giá trị vốn có của nó Trong những

năm đầu của thế kỷ 21 (từ 2000 - 2009), có sự quan tâm chỉ đạo và định hướng phát triển nghề trồng nấm của Bộ Nông nghiệp & PTNT, Bộ Khoa học và Công nghệ, các cơ quan nghiên cứu khoa học như Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp; Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội,… đã đi sâu nghiên cứu và phát triển mở rộng nghề trồng nấm [4]; Đến năm 2009 cả nước sản xuất được khoảng 250.000 tấn nấm các loại Mỗi năm tổng kim ngạch xuất khẩu Mộc nhĩ và nấm Rơm là chủ yếu đạt khoảng 60 triệu USD [4] Cho đến nay, hầu hết các tỉnh trong cả nước hiện nay đều

đã bắt đầu phát triển nghề sản xuất nấm với nhiều quy mô khác nhau; Chiếm đa số là các

hộ sản xuất từ 1,0 đến 6,0 tấn nguyên liệu/ hộ/ năm; Các hộ này chủ yếu sử dụng phương thức sản xuất thủ công, tận dụng các thiết bị tự chế, không đồng bộ nên năng suất nấm thấp, giá thành sản phẩm cao và việc chế biến, tiêu thụ còn hạn chế [4]

Bên cạnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học theo phương pháp lên men lỏng để nhân giống nấm ăn - nấm dược liệu ở dạng dịch thể cũng đã có một số đơn vị bước đầu quan tâm nghiên cứu thăm dò như:

- Trung tâm nghiên cứu nấm ăn trường Đại học tổng hợp Hà Nội;

- Khoa Sinh học - Đại học Tổng hợp Hà Nội;

- Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp;

Sản lượng nấm ở Việt Nam (2011): Việt Nam đang nuôi trồng trên 16 loại nấm: ở phía Nam chủ yếu là nấm Rơm, nấm Mộc nhĩ; ở phía Bắc là nấm Sò, nấm Mỡ, nấm Hương, nấm Linh chi… Theo số liệu thống kê sản lượng nấm ăn – nấm dược liệu các loại của cả nước năm 2011 đạt khoảng 250.000 tấn [4] Trong đó theo thứ tự là:

Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011

(Đơn vị: tấn) [4]

- Thị trường tiêu thụ trong nước chủ yếu là tiêu thụ nấm tươi, nấm phơi sấy khô Thị trường xuất khẩu chủ yếu là xuất khẩu nấm nguyên liệu dưới dạng nấm Mỡ muối, nấm Rơm muối Kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 90 triệu USD / năm [4]

- Các vùng sản xuất nấm chủ yếu [4]:

+ Nấm Rơm (Volvariella volvacea): trồng chủ yếu ở các tỉnh miền tây và Đông

Nam bộ (Đồng Tháp, Sóc Trăng, Trà Vinh, Cần thơ, Đồng Nai…) chiếm 90% sản lượng nấm Rơm trong cả nước

+ Mộc nhĩ (Auricula spp): trồng tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ

(Đồng Nai, Lâm Đồng, Bình Phước…) chiếm 70% tổng sản lượng Mộc nhĩ trong cả nước

+ Nấm Mỡ (Agaricus bisporus), nấm Sò trắng (Pleurotus florida), nấm Hương (Lentinula edodes) chủ yếu trồng ở các tỉnh Miền Bắc, mỗi năm đạt khoảng 30.000 tấn

+ Nấm dược liệu: Linh chi (Ganoderma lucium), nấm Vân chi (Trametes

versicolor), nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr Pers.) mới được trồng ở một

số tỉnh, thành phố (Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Lâm Đồng)

* Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng giống nấm dạng dịch thể trong nuôi trồng nấm

Hiện nay, việc nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học nói chung và công nghệ sinh học trong nông nghiệp nói riêng đang là một trong các vấn đề được nhiều nước trên thế giới rất quan tâm Áp dụng công nghệ lên men lỏng trên qui mô công nghiệp nhằm tạo

ra các sản phẩm y học, thực phẩm (tận thu sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất của các loài cây thuốc, nhân sâm, nấm dược liệu…, để sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh hoặc sản xuất thuốc kháng sinh…), đồng thời phương pháp này cũng được nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ nhân giống nấm ăn-nấm dược liệu nhằm rút ngắn thời gian, tiết kiệm diện tích và kinh phí trong sản xuất nấm

Giống nấm dịch thể là loại giống được nuôi dưỡng trong môi trường lỏng, đảm bảo các điều kiện tối ưu về dinh dưỡng, nhiệt độ, độ thông thoáng, thời gian nuôi, khiến sợi nấm sinh trưởng mạnh trong môi trường dịch thể tầng sâu [30] Công nghệ này cho phép thu được một lượng lớn sinh khối sợi nấm để làm giống cấp 1, giống cấp 2, đồng thời có thể trực tiếp làm giống nuôi trồng (giống cấp 3); công nghệ trên còn được áp dụng trong việc tách chiết sinh khối sợi nấm dùng để sản xuất thuốc, gia vị, đồ uống… trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm Phương pháp lên men nuôi dưỡng tầng sâu (nhân giống dạng dịch thể) được ứng dụng để sản xuất các giống nấm ăn như: nấm Hương

(Lentinula edodes), nấm Sò tím (Pleurotus ostreatus), Kim châm (Flammulina velutipes),

nấm Rơm (Volvariella volvacea), Mộc nhĩ đen (Auricularia auricula), nấm Mỡ (Agaricus

bisporus), Trà tân (Agrocyber aegerita), Linh chi (Ganoderma lucidum)… [59]

Kỹ thuật nhân giống nấm lớn dạng dịch thể khởi nguồn từ nước Mỹ, theo báo cáo năm 1947, H Humfeld khi tiến hành lên men tầng sâu giống nấm Mỡ đã thu được lượng sinh khối sợi nấm lớn, từ đó phát triển mạnh kỹ thuật sản xuất giống nấm ăn dạng dịch thể tại các khu vực lân cận [30]

