ĐỀ TÀI: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sử dụng bã sắn trước và sau lên men thu enzyme để nuôi trồng nấm ăn

Để tiếp nối và giải quyết một số vấn đề cũn lại của đề tài Nguyễn Văn Quyết nhằm ứng dụng trong thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiờn cứu hoàn thiện quy trình sử dụng bã sắn trước v

PHẦN MỞ ĐẦU

Cây sắn (khoai mì) có tên khoa học Manihot esculenta Crantz, thuộc

họ Đại kích (Euphorbiaceae) là cây lương thực được trồng phổ biến ở các

nước nhiệt đới trên thế giới Ở Việt Nam, cây sắn được trồng khắp các tỉnh trung du, miền núi phía Bắc và cao nguyên Nam Bộ Sắn không những là nguồn lương thực, thực phẩm cho người và gia súc mà còn là nguồn nguyên liệu quan trọng có giá trị cho các ngành công nghiệp khác như: dệt, lương thực, dược, chế biến nước giải khát, cồn Với diện tích 277.500 ha và tổng sản lượng 2.211.500 tấn vào năm 1995 có thể nói tiềm năng sản xuất sắn ở nước ta rất lớn Nước ta đó cú hàng chục dự án sản xuất tinh bột sắn với công nghệ hiện đại, công suất từ 200- 500 tấn củ/ ngày và hàng loạt các dự án sẽ được thực hiện trong tương lai [21]

Quá trình chế biến sắn thu tinh bột đã tạo ra một lượng lớn bã sắn phế thải Theo báo cáo của nhiều nhà nghiên cứu [40] thành phần hoá học của bã sắn phơi khô có khoảng 61- 63% tinh bột; 13- 15% cellulose; 1,5- 2,0% protein thô; 0,009% HCN Như vậy, trong bã sắn phế thải cũn một lượng khá lớn tinh bột và cellulose, song các chất dinh dưỡng lại khá nghèo nàn Ở nước ta, một phần nhỏ bã sắn được tái sử dụng cho chăn nuôi lợn, phần lớn vứt

bỏ thành phõn, rỏc gõy ô nhiễm môi trường

Một trong những biện pháp tích cực để giải quyết nạn ô nhiễm môi trường do bã sắn phế thải, là tận dụng nguồn chất thải giàu tinh bột và cellulose này làm cơ chất cho các quá trình chuyển hoá sinh học thành các sản phẩm có giỏ trị như thu protein, các acid amin, kháng sinh và enzyme bằng con đường vi sinh vật để làm thức ăn cho chăn nuôi Tuy nhiên, các quá trình xử lý đó đều tạo ra một lượng bã thải lớn hơn ban đầu, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Chính vì thế, trong những năm gần đây việc nghiên cứu xử lý bã sắn phế thải được nhiều người quan tâm

Với mục đích xử lý triệt để và có hiệu quả hơn lượng bã sắn phế thải trước và sau lên men enzyme, giải quyết nạn ô nhiễm môi trường là sử dụng làm nguyên liệu trồng nấm ăn và nấm dược liệu Hướng nghiên cứu này cũng đã và đang được thử nghiệm ở phòng Công nghệ sinh học – Vi sinh, của trường ĐHSP Hà Nội và đã thu được những kết quả bước đầu Năm

2007, Nguyễn Văn Quyết đã nghiên cứu được một số điều kiện nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu trên loại cơ chất này Tuy nhiên, đề tài của Nguyễn Văn Quyết mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu Để tiếp nối và giải quyết một số vấn đề cũn lại của đề tài Nguyễn Văn Quyết nhằm ứng dụng trong

thực tiễn, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiờn cứu hoàn thiện quy trình sử dụng

bã sắn trước và sau lên men thu enzyme để nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu”

Đề tài nghiên cứu thuộc dự án : “Nghiờn cứu sử dụng phế thải nông nghiệp để sản xuất enzyme vi sinh vật cho chăn nuôi gia súc, gia cầm ở Việt Nam” do SIDA/SAREC tài trợ

Nội dung nghiên cứu của đề tài :

 Phõn tích thành phần các chất dinh dưỡng (đường tổng số, protein tổng số, tinh bột, cellulose), các chất khoáng, các enzyme (amylase, cellulase, protease, xylanase) có trong bã sắn trước khi lên men, sau khi lên men và sau khi trồng nấm

 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình trồng nấm Sò và nấm linh Chi trên

cơ chất là bã sắn trước và sau khi lên men thu enzyme ở quy mô 10 kg -100 kg/mẻ

 Nghiên cứu khả năng ứng dụng bã sinh khối sợi nấm sau khi thu hoạch quả thể làm thức ăn cho gà

Đề tài được tiến hành từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 9 năm 2009 tại Phòng CNSH - Vi sinh và cơ sở trồng nấm của gia đình chú: Nguyễn Văn Ngoạn, Xã Khánh Phú - Huyện Yên Khánh - Tỉnh Ninh Bình

PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tỡnh hình xử lý bã sắn phế thải

Để sản xuất được 50 tấn tinh bột sắn phải cần tới 200 tấn củ sắn Quá trình sản xuất tinh bột sắn thải ra một lượng lớn nước thải và hai loại bã thải:

Loại thứ nhất là bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ, chiếm tỉ trọng ít

và thành phần chủ yếu là cellulose, hemicellulose và cát, sạn Loại này thường được chôn lấp hợp vệ sinh hoặc ủ làm phân bón [21, 33 ]

Loại thứ hai là phần bã cũn lại sau khi tách tinh bột sắn và được gọi là

bã sắn Bã sắn có độ ẩm khoảng 75-85% và lượng tinh bột trong bã sắn chiếm khoảng 50-60% theo khối lượng khô (bảng 1-1), phần nhỏ bã sắn được sử dụng làm thức ăn gia súc, còn phần lớn bị vứt bỏ, gõy ô nhiễm môi trường nghiêm trọng [21]

Thành phần các chất chứa trong bã sắn thải ra từ các cơ sở sản xuất nhỏ cao hơn trong các mẫu bã sắn lấy từ các cơ sở sản xuất lớn cho thấy phương pháp thu chiết tinh bột của các cơ sở sản xuất công nghiệp quy mô lớn hiệu quả hơn Điều đáng lưu ý là thông thường bã sắn chứa 7,5-8,5 mg %HCN

Bảng1-1 Thành phần hoá học của bã sắn phơi khô [40 ]

(tính theo g/100g bã sắn phơi khô)

cơ sở sản xuất Ghildal và Losane (1990) đã xem xét, phõn tích lợi ích, tớnh khả thi của các phương án xử lý bã sắn như sau:

Làm thức ăn cho động vật: Bã sắn sau khi phơi nắng hoặc sấy khô

thường được làm thức ăn cho gia súc, có thể cho ăn trực tiếp hoặc trộn lẫn với các chất dinh dưỡng khác Phương án này ít có hiệu quả kinh tế vỡ giỏ

bó sắn phơi khô trên thị trường rất thấp Ngoài ra, phơi bã sắn cũn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, gõy mựi hôi và ở chừng mực nào đó có thể bị hư hỏng Hơn nữa, phơi bã sắn không thể áp dụng cho các cơ sở sản xuất lớn vì lượng bã sắn thải ra hàng ngày quá lớn [3, 10 ]

Làm phân bón: Ngoài tinh bột và cellulose, bã sắn cũn một ít nitơ,

phospho, kali và các chất khoáng khác nên làm phõn bún rất tốt Nhưng do

chi phí vận chuyển cao nên việc dùng bã sắn làm phõn bún chỉ giới hạn ở khu vực gần nhà máy chế biến Hơn nữa, lượng acid trong bã sắn ảnh hưởng đến chất lượng phõn bún, những chất dễ bay hơi trong bã sắn ảnh hưởng xấu đến môi trương sinh thái, nên ít được quan tõm

Sản xuất xirụ glucose: Đó cú cỏcnghiên cứu sử dụng kỹ thuật acid – enzyme và enzyme – enzyme ở mức độ phù hợp để chuyển được 98-99% tinh bột có trong bã sắn thành sirụ chứa lượng glucose cao (70% lượng đường khử) Căn cứ vào ước tớnh chi phí thì quy trình trên không kinh tế vì chi phí cô đặc sản phẩm thuỷ phõn cao, phải dùng nhiều than hoạt tớnh để khử màu, khó khuấy trộn khối bã sắn dày trong nồi, nên truyền nhiệt không hiệu quả [13 ]

Sản xuất rượu Etylic: Sau khi thuỷ phõn tinh bột có trong bã sắn theo

quy trình acid – enzyme, cô đặc để đạt lượng đường 15%, lên men rượu bằng

cách sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae FT-18 Quá trình thuỷ

phõn tinh bột ở bã sắn chỉ đạt khoảng 7% đường khử Nếu muốn có dịch đường đạt đến 15%, có thể sử dụng hai phương án: hoặc cho thêm mật mớa vào hoặc cô đặc sản phẩm thuỷ phõn Tuy nhiên cả hai phương án đều kém khả thi Thêm vào đó lượng nước thải ra từ các nhà máy sẽ nhiều hơn và làm phát sinh chi phí xử lý nước thải cao hơn [3 ]

Làm cơ chất cho quá trình lên men ở trạng thái rắn: Đã có một số

công trình nghiên cứu sử dụng bã sắn thay thế cho cám lúa mì trong quá trình lên men VSV ở trạng thái rắn nếu bã sắn được bổ sung thêm nguồn nitơ Quy trình này có tớnh kinh tế vì chi phí phơi khô bã sắn chỉ bằng khoảng 1/3 chi phí cho cám lúa mì [23 ]

Trong những năm gần đõy trên thế giới và ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về sử dụng bã sắn làm cơ chất lên men thu sinh khối và enzyme

vi sinh vật:

Barbasova M.C.S và cộng sự năm 1996 đã dùng bã sắn để nuôi cấy

nấm Sò Pleurotus sajorcaju thu được kết quả tốt Nấm sẽ phát triển mạnh

khi bổ sung thêm vào bã sắn 0,8g/kg cao nấm men

M.R Beux và cộng sự năm 1996 cũng thông báo họ đã sử dụng bã sắn

và bã mớa để nuôi nấm linh Chi (Lentinula edodes)