Trong những năm gần đây, Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Đức là những nước có ngành công nghiệp sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu rất phát triển; đặc biệt có những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu sử dụng công nghệ nhân giống nấm lớn thuần khiết trong môi trường dịch thể Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, công nghệ nhân giống nấm lớn trong môi trường dịch thể ngày càng được hoàn thiện và được xây dựng thành quy trình chuẩn, ứng dụng khá phổ biến ở một số nước có ngành

công nghiệp nuôi trồng nấm phát triển Hiện nay, có nhiều quy trình nhân giống nấm lớn dạng dịch thể khác nhau phụ thuộc vào quy mô sản xuất, điều kiện kinh tế xã hội và trình

độ công nghệ của từng nước; Việc sử dụng phương pháp nhân giống dạng dịch thể để sản xuất giống nấm ăn và nấm dược liệu đã đạt được thành công với hơn 50 giống nấm khác

nhau như: nấm Mỡ (Agaricus bisporus), nấm Sò tím (Pleurotus ostreatus), nấm Hương

(Lentinula edodes), Kim châm (Flammulina velutipes), nấm Sò vua (Pleurotus eryngii),

Linh chi (Ganoderma lucidum), Mộc nhĩ đen (Auricularia auricula), nấm Trân châu

(Agrocyber aegerita)… Từ kết quả thử nghiệm tại các phòng thí nghiệm lớn và nhỏ cho

thấy, đại đa số hệ sợi nấm các loại đều phát triển tốt trong điều kiện môi trường dịch thể tích hợp, chất lượng giống nấm đều đạt tiêu chuẩn

d Máy cấy giống tự động e Nhà nuôi sợi f Sợi nấm lan kín toàn bộ chai nguyên liệu

Hình 1.4: Một số hình ảnh mô tả các công đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống nấm dạng dịch thể ở một số

công ty Hàn Quốc (Nguồn: Cồ Thị Thùy Vân, 2013)

* Triển vọng của giống nấm dịch thể

Nghiên cứu và sản xuất giống nấm dạng dịch thể trải qua nhiều năm không ngừng phát triển đã có được những thành tựu bước đầu; Phổ biến và ứng dụng nhân giống nấm dịch thể qui mô công nghiệp hóa để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu mang lại hiệu quả rõ rệt vì có thể giảm giá thành sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm Giống nấm dạng dịch thể cho ưu thế rõ rệt so với giống thể rắn (giống trên gỗ, mùn cưa, hạt ), đối với các đơn vị sản xuất giống nấm, ứng dụng kết hợp “giống rắn – lỏng” trong sản xuất giống nấm

ăn không những có thể phát huy thế mạnh của giống dịch thể như rút ngắn thời gian sinh trưởng, giá thành sản xuất thấp, độ thuần cao, chất lượng tốt, tỷ lệ nhiễm thấp mà còn thích hợp cho phát triển sản xuất giống nuôi trồng nấm theo quy mô công nghiệp… Tất cả những đặc điểm trên có ý nghĩa thực tế trong việc nâng cao chất lượng giống cũng như tăng tính cạnh tranh cho đơn vị, cơ quan sản xuất giống nấm

Ở Việt Nam, công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm cũng đã bắt đầu được quan tâm nghiên cứu, ứng dụng; Với những yêu cầu từ thực tiễn phát triển nghề trồng nấm ở nước ta hiện nay, chất lượng và số lượng giống nấm

có vai trò đặc biệt quan trọng quyết định năng xuất, chất lượng nấm thương phẩm; chất lượng giống nấm cũng là một trong những nhân tố quyết định việc thành bại trong quá trình nuôi trồng của người sản xuất Nếu sử dụng các giống nấm được nghiên cứu kiểm định kỹ, có chất lượng cao thì năng suất nuôi trồng cao, hiệu quả kinh tế cũng tăng cao; ngược lại khi sử dụng các giống nấm không rõ nguồn gốc hoặc giống không đủ tiêu chuẩn

dễ dẫn đến hiệu quả sản xuất kém Trong những năm qua Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật đã bước đầu nghiên cứu, tuyển chọn và xây dựng các quy trình công nghệ nhân giống, nuôi trồng nấm ăn- nấm dược liệu xong mới chỉ hoàn thiện được công nghệ nhân giống nấm trên cơ chất rắn Từ năm 2009 cho đến nay, Trung tâm đã tiến hành nghiên cứu nhân giống nấm dạng dịch thể qui mô thí nghiệm (200ml đến 100lít) thử nghiệm trên một

số giống: nấm mỡ, nấm Sò, nấm Linh chi, nấm Kim châm kết quả cho thấy thời gian nuôi giống ngắn hơn so với công nghệ nhân giống truyền thống, xong tỉ lệ nhiễm bệnh vẫn còn cao (chiếm trên 30%), khả năng ra quả thể là 100% Các nghiên cứu này mới dừng lại

ở mức độ thăm dò và những kết quả bước đầu vẫn chưa được áp dụng vào việc sản xuất giống và nuôi trồng nấm ăn - nấm dược liệu

1.1.2 Tình hình nghiên cứu, sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng

Nấm dược liệu không còn là khái niệm mới mẻ đối với hầu hết mọi người, trên thực tế, nó đã tồn tại và được sử dụng từ hàng ngàn năm nay ở nhiều Quốc gia khác nhau trên thế giới nhằm tăng cường tuổi thọ và sức khỏe cộng đồng; Trên thế giới có khoảng 25 nghìn loại nấm trong đó có gần 300 chủng có giá trị dược liệu, nhưng hiện nay con người mới thực sự dùng làm thuốc chỉ mới 20 - 30 chủng nấm [16, 19, 26] Nấm được biết đến

với công dụng làm thuốc lâu đời nhất phải kể đến là Ganoderma lucidum, ở Trung Quốc

có tên Ling zhi, trong tiếng Nhật là Mannentake, ở Việt Nam gọi là nấm Linh chi [11,16] Nấm dược liệu chủ yếu được sử dụng làm thuốc theo phong tục dân gian trong các bài

thuốc đông y; Trung Quốc là nước dùng nấm làm thuốc nhiều nhất, gồm các loại như Linh chi, Phục linh, Trư linh, Lôi hoàn, Mã bột …[11, 8]; Ngoài ra, với hướng nghiên cứu dinh dưỡng thực phẩm trị liệu để phòng và hỗ trợ điều trị thì đa số các loại nấm dược liệu đều ít nhiều mang lại tác dụng khi thử nghiệm trên người và động vật