Balagopalan, Padmaja và George cấy Trichoderma pseudokoningiirifar trên bã sắn có sử dụng 0,15% (NH4)2SO4, sau 24 ngày

hàm lượng protein thô đạt 6,18% Nếu sử dụng Aspergillus niger lên men bã

sắn ở 300C, độ ẩm 60%, sau 5 ngày lên men hàm lượng protein đạt 7,7%

M Raimbault và C.Ramires Tora, 1997 đã dùng Rhizopus có khả năng

phõn giải tinh bột sống cấy lên bã sắn đã được khử trùng bằng hơi nước Kết quả, hàm lượng protein trong bã sắn được tăng lên 14% Nếu dùng 50% bã sắn + 50% bột đậu tương thì hàm lượng protein thu được là 20%

Ở Việt Nam, bã sắn chủ yếu sử dụng để làm thức ăn gia súc trực tiếp,

ủ chua hay phơi khô nhưng chất lượng không cao Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tận dụng và nõng cao chất lượng bã sắn từ quá trình sản xuất tinh bột thủ công hoặc bán công nghiệp bằng cách dùng men thuốc bắc, sau 12 ngày lên men có thể tăng tỷ lệ protein của bã sắn lên tới 8-9 lần, trung bình tăng 4-

Nguyễn Thạc Hoà, 1999 cũng sử dụng hai chủng trên để lên men trên môi trường gồm bã sắn 75-80%, cám gạo 15-20% và các muối vô cơ bổ sung làm thức ăn gia súc

Đặng Văn Lợi, 2000 cũng đã sử dụng chủng A.niger phõn lập được từ

bã sắn của nhà máy sản xuất tinh bột để lên men bã sắn làm thức ăn cho gia súc Sau 21 giờ lên men hàm lượng protein thô đạt 10,1% chất khô, trong

quá trình lên men bã sắn bởi A.niger, xianua bị thuỷ phõn hoàn toàn, sản

phẩm không chứa độc tố aflatoxin

Bùi Thị Quỳnh Vân, 2000 đã nghiên cứu sử dụng tổ hợp các vi sinh vật

Saccharomyces cerevisiae NM7, Aspergillus oryzae NM1 và Aspergillus niger BS2 để lên men bã sắn phế thải nhằm nâng cao chất lượng bã sắn phế thải Sau

khi xử lý bã sắn theo hai phương án trực tiếp và gián tiếp, trong bã sắn chứa 10,84% protein, 2,4IU/g amylase, 1,65IU/g cellulase (xử lý trực tiếp) và 12,96% protein, 2,54IU/g amylase, 1,8IU/g cellulase (xử lý gián tiếp)

Đoàn Văn Thược, 2005, tuyển chọn được chủng B.subtilis V37 sinh

amylase và protease trên cơ chất bã sắn

Ngô Thanh Xuõn, 2006, thu chế phẩm dạng thô enzym phytase từ lên men bã sắn ứng dụng thử nghiệm trên lợn thu được kết quả tốt

Nguyễn Văn Quyết, 2007, sử dụng cơ chất là bã sắn sau lên men chiết xuất enzyme đã nuôi trồng thành công nấm ăn (nấm sò) và nấm dược liệu (nấm linh chi) với năng suất tương ứng là 82,8% và 10,8%

Các nghiên cứu nhằm sử dụng bã sắn để sản xuất amylase, protease, cellulase, xylanase dùng cho chăn nuôi đang được Bộ môn CNSH-VS, ĐHSP Hà Nội tiếp tục triển khai

1.2 Công nghệ trồng nấm ăn, nấm dược liệu từ các phế phụ phẩm nông nghiệp

1.2.1 Khái quát về ngành sản xuất nấm ở Việt Nam

Nấm được trồng ở hơn 100 quốc gia và việc sản xuất nấm hàng năm tăng 7% Sản xuất nấm hàng năm trên thế giới đã vượt mốc 5 triệu tấn (theo

tổ chức Nông Lương thế giới FAO- 2006) và dự kiến đạt khoảng 7 triệu tấn trong 10 năm tiếp theo Các nước sản xuất nấm hàng đầu thế giới bao gồm

Trung Quốc, Hoa Kỳ, Hà Lan, Pháp, Ba Lan, Tõy Ban Nha và Canađa Từ năm 2003, việc sản xuất nấm của Việt Nam ngày càng gia tăng đáng kể và Việt Nam trở thành nước xuất khẩu nấm rơm đứng thứ 3 trên thế giới

Kể từ năm 1990, ở Việt Nam sản xuất nấm được xem là ngành mang lại hiệu quả kinh tế cao thu hút sự tham gia của nhiều bà con nông dõn Các loài nấm chớnh được sản xuất tại các trang trại nấm ở miền Nam là nấm sò

và nấm rơm, cũn ở miền Bắc bao gồm các loài nấm như nấm hương, nấm tai

mèo, nấm linh chi (Ganoderma lucidum)- một loài nấm được dùng làm thuốc

và nấm hương (Lentinus edodes) Trong những năm qua, sản xuất nấm hàng

năm đạt 15.000 tấn nấm tươi Các vùng sản xuất nấm chớnh ở việt Nam là Nam Định, Ninh Bình, Thái Bình, Hưng Yên và Hà Nam (vùng đồng bằng sông Hồng có số lượng lớn nấm Hương), Đồng Tháp, Tõy Ninh, Sóc Trăng

có qui mô lớn về sản xuất nấm Rơm Vùng sản xuất nấm tai mèo chớnh là Long Khánh, tỉnh Đồng Nai

Khoảng 60% số lượng nấm được bán cho thị trường trong nước chủ yếu là sản phẩm nấm tươi, 40% cũn lại được xuất khẩu sang thị trường nước ngoài với giá trị hàng năm đạt 40 triệu USD Các sản phẩm nấm xuất khẩu chủ yếu được đóng hộp và xuất khẩu bằng đường biển sang thị trường các nước Hoa Kỳ, Nhật Bản và Ý

Định hướng và chiến lược của Việt Nam đối với ngành hàng nấm đến năm 2010 là tận dụng 10% rơm rạ từ việc sản xuất lúa, mùn cưa từ chế biến gỗ và các bã mía (khoảng 4 triệu tấn nguyên liệu thô) để sản xuất nấm với chỉ tiêu đạt 1 triệu tấn nấm tươi (trong đó 50% cho tiêu thụ trong nước và 50% cho xuất khẩu)

1.2.2 Giá trị dinh dưỡng và làm thuốc của nấm

1.2.2.1 Giá trị dinh dưỡng của nấm ăn

Việc trồng nấm ăn đã được phát triển trong thời gian trước đõy và ngày nay đã trở thành một hoạt động kinh tế có tầm quan trọng Nấm được

trồng trên toàn thế giới nhất là các loài của chi Agaricus (nấm mỡ), Pleurotus (nấm sò), Lentinus (nấm hương), Auricula (mộc nhĩ), Volvariella

(nấm rơm) [44 ]

Dinh dưỡng và chế độ ăn uống lành mạnh có vai trò rất quan trọng không chỉ trong cuộc sống hàng ngày của con người, mà cũn có vai trò trong điều trị các bệnh món tớnh Nấm được các bác sĩ trên toàn thế giới công nhận là loại thực phẩm giàu chất dinh dưỡng có đặc tớnh chữa bệnh (bảng 1-

2, 1-3, 1-4) [8 ] Các tổ chức y tế đang tích cực kiểm tra hiệu quả sử dụng nấm cho hỗ trợ nghiên cứu lõm sàng hoặc cho phương pháp điều trị của bệnh nhõn bị bệnh HIV, ung thư, béo phì và các bệnh thần kinh Rất ít nghiên cứu

về tớnh chất dinh dưỡng của nấm Bởi vì, hầu hết nấm tươi có tới 90% là nước, do đó phõn tích dinh dưỡng dựa vào trọng lượng khô của nó sẽ có hiệu quả hơn khi so sánh với các thực phẩm khác Nấm rất giàu protein và các acid amin, trong đó có nhiều loại không thay thế được, không gõy xơ cứng động mạch và không làm tăng lượng cholesterol trong mỏu như nhiều loại thịt động vật Carbohydrate đơn giản rất thấp, các chất chống oxy hoá cao và rất ít chất béo Thành phần của nấm thiếu cholesterol, vitamin A, hoặc vitamin C, nhưng có nguồn vitamin B phức tạp như: Riboflavin (B2), niacin (B3) , và khoáng chất như phospho (P), Kali (K), Natri (Na) không có các độc tố Bởi vậy, nấm được xem như một loại “rau sạch” và “thịt sạch”, được sử dụng ngày càng rộng rói trong các bữa ăn [50 ]

Giá trị dinh dưỡng của một số nấm ăn phổ biến (so với trứng gà) [8 ]

Bảng 1-2 Thành phần dinh dưỡng của nấm (% chất khô)

Độ ẩm (%)

Tro

%

Năng lượng (Calo)

Bảng 1-3 Hàm lượng vitamin và chất khoáng trong nấm

(Đơn vị tính : mg/100g chất khô)

Axit nicotinic

Riboflav

in

Thiam ine

Axit ascorbic

Bảng 1-4 Thành phần acid amin không thay thế có trong nấm

(Đơn vị tính: mg trong 100g chất khô)

Lisyne Histidin Arginin Threonin Valine Methionin Isoleucine Leucine

[7 ] Nấm ăn thơm, ngon và có hương vị hấp dẫn là do trong protein của nấm gồm nhiều acid amin tự do và những hợp chất thơm đặc thù của từng loại nấm Như nấm hương có chất Guanosine 5’-monophosphat tạo ra hương vị thơm đặc trưng (Nakajima; Mouri và cộng sự 1969) [1 ]

Hàm lượng chất béo thô (lipid) trong nấm ăn dao động từ 1% tới 20% theo trọng lượng khô, nhưng tất cả đều thuộc các axit béo không no như

15-mono, đi, tri-glycerid, steral, sterol este và phospholipid (Holtz và Schider 1971) Trong bào tử nấm linh chi, chất béo không no gồm acid oleic (55,2%), acid linoleic (16,5%), acid palmitic (19,8%) (Trần Thế Cường-1997) Sử dụng nấm có các acid béo không no hoàn toàn có lợi cho sức khoẻ con người [1 ]

Trong nấm ăn có tới 30-93% là chất Glucid nó không chỉ là chất dinh dưỡng mà cũn là chất đa đường (polysaccharide) và hợp chất của đa đường

có tác dụng chữa bệnh, nhất là chống khối u Thành phần đa đường trong nấm ăn là các đường đơn như Glucose, semi-lactose, xylose, arabinose [1]

Thành phần cellulose trong nấm ăn bình quõn là 8% Cellulose của nấm có tác dụng chống lại sự lắng kết của muối mật và làm giảm hàm lượng cholesterol trong mỏu, nhờ thế mà phũng được sỏi thận và huyết áp cao Do