Trong thành phần của nấm dược liệu có hàng ngàn hợp chất trong đó hầu hết là các chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe của con người, bên cạnh đó trong từng loại nấm lại có một số hợp chất đặc biệt chỉ hiện diện trong từng loài nấm [21, 23, 26, 29] Hợp chất trong nấm được quan tâm nhiều nhất hiện nay là polysaccharide, cụ thể hơn beta-glucan (1,3/1,6); Beta-glucan đã được nghiên cứu, thử nghiệm rộng rãi và người ta đã chứng minh rằng chúng có khả năng kích thích và tăng cường hệ thống miễn dịch của con người Bên cạnh thành phần chính có tác dụng tăng cường miễn dịch, nấm có khả năng sinh ra hàng loạt các chất có khả năng kháng u, hoạt tính chống oxy hóa, tính kháng các vi khuẩn và

nấm gây bệnh cho người và động vật, hoạt tính kháng virut [19, 38, 39, 51]

* Polysaccaride: là các gluxit phức có phân tử rất lớn gồm nhiều đơn vị

monosaccharide (như glucose, xylose và galactose) liên kết với nhau tạo nên Polysaccharide không có vị ngọt như monosaccharide hay disaccharide, không tan trong nước mà chỉ tạo dung dịch keo; Đây là nhóm chất hữu cơ phổ biến và có khối lượng lớn nhất trên trái đất Polysaccharide rất đa dạng về chủng loại Trong cơ thể sinh vật có rất nhiều loại polysaccharide khác nhau, trong đó phổ biến nhất là tinh bột, glycogen, cellulose Chúng được coi là các chất có hoạt tính sinh học đang thu hút được nhiều sự chú

ý khai thác sử dụng

* Các chức năng chính của polysaccharide

- Là nguồn năng lượng dự trữ của tế bào và cơ thể

- Cấu tạo nên tế bào và các bộ phận của cơ thể

- Polysaccharide liên kết với protein tạo nên các phân tử glycoprotein là những bộ

phận cấu tạo nên các thành phần khác nhau của tế bào

* β - glucan (beta – glucan): β - glucan là một polysaccharide được cấu thành từ

các monosaccharide (là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D - glucose gắn với nhau qua liên kết β – glycoside; Nhóm các phân tử β - glucan được phân biệt dựa vào phân tử khối, độ hòa tan, độ nhớt và cấu trúc không gian 3 chiều

Các hợp chất này thường tồn tại dưới dạng phổ biến là cellulose của thực vật, vỏ cám của hạt ngũ cốc, thành tế bào của nấm men, nấm lớn và vi khuẩn Một số loại β -glucan được sử dụng như chất dinh dưỡng ở người như hợp chất tạo mịn và chất xơ hòa tan, tuy nhiên lại có thể bị biến đổi trong trong quá trình đun sôi

Tùy theo liên kết của các monosaccharide trong chuỗi mà hình thành nên những hợp chất với tên gọi khác nhau như là: agar (β-1,3-1,4-glucan), fucoidan (β-1,3-glucan), laminarin (β-1,3-1,6-glucan), alginate (β-1,4-glucan), zymosan (β-1,3-glucan), chrysolaminarin (β-1,3-1,6-glucan), carrageenan (β-1,3-1,4-glucan)

Hình 1.5: Liên kết β -1, 3 và β -1, 6 trong chuỗi polysaccharide

Agar, carrageenan được trích ly chủ yếu từ các loài rong biển thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta), trong khi fucoidan, laminarin, alginate lại dồi dào trong các loài thuộc ngành tảo nâu (Phaeophyta) Chrysolaminarin được trích ly từ vi tảo và zymosan hiện nay

được trích ly chủ yếu từ nấm men Saccharomyces cerevisiae Trong tự nhiên các dạng β -

glucan cũng được tìm thấy trong vách tế bào của nấm, vi khuẩn, yến mạch và ngũ cốc, Giữa các dạng β - glucan khác nhau, bản chất cũng khác nhau Fucoidan chứa các phân tử đường fucose, laminarin, chrysolaminarin được hợp thành chủ yếu là glucose Alginate chứa các đường mannose và glucose Trong khi đó carrageenan lại chứa đường dạng galactose và cũng được chia thành nhiều dạng như là kappa (k), lambda (λ), Iota (i) β-glucan là một khái niệm rất rộng tùy theo vị trí liên kết giữa các monosaccharide cũng như

là tỉ lệ mà hình thành những hợp chất khác nhau vì vậy, về mặt cấu trúc cũng như là đặc tính sinh hóa học hiện nay vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ

Nấm men và nấm lớn, đặc biệt là nấm dược liệu hấp thụ các β - glucan cho khả năng thích nghi với quá trình đề kháng Các nghiên cứu đã cho thấy dạng hợp chất không hòa tan (1,3 - 1,6) β - glucan có hoạt tính sinh học cao hơn dạng (1,3 - 1,4) β - glucan Sự khác nhau giữa liên kết β - glucan và cấu tạo hóa học chủ yếu là do độ hòa tan, phản ứng

và hoạt tính sinh học

- Nguồn β - glucan trong tự nhiên: một trong những nguồn phổ biến chứa β (1, 3) D -

glucans được thu nhận từ thành tế báo của nấm men Sacchromyces cerevisiae Bên cạnh

đó, β (1, 3) (1, 4) - glucans cũng được chiết xuất từ vỏ cám của hạt yến mạch và lúa mạch, một ít từ lúa mạch đen và lúa mì Các hợp chất β (1, 3) - glucan từ nấm men thường có thể hòa tan Các chất được chiết xuất từ hạt thì bao gồm loại hòa tan và không hòa tan Các nguồn khác bao gồm một số loại tảo biển, và một số loài nấm như Reishi, Shiitake, Maitake…