đó thường xuyên ăn các loại nấm như nấm hương, nấm mỡ, nấm sò, nấm rơm rất có lợi cho sức khoẻ [1]

Vitamin là loại hợp chất hữu cơ không thể thiếu được trong cuộc sống của con người mà phần lớn vitamin phải do thức ăn cung cấp Trong nấm ăn

có nguồn vitamin phong phú, nhất là B1, B2, C, PP, B6, acid folic B12; caroten dưới các dạng hợp chất thiamine, riboflavin, niacin, biotin, axit ascorbic Do đó, sử dụng nấm ăn ta có thể khắc phục được các chứng viêm thần kinh, viêm mép, viêm đầu lưỡi, bại huyết, nóng trong [1]

Tương tự như hầu hết các loại rau quả, nấm là nguồn khoáng rất tốt Hàm lượng các chất khoáng trong nấm dao động từ 3-10% trung bình là 7% Thành phần khoáng chủ yếu là phospho (P), Natri (Na), Kali (K) Nấm hương, nấm mỡ, nấm sò chứa nhiều K có lợi cho sức khoẻ người già Nấm

mỡ có chứa nhiều P; Na; K rất tốt cho quá trình trao đổi chất ở hệ thần kinh của con người [7 ]

Như vậy, ngoài việc cung cấp đạm và đường nấm cũn góp phần bồi dưỡng cơ thể nhờ vào sự dồi dào về khoáng và vitamin (bảng 1-3)

1.2.2.2 Giá trị làm thuốc của nấm dược liệu

Từ ngàn năm nay, nấm linh chi đã được đánh giá là loại thuốc quí, hiếm và đắt tiền hàng đầu trong nền y học cổ truyền của nhiều nước phương Đông, trong đó có Việt Nam Các thầy thuốc Trung Hoa gọi linh chi là thuốc thần tiên, nấm Trường thọ Từ khi phương pháp nuôi trồng nhõn tạo được

áp dụng và những công trình nghiên cứu khoa học về thành phần và tác dụng dược lý, y học về nấm linh chi được công bố, loại nấm này ngày càng được

sử dụng rộng rói làm phương thuốc phòng và chữa nhiều loại bệnh tật cũng như để tăng cường, bồi bổ sức khoẻ

Tác dụng phòng và chữa bệnh của linh chi liên quan đến nhiều hệ thống và cơ quan của cơ thể Hầu hết các nghiên cứu khoa học đều đưa đến kết luận về vai trò của linh chi như là chất làm bình thường hoá các cơ quan

và tổ chức của cơ thể thông qua khả năng tự điều chỉnh của nó [5,60]. Dưới đõy là một số công dụng chữa bệnh phổ biến của nấm linh chi

1) Chữa các bệnh về hệ tim mạch và đường huyết:

Nấm linh chi làm giảm cholesterol, giảm lượng đường trong mỏu, điều hoà và ổn định huyết áp, chống xơ vữa động mạch, chống tụ mỏu, chữa bệnh giảm bạch cầu , tiểu đường [21, 2, 16, 43, 60]

2)Điều trị u bướu, ung thư:

Nguyên nhõn chớnh gõy ra sự phát triển của u bướu là sự rối loạn hay

giảm chức năng miễn dịch của cơ thể, G.lucidum điều chỉnh, hoạt hoá hệ

thống miễn dịch và ngăn chặn sự phát triển các u bướu Thành phần chớnh kháng u là các polysaccharide, tritecpen, lectin [43, 60]

3) Điều trị HIV

Nấm linh chi được sử dụng để hỗ trợ các loại thuốc điều trị HIV khác (ví dụ thuốc AVR) cho kết quả khả quan hơn khi chỉ dùng riêng các loại thuốc ấy [43, 60]

4) Bảo vệ gan thận và chữa các tổn thương về gan

Nấm linh chi có tác dụng bảo vệ gan khỏi các tổn thương do nhiều nhân

tố, hiệu quả thu được ngay cả trước và sau khi có tổn thương Nó đẩy mạnh sự chuyển hoỏ cỏc chất độc và thuốc trong gan để hồi sinh các tế bào gan bị nhiễm độc Do đó nó được dùng để chữa bệnh viêm gan mãn tính như viêm gan B, các chứng nhiễm độc và các bệnh về gan khác, loại trừ các triệu chứng như vàng da, giảm cân, chóng mặt, mệt mỏi, chán ăn Nấm linh chi cũng có tác dụng hỗ trợ thận thực hiện chức năng điều hoà của mình [43, 60]

5) Chữa các bệnh về đường hô hấp như hen, viêm phế quản món tớnh và các bệnh dị ứng thông thường

Bằng cách chặn đứng các chất gõy nên chứng viêm và tăng cường hệ thống miễn dịch, các triệu chứng hen và cảm cúm sẽ giảm, bệnh hen vì thế

mà đỡ trầm trọng Các sản phẩm của nấm linh chi được sử dụng làm chất chất chống ho và chất long đờm Nấm linh chi cũng tăng cường sự tái tạo các

tế bào khí quản và các biểu mô khí đạo, đặc biệt quan trọng với các bệnh nhõn nghiện thuốc lá (lào) và bị viêm phế quản món tớnh [28, 60].

6) Chữa bệnh về đường tiêu hoá

Nấm linh chi có tác dụng làm giảm lượng acid trong dạ dày Lượng acid này khi quá dư sẽ dẫn đến sự viêm loét dạ dày và hệ thống tiêu hoá Linh chi cũng có tác dụng điều chỉnh nhu động ruột, do đó chữa được các triệu chứng táo bún và tiêu chảy do hội chứng đường ruột bị kích thích [60]

7) Chữa các bệnh về suy nhược thần kinh, mệt mỏi

G.lucidum được sử dụng để điều trị chứng suy nhược thần kinh và mất

ngủ vì nó tác động lên hệ thần kinh trung ương, làm ổn định hoạt động của

cơ thể [43, 63 ]]

8) Hỗ trợ các quá trình hoá trị liệu và xạ trị liệu làm giảm các tác dụng phụ như sự mệt mỏi, sự chán ăn, sự chốn tuỷ xương, rụng tóc, buồn nôn, viêm miệng, mất ngủ [60]

9) Chăm sóc sắc đẹp

G.lucidum được gọi là “thuốc trường sinh”, giúp bảo vệ da và ngăn ngừa sự lóo hoá G.lucidum duy trì và điều chỉnh lượng nước trong da, giữ

da mềm, mịn, sáng Nó cũng ức chế sự hình thành và phá huỷ của sắc tố

melamin G.lucidum cũng có tác dụng chống rụng tóc [60]

Ngoài các tác dụng kể trên, nấm linh chi cũn được sử dụng để điều trị các triệu chứng viêm da, xơ cứng bì [28, 5]

Những nghiên cứu cho thấy thành phần chớnh của G lucidum bao

gồm các polysaccharide, các acid béo chưa no, alcaloid, nucleotit, các aminoacid, cumarin, manitol, lacton, các nguyên tố vi lượng và các vitamin, các tripecpen Trong đó thành phần có hoạt tớnh sinh học là các polysaccharide, các tritecpen, sterol, lectin và protein Hoạt tớnh sinh học của một số hợp chất trong nấm linh chi được tổng kết như sau:

1) Hoạt tớnh kháng virut, kháng khuẩn

Các nghiên cứu chỉ ra rằng G.lucidum có tác dụng kháng virut và

kháng vi khuẩn (yếu hơn) Hoạt tớnh kháng vi khuẩn Gram (+) đã được tỡm

thấy ở các dịch chiết của cuống G.lucidum [45] Các dịch chiết trong

methanol của thể sợi nấm G.lucidum ức chế B.subtilis và S aureus [35]

Yoon và ctv., năm 1994 nghiên cứu tác dụng hỗ trợ của dịch triết trong nước

của cuống bào tử G.lucidum với bốn loại kháng sinh đã biết (ampiciline,

cephazolin, oxytetracylin, và chloramphenicol) Kết quả có ba trường hợp đều có tác dụng hiệp lực, riêng cephazolin cho tác dụng ngược nhau khi

kháng vi khuẩn Bacillus subtilis và Klebsiella oxytoca [62] Một số dịch chiết trong nước và methanol của bào tử G.lucidum thể hiện khả năng kháng

lại năm dòng virut gõy bệnh như virut herpec loại 1 1), loại 2 2), virut cúm A (Flu A) và virut gõy nhọt ở miệng (SVS) [37]

(HSV-2) Hoạt tớnh kháng u, chống ung thư

U bướu, đặc biệt ung thư là một trong những nguyên nhõn gõy tử vong hàng đầu trên thế giới Giá trị phòng và chữa trị những loại bệnh này

của G.lucidum đã được chứng minh không những trong phòng thí nghiệm

mà cả trên thử nghiệm lõm sàng

Ganopoly là một phõn đoạn polysaccharide chiết từ G.lucidum được

bán trên thị trường ở nhiều nước Chõu Á để chữa nhiều bệnh món tớnh bao gồm cả ung thư và bệnh gan Gao và cộng sự (2005) [38] đã nghiên cứu hoạt tớnh kháng u và cơ chế của nó trên các dòng tế bào u người và chuột Điều trị chuột mang u sarcoma-180 trong 10 ngày làm giảm rừ rệt trọng lượng khối u với tỉ lệ 32,3; 48,2 và 84,9% và thời gian phát triển 1,5; 3,5; và 13,1% tương ứng với các liều dùng 20; 50; và 100mg/kg

Bột G.lucidum có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư

của các bệnh nhõn mắc bệnh bạch cầu, u bạch huyết, và u tuỷ [57]. Dịch

chiết trong ethanol và DMSO của G.lucidum đẩy lựi sự phát triển của dòng

tế bào ung thư trực tràng người SW 480 [61]

Minh Quyền và ctv., năm 2002 nhận thấy polysaccharide chiết từ thể quả và sinh khối sợi nấm linh chi làm tăng trọng lượng và thời gian sống của chuột nhắt trắng mang u báng sarcoma 180 [9] Thử nghiệm lõm sàng trên bệnh nhõn ung thư vòm miệng của Kim Dung và cộng sự (2002) [17] cho thấy Linh chi có tác dụng hạn chế các tác dụng phụ do tia xạ và hạn chế tổn thương của tia xạ đối với các tế bào chịu trách nhiệm miễn dịch ở các bệnh nhõn ung thư vòm miệng