- Tính chất hóa học của β - glucan

β - glucan là chuỗi của các liên phân tử đường D - glucose tạo nên bởi liên kết loại β

- glycoside Vòng 6 D - glucose có thể gắn với phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D - glucose Một vài hợp chất β - Glucan lại có cấu tạo lập lại của cấu trúc vòng D - glucose gắn tại một vị trí đặc biệt

Tuy nhiên, β - glucan có thể khác nhiều so với phân tử như tinh bột Ví dụ, một phân

tử β - glucan có thể chứa cấu trúc lặp lại của các đơn nguyên D - glucose gắn với nhau qua liên kết β - glycoside tại một vị trí như tinh bột, nhưng có nhánh glucose gắn vào vị trí khác trên chuỗi D - glucose Các chuỗi phân nhỏ này có thể tạo thành nhánh của trục chính

β - glucan (trong trường hợp của tinh bột, trục chính có thể là chuỗi D - glucose gắn tại vị trí 1,4) tại vị trí khác giống như vị trí 3, 6 Ngoài ra, các chuỗi này có thể gắn kết với một phân tử loại khác, chẳng hạn như protein Ví dụ loại β - glucan có protein gắn với nó đó là Poly saccharide-K

Hình thức phổ biến nhất của β - glucan đó là chứa các đơn nguyên D - glucose với các liên kết 1, 3 và với chuỗi D - glucose gắn vào vị trí 1, 6 Các loại này tạo thành β - glucan 1, 3 /1, 6 Một vài nhà nghiên cứu cho rằng tần suất, vị trí và chiều dài của chuỗi hơn là trục chính của các β - glucan quyết định hoạt tính đề kháng

Một sự biến đổi khác đó là một vài hợp chất này tồn tại dưới dạng chuỗi sợi đơn, trong khi trục chính của những β (1, 3) - glucan khác tồn tại ở dạng các chuỗi sợi đôi hoặc sợi ba Trong một vài trường hợp, các protein gắn vào trục β (1, 3) - glucan cũng có thể tạo nên hoạt tính kháng thể Mặc dù các hợp chất này có tiềm năng để phát triển hệ thống kháng thể, tuy nhiên đó chỉ là những nghiên cứu sơ khai, và có nhiều ý kiến khác nhau về trọng lượng phân tử, hình dạng, cấu trúc và loại β (1, 3) - glucan nào sẽ tạo ra hoạt tính sinh học mạnh nhất

- Công dụng + Beta glucan và hệ thống miễn dịch Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh β - glucan có khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của cơ thể, hệ thống miễn dịch được tăng cường đóng vai trò quan trọng giúp con người chống lại bệnh tật Khả năng tăng cường miễn dịch của β - glucan thông qua việc kích hoạt tế bào miễn dịch Macrophage, NK - Cells, T-Cells, B - Cell bao gồm cả Cytokines và bổ thể Các tế bào này đóng vai trò quan trọng trong việc chống các yếu tố ngoại lai xâm nhập cơ thể như vi khuẩn, virut , các tế bào ung thư

+ β - glucan và bệnh ung thư Nhờ tác dụng kích hoạt hệ miễn dịch của cơ thể, β - glucan có vai trò khá quan trọng trong việc giúp hệ miễn dịch của cơ thể chống lại các bệnh ung thư Các nước trên thế giới, đặc biệt ở Nhật Bản đã bắt đầu sử dụng β - glucan để hỗ trợ điều trị ung thư từ năm 1980, hàng trăm nghiên cứu ở các cơ sở nghiên cứu danh tiếng như Haward Medical School, Tulane University, Baylor Colledge of Medicine U.S Armed Force… Mỹ, cho thấy β - glucan có tác dụng chống khối u, ức chế các khối u di căn, nhiều nghiên cứu cho thấy β - glucan có tác dụng nâng cao hiệu quả của hóa trị liệu, tăng đáng kể sự phát triển và kích hoạt các monocytes trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư Tác dụng tích cực của

β - glucan lên các tế bào ung thư thông qua cơ chế kích hoạt hệ miễn dịch, một trong những tác dụng đó là kích hoạt và làm tăng số lượng của các tế bào miễn dịch của cơ thể gọi là Macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên NK Cell Macrophage là hàng rào miễn dịch đầu tiên bảo vệ và chống lại bất cứ yếu tố ngoại lai nào xâm nhập cơ thể, như vi khuẩn,

virus kể cả các tế bào ung thư NK Cell là một tế bào miễn dịch đặc hiệu có chức năng nhận biết và tiêu diệt tế bào ung thư Sự hợp tác của 2 loại tế bào miễn dịch trên giúp bảo

vệ toàn vẹn cho cơ thể chống lại bệnh tật β - glucan bám vào bề mặt của Macrophage và tế bào sát thủ tự nhiên NK Cell, tương tác với các phân tử này tạo ra sự kích hoạt miễn dịch, hình thành các “sát thủ tiêu diệt khối u”, các “tế bào sát thủ tiêu diệt khối u” này lưu thông trong cơ thể tích cực tìm kiếm tế bào ung thư, khi tiếp cận các các tế bào ung thư chúng sẽ tiêu diệt các tế bào này theo một cách đặc hiệu đảm bảo các tế bào lành của cơ thể nguyên vẹn và không bị phương hại

β - glucan không chỉ kích hoạt các tế bào của hệ miễn dịch để đảm bảo cho chúng hoạt động ở mức tối ưu, mà còn làm tăng số lượng của các tế bào này Các tế bào miễn dịch của cơ thể đa phần được sản sinh ra tế bào tủy xương, sự sản xuất ra các tế bào này đều đặn, liên tục, nhưng có giới hạn Một lần nữa, β - glucan đến “tiếp ứng”, nó kích thích làm gia tăng các tế bào sản sinh tế bào miễn dịch ở tủy xương, làm gia tăng “đội quân tế bào miễn dịch” bảo vệ cơ thể, đi vào máu, các hạch, các tổ chức trong khắp cơ thể