3) Hoạt tớnh giảm đường huyết

Thành phần có hoạt tớnh giảm đường huyết của G.lucidum là

polysaccharide Năm 2004, Zang và Lin nghiên cứu thấy polysaccharide

phõn lập từ quả thể của G.lucidum có tác dụng làm giảm lượng đường huyết

ở chuột do có hoạt tớnh giải phóng insulin bằng cách xúc tiến dòng Ca2+

tới các tế bào ò tuyến thượng thận [64] He và cộng sự (2006) cho biết dịch chiết

polysaccharide tổng của G.lucidum có tác dụng làm giảm lượng đường huyết

và ngăn chặn quá trình biến chứng động mạch thận trên chuột bị gõy đái tháo đường thực nghiệm bởi streptoxin [41]

4) Hoạt tớnh giảm cholesterol

Chế độ ăn uống dư thừa tinh bột, protein và acid béo có thể dẫn tới chứng đọng cholesterol Chứng này làm tăng độ nhớt của mỏu Do đó cơ tim phải làm việc vất vả hơn để tuần hoàn mỏu trong cơ thể Đồng thời giảm độ bền vững của các mao mạch vận chuyển mỏu Kết quả có thể gõy ra nhiều bệnh liên quan đến quá trình tuần hoàn mỏu như đau tim, xơ cứng động mạch, cao huyết áp

Kết quả thử nghiệm trên chuột cao lỏng nấm linh chi có tác dụng làm giảm chỉ số lipid mỏu của chuột [19] Thử nghiệm lõm sàng trên các bệnh

nhõn rối loạn lipid mỏu bằng bài thuốc LP4 có G.lucidum của Văn Thành

cho thấy bài thuốc này có tác dụng hạ các chỉ số cholesterol, triglycerid và tăng cõn nặng, giảm các triệu chứng của bệnh mà không thấy có tác dụng phụ nào [4]

5) Ảnh hưởng lên sự ngưng kết các tiểu cầu

Các cục nghẽn là nguyên nhõn trực tiếp gõy ra đột quị, phình mạch, suy cơ tim Sự nghẽn mạch cản trở tuần hoàn mỏu có thể gián tiếp dẫn tới sự viêm gan, viêm thận, đái tháo đường cấp, ung thư Tác nhõn chớnh dẫn tới

sự tụ mỏu là các tiểu cầu Sự đông mỏu xảy ra khi các tiểu cầu tích tụ ở vết thương để ngăn cản mỏu chảy và giúp quá trình phục hồi các mô Sau khi qua trình phục hồi kết thúc, các tiểu cầu được giải phóng và đi vào mỏu Nhưng trong một số trường hợp sự giải phóng này không xảy ra dẫn tới sự tắc nghẽn mạch mỏu

Acid ganoderic S từ G.lucidum gõy ra sự ngưng kết các tiểu cầu bằng

cách kích thích sự thuỷ phõn của phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat [54] Tao và Feng, năm chỉ ra rằng một phương thuốc thảo dược của Trung Quốc

từ G.lucidum ức chế sự ngưng kết tiểu cầu khi sử dụng cho bệnh nhân xơ vữa

động mạch Ađenozin cũng có tác dụng ức chế sự ngưng kết tiểu cầu [55]

6) Bảo vệ gan

Polysaccharide liên kết với protein từ G.lucidum có tác dụng bảo vệ gan

[45, 46]. Song và các cộng sự (1998) phân lập một polyme ngoại bào từ dịch

nuôi cấy G.lucidum thể hiện tác dụng bảo vệ gan bằng cách giảm hoạt tính

enzyme chuyển hoá glutamic pyruvic transaminaza (GPT) lên huyết tương của

chuột Shieh (2001) kết luận rằng cơ chế bảo vệ gan và thận của G.lucidum là

do tác dụng loại trừ các supeoxit gây tổn thương cho gan và thận [52]

Đào Văn Phan, Trần Mạnh Hùng và các cộng sự, năm 2005 nghiên cứu

tác dụng bảo vệ gan của G.lucidum Việt Nam trên chuột gây suy nhược gan

thực nghiệm bằng paracetamol (PAR), đietylnitrozamin và CCl4 Kết quả cho

thấy khi dùng cao lỏng G.lucidum trước và cả trong thời gian cho uống paracetamol thì cao lỏng G.lucidum có tác dụng ngăn cản đáng kể sự tăng các

chỉ số về men gan do paracetamol gây ra Với trường hợp gây suy gan bằng CCl4 thì men gan có giảm nhưng không nhiều Các tổn thương tế bào gan của

chuột suy gan khi dùng G.lucidum cũng giảm đi rõ rệt [18, 26, 27]

7) Chống oxy hoá

Các tiểu phần oxy hoá hoạt động (ROS) như các anion supeoxit và gốc

tự do hyđroxi có thể gõy ra bệnh ung thư và các loại bệnh khác bằng các hoạt động như là một tác nhõn khơi mào hay kích thích Do đó sự phản hoạt động hay loại bỏ các tác nhõn này có thể rất quan trọng trong việc phòng chống các bệnh tật