+ β - glucan phòng chống nhiễm khuẩn Viện Alpha Technologies đã tiến hành một loạt thí nghiệm lâm sàng trên người để đánh giá tác động điều trị của β - glucan với các bệnh nhân có nguy cơ cao trong nhiễm trùng phẫu thuật, các dữ liệu từ thử nghiệm lâm sàng cho thấy sử dụng β - glucan làm giảm

sử dụng kháng sinh tiêm tĩnh mạch Các nhà khoa học kết luận β - glucan thúc đẩy thực bào giết chết các vi khuẩn gây bệnh Ngoài ra các nghiên cứu cũng cho thấy β - glucan hiệp đồng làm tăng tác dụng của kháng sinh, các tác dụng này được giải thích nhờ tác dụng kích hoạt và bảo vệ hệ miễn dịch của β - glucan

+ β - glucan chống phơi nhiễm phóng xạ Các nghiên cứu cho thấy β - glucan nâng cao liều gây chết của động vật với bức xạ; nghiên cứu in vitro cho thấy β - glucan có thể tăng bạch cầu hạt và megakaryocyte hình thành thuộc tế bào gốc máu β - glucan là thuốc bảo vệ cho hóa trị, xạ trị và trường hợp hạt nhân, đặc biệt β - glucan có thể sử dụng cho cả điều trị và dự phòng phơi nhiễm phóng xạ

+ β - glucan và hệ hô hấp, tai mũi họng Nhờ tác dụng tăng cường miễn dịch mạnh, β - glucan có thể tấn công sớm vào các

tế bào ngoại lai, trong đó có các loại vi khuẩn virut , β - glucan cải thiện đáng kể các trường hợp bệnh nhân bị các nhiễm khuẩn đường hô hấp, β - glucan làm giảm đáng kể các triệu chứng nhiễm trùng đường hô hấp như nghẹt mũi, sổ mũi, đau họng Do vậy bổ sung β

- glucan giúp cơ thể phòng ngừa, ngăn chặn các bệnh đường hô hấp thông qua tăng cường sức đề kháng tự nhiên của cơ thể

+ β - glucan giảm nguy cơ sốc nhiễm trùng Một trong những cơ chế về khả năng tăng cường miễn dịch của β - glucan là khả năng tăng bạch cầu để định vị và tiêu diệt các tế bào lạ bao gồm cả vi khuẩn Nghiên cứu

trên động vật cho thấy β - glucan làm giảm sốc nhiễm trùng bằng cách tiêu diệt vi khuẩn trong máu

+ β - glucan sử dụng trong chữa lành vết thương Hoạt động thực bào đóng vai trò quan trọng trong việc chữa lành vết thương sau phẫu thuật hoặc chấn thương Trong cả hai nghiên cứu trên động vật và trên người có dùng β - glucan làm giảm nguy cơ nhiễm trùng, giảm tỷ lệ tử vong và tăng khả năng làm lành vết thương

+ β - glucan và bệnh mỡ máu, tiểu đường Các loại thực phẩm có chứa β - glucan có tác dụng tăng nhu động ruột, tăng hệ số chuyển đổi thức ăn, cải thiện các vấn đề về đường tiêu hóa Nhiều nghiên cứu cho thấy β - glucan có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh và lipoprotein gan, dẫn đến hạ thấp

xơ vữa động mạch, giảm nguy cơ các bệnh tim mạch nguy hiểm, nghiên cứu cũng cho thấy

β - glucan có khả năng làm hạ đường huyết, giảm thiểu các nguy cơ tim mạch ở bệnh nhân tiểu đường

Một số nấm dược liệu nghiên cứu rộng rãi nhất và được sử dụng ngày nay bao

gồm: Linh Chi Ganoderma lucidum, nấm búp - nấm mặt trời Agaricus blazei, nhộng trùng thảo Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris, nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus, Maitake Grifola frondosa, nấm hương Lentinula edodes, nấm Vân chi Coriolus versicolor hay Trametes versicolor

1.1.2.1 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu

Hiện nay hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất có nguồn gốc thực vật ứng dụng trong phòng ngừa và điều trị một số bệnh của người và động vật tập trung vào các hướng:

- Ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

- Ức chế sự nhân lên của các vi khuẩn, virus gây bệnh và khả năng kháng viêm

- Các hợp chất có khả năng tham gia vào các quá trình sinh hóa hạn chế một số loại bệnh như tiểu đường, ngộ độc hóa chất…

- Các hợp chất chống oxy hóa, hạn chế sự sản sinh các gốc tự do, hạn chế đột biến gene

- Hạn chế tác động tiêu cực của hội chứng mãn kinh ở phụ nữ và phòng tránh các bệnh liên quan đến hội chứng mãn kinh

- Nghiên cứu cấu trúc của các hợp chất có hoạt tính phòng và trị bệnh khởi đầu cho việc tổng hợp các chất mới có hoạt tính tương tự hoặc mạnh hơn hoạt tính của các hợp chất

tự nhiên kết quả là các dược phẩm mới ra đời

Ở nhật bản năm 1969 Ikekawa và các cộng sự là những tác giả đầu tiên có các công

bố về hoạt tính kháng u của các thành phần cơ bản có trong nấm lớn từ họ Polyporaceae và một số họ khác chống lại ung thư thực nghiệm như sarcoma 180 trên chuột [38] Năm

1999 các nhà khoa học Nhật Bản đã tiến hành thí nghiệm trên chuột cũng xác định là các

polysaccaride tách từ Agaricus blazei Murrili (nấm mỡ Blazil) có khả năng hoạt hoá một

cách có ý nghĩa hệ thống miễn dịch, khả năng kháng ung thư và khối u, các polysaccaride này bao gồm (1-6, 1-3, β glucan, 1-6, 1-4 β Glucan, phức hợp polysaccharide-protein, RNA-protein, glucoman) [32]

Trung Quốc, Nga và Hàn Quốc đã sản xuất thành công một số loại thuốc kháng khối u có bản chất là polysaccharide được chiết xuất từ hệ sợi nấm và môi trường nuôi cấy một số loại nấm dược liệu khác nhau như là Shiitake (nấm Hương), Reishi (Linh chi),

Corilous versicolor (Vân chi) [28]

Tiềm năng của việc sử dụng nguồn nguyên liệu là nấm dược liệu để làm thuốc là rất lớn; bằng chứng cho thấy chỉ riêng năm 1999, lợi nhuận từ sản xuất các chế phẩm sinh học từ nấm dược liệu trên thế giới đạt đến 18 tỷ USD xấp xỉ bằng giá trị của việc bán cafe; điều đó chứng tỏ việc đầu tư vào ngành sản xuất, canh tác, chế biến nấm ăn và nấm dược liệu là hướng đi đúng đắn mang lại hiệu quả kinh tế cao

1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta

Từ những năm 2000 trở lại đây việc nghiên cứu về nấm lớn, đặc biệt là nấm dược liệu cũng được các nhà nghiên cứu Việt Nam quan tâm và đã có những kết quả đáng kể Một số nhóm tác giả nghiên cứu về các chất có hoạt tính tách chiết từ nấm như:

Tác giả Nguyễn Thượng Dong và Bùi Thị Bằng (Viện dược liệu) đã có đề tài cấp Nhà nước (2005): “Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của 3 loài nấm Linh chi

Ganoderma applanatum Pers Pat., G lobatum Schw Atk và G lucidum Leyss Fr

Karst., theo hướng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư và thuốc chống lão hóa” Kết quả

đã xác định được các đặc điểm hình thái và đặc điểm hiển vi của 3 loài nấm Linh chi

Ganoderma applanatum Pers Pat., G lobatum Schw Atk và G lucidum Leyss Fr

Karst Giới thiệu đặc điểm hóa học, thử độc tính cấp và nghiên cứu tác dụng hồi phục tổn thương miễn dịch của 3 loài nấm Linh chi Nghiên cứu tác dụng của 3 loài nấm Linh chi trên tế bào ung thư và tác dụng chống lão hóa của 3 loài nấm Linh chi

Tác giả Lê Mai Hương và Cộng sự - Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên có các công trình nghiên cứu về chất có hoạt tính sinh học trong nấm ăn - nấm dược liệu, đặc biệt là các nghiên cứu về polysaccharide tách chiết từ nấm Đầu khỉ, Linh chi, Vân chi [6, 7]

Tác giả Nguyễn Thị Chính (ĐH Quốc gia) đã có một số công trình nghiên cứu

về tác dụng của nấm Linh chi, Đầu khỉ đối với sức khỏe con người; Trong dự án “Phát

triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khoẻ”, (2005), tác giả

đã tuyển chọn phân lập và xác định một số chủng nấm mới nấm nhập nội có giá trị dinh dưỡng cũng như tác dụng dược lý tốt đối với sức khoẻ như nấm Linh chi, nấm Đầu khỉ, nấm Đồng tiền và nấm Hương Đánh giá tác dụng khử gốc oxy tự do chống phóng xạ trung hoà chất độc giảm đau của một số hoạt chất tách chiết từ nấm Xác định một số thành phần của nấm như hàm lượng protein, lượng đường, độc tố vi sinh vật gây độc trên sản phẩm nấm tươi và nấm đã chế biến để bảo đảm tính an toàn khi sử dụng nấm

đối với sức khoẻ con người; Thử ảnh hưởng của các hoạt chất nêu trên đối với động vật thí nghiệm và người bệnh tại cơ sở thực nghiệm và Bệnh viện K [10]

1.2 Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers

1.2.1 Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers

Nấm Đầu khỉ (hay còn gọi là nấm Hầu thủ) có tên khoa học là Hericium erinaceus, ở

Trung Quốc được gọi là Shishigashida, ở Nhật Bản nó được gọi là Yamabushi-take Nấm Đầu khỉ là loại nấm dược liệu quý chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng như các axit amin, đường, lipit, nguyên tố khoáng, vitamin và các chất có hoạt tính sinh học; Hương vị của loại nấm này rất tươi ngon, vị hơi đắng, tính ôn hoà [3, 4, 5, 6, 11, 13, 48]

Nấm Đầu khỉ được tìm thấy vào mùa thu và mùa xuân ở phía Bắc khu vực nhiệt đới; Loại nấm này mọc nhiều trên nhiều loại cây thân gỗ thuộc nhóm sồi, dẻ, các loại cây lá rộng đang sống hoặc đã mục nát, do đó có thể làm chết cây Nấm Đầu khỉ được nuôi trồng lần đầu tiên ở Trung Quốc, sau đó được trồng ở Nhật Bản, các nước Bắc Mỹ và Châu Âu; cho đến nay nó được sử dụng khá phổ biến ở dạng bột khô trong túi lọc với nước sôi như pha trà hay được ngâm trong rượu; nó được coi là một loại thực phẩm bổ dưỡng, tăng lực

và đặc biệt là một loại dược phẩm quí, có giá trị cao trong phòng chống ung thư [8, 11, 16] Nấm Đầu khỉ không chỉ là nguồn dược liệu quí mà còn là loại thực phẩm ngon bổ dưỡng được gọi là “Kiện bảo thực phẩm”; Dược phẩm bào chế từ nấm Đầu khỉ khá phổ biến ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc; Các thử nghiệm về độc tính đã được tiến hành

kỹ lưỡng từ nhiều thập niên qua, kết quả cho thấy cả quả thể lẫn sinh khối sợi đều không

hề có độc tính gì đối với người Về dược lý, nấm Đầu khỉ được chứng minh có tác dụng nâng cao khả năng miễn dịch, phục hồi niêm mạc dạ dày, chữa loét thủng ruột, nâng cao năng lực đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi (điều này lý giải các sản phẩm nước uống tăng lực khá phong phú dùng cho các vận động viên thể thao ở Trung Quốc), chống oxy hóa, chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến tuần hoàn máu, chống lão hóa,

ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư [8, 11]

Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus trong tự nhiên

1.2.2 Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học [16]

Tên khoa học: Hericium erinaceus

Tên tiếng Anh: Monkey head, Mountain hidden mushroom Theo tác giả Trịnh Tam Kiệt (2013) [16], nấm Đầu khỉ thuộc:

Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycetes Bộ: Russulales Họ: Hericiaceae Donk

Chi: Hericium Loài: Hericium erinaceum (Bull.: Fr.) Pers

1.2.3 Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm Đầu khỉ

Quả thể nấm Đầu khỉ thường có dạng hình cầu hoặc hình ellip, đường kính quả thể

5-10 x 5-7cm gồm các múi thịt nấm ghép lại với nhau như bộ óc khỉ, phần thịt nấm mền, xốp, có tua nấm dày đặc, rũ xuống; Quả thể nấm mọc riêng rẽ hoặc mọc thành chùm, mỗi quả nấm tươi trưởng thành nặng trung bình 150 – 170 gam Quả thể khi non có màu trắng đến trắng ngà, thịt màu trắng, khi già nấm ngả sang màu vàng đến vàng sậm, phần tua nấm dài và chuyển sang màu vàng trông như bờm sư tử [8] Các tua nấm chính là lớp bào tầng, dài từ 0,5 – 3 cm, trên bề mặt tua có các đảm màu trắng mang bào tử đảm hình cầu, giữa bào tử có một giọt nội chất tròn

Nấm Đầu khỉ là loại nấm ôn đới chỉ trồng được những vùng khí hậu mát mẻ, quả thể nấm Đầu khỉ có thể hình thành và phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 16 – 20o

C [4, 8], nhiệt độ cao nhất có thể trồng nấm này là 19 – 27o

C [8]; Trong điều kiện tự nhiên nuôi trồng tốt nhất vào mùa thu và mùa xuân Nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ là nguồn phế phụ liệu từ nông, lâm nghiệp giầu xenllulo như: mùn cưa, rơm rạ, bông phế loại… có thể khai thác ở nhiều vùng, nhiều địa phương trong cả nước [3, 4, 8, 9, 11, 12, 13, 14]

Hình 1.7: Hình thái quả thể nấm Đầu khỉ nuôi trồng nhân tạo

1.2.4 Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H erinaceus

1.2.4.1 Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ

Các dẫn liệu kiểm tra về thành phần dinh dưỡng của nấm H erinaceus cho thấy

nấm này là một loại thực phẩm bổ dưỡng, có mức cung cấp nhiệt lượng vừa phải, cân đối

về thành phần dinh dưỡng, giàu khoáng và vitamin Tuy nhiên, ở mỗi điều kiện nuôi cấy hay phương pháp nuôi trồng khác nhau cũng dẫn đến việc thu được các thành phần trong

nấm khác nhau Hàm lượng khoáng trong nấm H erinaceus cũng khá phong phú bao gồm

Fe, Ca, Na, K,…; Các vitamin, đặc biệt B1, B2 có hàm lượng khá cao bao gồm có Niacin,

ít vitamin A; Chưa phát hiện thấy vitamin C Provitamin D có hàm lượng đặc biệt cao

trong nấm H erinaceus khô ở Nhật Bản, có khả năng chuyển thành vitamin D2 khi được chiếu sáng giúp cho hấp thụ và chuyển hóa Canxi, phòng bệnh loãng xương, yếu xương Kết quả so sánh sản phẩm nấm Đầu khỉ ở Cát Lâm (Trung Quốc) và Nagano (Nhật Bản) được thể hiện qua bảng 1.1 dưới đây [8]

Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm Đầu khỉ (trong 100g nấm khô) [8]

Thành phần Nấm ở Cát lâm,

Trung Quốc

Nấm ở Nagano, Nhật bản

Chất tro Prôtêin thô Chất béo thô Chất sợi thô Chất xơ thực phẩm Glucide

Năng lượng

8,87g 29,3 g 4,68 g 7,13 g

- 50,02g

335 Cal

9,01g 27,67 g 4,56 g

- 40,15 g 18,66 g

Vitamin B 2 Vitamin B 6 Vitamin B 12 Vitamin A Niacin Provitamin D

0,69 mg 1,89 mg

-

- 0,01 mg

-

-

3,83 mg 3,14 mg 0,41 mg 0,15 mg

- 16,17 mg 451,4 mg Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ trồng ở Cát Lâm -Trung Quốc và ở Nagano - Nhật Bản được ghi lại qua bảng 1.2 sau đây:

Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ H.erinaceus

Theo phân tích của tác giả Khuất Hữu Trung và Cộng sự - Viện Di truyền Nông nghiệp

(2003) thành phần dinh dưỡng có trong 100g nấm Đầu khỉ được thể hiện ở bảng 1.3 sau:

Bảng 1.3: Hàm lượng một số thành phần hóa sinh của nấm Đầu khỉ [5]

(Đơn vị: mg, tính theo chất lượng khô tuyệt đối)

7 Acid amin 7.15 Leucine 1,18 7.1 Aspartic acid 1,45 7.16 Lysine 1,27

7.2 Glutamic acid 3,39 7.17 Proline 0,36

1.2.4.2 Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho nấm Đầu khỉ

Trong dân gian nấm Đầu khỉ được biết đến với vai trò làm thuốc hơn là vai trò thức

ăn, các bệnh nhân mắc bệnh về rối loạn chức năng gan, thận khi dùng nấm Đầu khỉ tươi,

khô hoặc các sản phẩm chức năng chiết xuất từ loại nấm này có biểu hiện cải thiện bệnh rất

rõ rệt bên cạnh đó loại nấm này còn giúp nâng cao khả năng miễn dịch của cơ thể, phục hồi niêm mạc dạ dày, chữa thủng loét ruột, nâng cao khả năng đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi, chống oxy hoá, chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến việc tuần hoàn máu, chống lão hoá, ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư

Theo sự thống kê các kết quả của rất nhiều nhà nghiên cứu về polysaccharide tách

chiết từ H.erinaceus của Han Z.H và cộng sự (2012) thì polysaccharide tách chiết từ H

erinaceus (HEP) được coi là một loại thuốc truyền thống, thành phần hóa học và khả năng

chống oxy hóa của HEP đã được điều tra Phân tích HPLC cho thấy HEP có cấu tạo gồm: xylose (7,8%), ribose (2,7%), đường (68,4%), arabinose (11,3%), galactose (2,5%) và mannose (5,2%) [33] HEP đã được thử nghiệm trên chuột bằng cách đưa vào thức ăn với liều lượng 300 mg/kg trong 15 ngày Kết quả cho thấy HEP có khả năng làm giảm đáng kể lượng ure trong trong máu (BUN), creatinine trong huyết thanh và tăng nhanh khả năng thanh thải creatinin các cấp; các kết quả thử nghiệm còn cho thấy HEP có khả năng làm giảm đáng kể mức độ peroxy lipid và tăng hoạt động enzym chống oxy hóa ở động vật thực nghiệm [34, 35] Gần đây nấm Đầu khỉ còn được chứng minh là có khả năng chống lại bệnh ung thư [8, 11, 48, 51]

Bảng 1.4: Một số thành phần có hoạt tính sinh học mang lại lợi ích sức khỏe

của H erinaceus [48]

1 Polysaccharide 1.1 β - Dglucans: ví dụ β – 1,3 glucan; β – 1,

6 glucan

Chống ung thư, chống suy giảm miễn dịch, bảo vệ hệ thần kinh và chống oxy hóa

1.2 Α - HEP1 một dị polysaccharide với liên kết (1> 6) – D - Galactopyranosyl

Chống ung thư và tăng cường khả năng miễn dịch

1.3 HEPF3 (một dị polysaccharide, với một penta –saccharide lặp đi lặp lại

Chống ung thư và tăng cường khả năng miễn dịch

2 Endo-polysaccharide Bảo vệ gan và chống oxy hóa

3 Các hợp chất lipid:

+ Hỗn hợp axit palmitic và axit stearic;

+ axit behenic + hỗn hợp axit tetracosanic;

+ 5-α-ergostan-3-một;

+ 5-α-stigmasten-22-3 + 5-α-stigmastan-3

2-hydroxymethyl-5-α-hydroxy-ethyl-γ-+ 4-chloro-3, arabitol;

5-dimethoxybenzoic–O-+ 4-chloro-3, 5-dimethoxybenzoic methyl ester;

+ 4-chloro-3, 5-dimethoxybenzoic;

Tác dụng có lợi sức khỏe, bao gồm cả chống ung thư trên phổ rộng và tăng cường hoạt động miễn dịch

Các nghiên cứu về độc tính từ trước đến nay cho thấy quả thể và hệ sợi nấm

Hericium erinaceus không hề có độc tính đối với con người Theo một số tác giả, trong

nấm Hericium erinaceus có một số thành phần diterpenoit có khả năng kháng các dòng tế

bào ung thư nuôi cấy invitro, trong đó có dòng tế bào HeLa [38, 48]

a Khả năng chống ung thư và điều hòa miễn dịch

Các polysaccharide trong nấm Đầu khỉ có khả năng hoạt hoá miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào Lympho T và Lympho B Trong quá trình điều trị các bệnh viêm gan, viêm phế quản mãn và một số bệnh tim phổi khác, các nhà khoa học Trung Quốc đã chứng minh tác dụng tăng cường miễn dịch của loại nấm này; Loại nấm này cũng có vai trò trong phòng chống mệt mỏi (anti-fatigues), tăng cường sinh lực đối với nam giới [48]

Các polysaccharide như ß-(1-3)-D - glucan được tách chiết từ nấm Đầu khỉ đã chứng tỏ khả năng ức chế sự hoạt động của tế bào ung thư và sự hoạt động của u bướu; Một số polyisoprenepolyol mới được tách chiết từ nấm Đầu khỉ đã được thử nghiệm trên chuột bạch với các khối u biểu bì phổi, bướu Saccôm ác tính 180 cho kết quả rất khả quan [48]

Khả năng chống ung thư và điều hòa miễn dịch đã được chứng minh bởi nhiều nghiên cứu trên động vật và người Theo Wong và cộng sự, điều hòa miễn dịch là một

trong những cơ chế hoạt động chính mang lại khả năng chống ung thư của H erinaceus [71] Các nghiên cứu về khả năng điều hòa miễn dịch và khả năng chống khối u của các polysaccharide chiết xuất từ dịch nuôi hệ sợi nấm H erinaceus trên chuột cho thấy

polysaccharide này có khả năng chống lại sự di căn của khối u ở phổi Các nhà nghiên cứu cũng chỉ ra polysaccharide có khả năng làm tăng cường sự gia tăng của các tế bào T và đại

thực bào [48] Trong nghiên cứu của Kim và cộng sự cho thấy các nội peritoneal chiết xuất

từ quả thể H erinaceus bằng nước nóng (50% ethanol / nước) có kết hợp với sử dụng lò vi

ba có khả năng làm giảm trọng lượng khối u ung thư ruột từ 38 - 41% trong 2 tuần [42, 43, 44] Các chất chiết xuất còn có khả năng làm tăng hoạt động của các tế bào “giết tự nhiên” (Tế bào NK) của lách, khôi phục sản xuất NO và thực bào trong đại thực bào phúc mạc và tăng cường việc sản xuất các cytokine tiền viêm TNF-α, interleukin-1β, và interleukin-6 từ các đại thực bào Các chất chiết xuất cũng có vai trò trong việc làm giảm cyclooxygenase 2

và 5-lipoxy-genase dẫn đến ức chế tân mạch bên trong khối u Hiệu lực của các chất chiết xuất chống lại Tế bào bạch cầu monocytic nhân U937 cũng đã được ghi nhận bởi Kim và

cộng sự [44]

Trong quả thể khi còn non (YF), trong hệ sợi nấm (YM) và trong dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ (YE), người ta đã dùng phương pháp đặc biệt để có được các chế phẩm có tác dụng làm đổi mới tế bào lá lách, tăng cường sản sinh interleukine Với tác dụng làm tăng thực bào các tế bào ung thư với cơ chế hoạt hoá yếu tố gây hoại tử (INF) thì

cả 3 chế phẩm YF, YM, YE đều biểu hiện hoạt tính [54] Trong nấm Đầu khỉ còn có một