Các polysaccharide liên kết với protein từ dịch chiết ethanol từ

G.lucidum thể hiện hoạt tớnh loại bỏ gốc tự do hyđroxi và supeoxit Dịch chiết trong nước nóng của G.lucidum thể hiện tác dụng chống oxy hoá lên

gan và thận chuột và các dịch chiết cũng làm giảm sự đứt góy trên DNA do

sự quang phõn hyđropeoxit [42] Liu và cộng sự cũng kết luận rằng tỉ lệ polysaccharide/protein trong polysaccharide liên kết với protein càng thấp thì hoạt tớnh càng lớn

Quang Thường và cộng sự, năm 1996 thăm dò hoạt tớnh chống oxy hoá của nấm linh chi cho thấy linh chi có tác dụng ức chế quá trình oxy hoá

ở dịch đồng thể nóo chuột với hiệu suất 38% [12]

1.2.3 Đặc điểm sinh học của nấm Sò

Nấm sò (Pleurotus spp.) là một nhóm nấm ăn quý không những có tác

dụng về mặt dinh dưỡng mà còn có tác dụng chữa bệnh, hiện được nghiên cứu tập trung ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Á Sản lượng nấm sò thời gian gần đây tăng tới 400% Theo Shukla và Biswas (2000) việc nuôi trồng nấm sò đang phát triển rộng rãi và thu lợi cao nhờ công nghệ đơn giản, nguồn cơ chất phong phú [56] Hơn nữa chúng có khả năng sinh trưởng và phát triển ở những điều kiện môi trường nhiệt độ khí hậu khác nhau và thời gian sinh trưởng khá ngắn [53, 63]

Ở Việt Nam, việc nuôi trồng nấm ăn nói chung và nấm sò nói riêng đang được đẩy mạnh trong cả nước và là nguồn thu nhập đáng kể trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi Tuy nhiên, chất lượng của nấm phụ thuộc nhiều vào chủng loại, trong đó các đại diện thuộc phân chi

Pleurotus sinh bào tử vô tính (Coremiopleurotus Hilber) có nhiều đặc tính

quý báu, đặc biệt là hàm lượng đạm rất cao [32]. Chính vì thế việc nghiên cứu kỹ phân chi này có ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn

Nấm sò (nấm tai lệch, nấm xoè, nấm bào ngư, nấm bèo) có tên khoa

học chung là Pleurotus spp, thuộc chi Pleurotus họ Pleurotaceae, bộ

Agaricales, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomycotina, ngành nấm thật – Eumycota, giới Nấm – Fungi Trong đó có 39 loài khác nhau về màu sắc, hình dạng, khả năng thích nghi với các điều kiện nhiệt độ chúng là

những loài nấm sò tớm (P ostreatus), nấm sò trắng (P pulmonarius), nấm

sò nõu (P sajo-caju) [1]

Nấm có dạng hình phễu lệch, mọc thành cụm tập chung, mỗi cánh nấm gồm 3 phần: mũ, phiến, cuống [7]

Mũ nấm hình phễu nông, lệch, hình sò đến hình thỡa Mặt mũ nấm nhẵn, phẳng, khi ẩm có thể hơi có lông mịn, màu trắng , hơi có sắc thái vàng bẩn, khi khô hơi vàng bẩn Mép mũ đầu tiên cuộn vào trong, sau đó phát triển hơi cuộn lại hoàn chỉnh, lượn sóng và chia thuỳ ít hay nhiều, khi già có thể nứt ra Kích thước 3 -8 (15) cm

Cuống nấm ngắn màu trắng có khi có sắc thái vàng bẩn, hơi phủ lông mịn ở gốc và mọc dớnh vào với cuống nấm khác thành cụm Kích thước 0,2 -2 (5) ì 0,2 -1 cm

Phiến nấm màu trắng, xếp xít nhau, men dần xuống cuống Khi già hay khô có sắc thái vàng Giá dạng chuỳ, không màu, kích thước 13,5 -19 ì 6,5 -7,5 àm

Bào tử hình elip dài gần đến hình trụ, không màu, màng nhẵn, kích thước 3,5 -4 ì 8,5 -9,5 àm

Hệ thống sợi nấm đimitric gồm sợi nguyên thuỷ có vách ngăn ngang,

có khoá và sợi cứng, không vách ngăn, màng dày; kích thước 2,5 -7,5 àm đường kớnh Hệ sợi nấm trong môi trường nuôi cấy thuần khiết màu trắng, mọc khá nhanh với sợi không khí phát triển, phần lớn tạo thành sợi nguyên thuỷ, khi đưa ra ánh sáng có khả năng hình thành mầm nấm , nấm non

Nấm mọc trên gỗ mục của các cõy lá rộng, thường hình thành từng búi Nấm mọc nhiều vào mùa nóng ấm Đõy là loài nấm ăn, quý nhất khi chưa già Đã được nuôi trồng chủ động ở nhiều nước và ở nước ta cũng đã nuôi trồng trên qui mô công nghiệp [29]

1.2.4 Đặc điểm sinh học của nấm Linh Chi

Nấm linh Chi (vạn niên nhung, chi linh, mộc linh chi, hổ nhũ linh chi, bất lão hảo, thần tiên thảo, đoạn thảo, nấm lim .) có tên khoa học là

Ganoderma lucidum (Leyss.Fr.) Kast thuộc giới Fungi, ngành Basidiomycota,

lớp Homobasidiomycetes, bộ Polyporales, họ Ganodermataceae, chi

Ganoderma Ở Trung Quốc loài nấm này được gọi là Lingzhi, Ở Nhật Bản là

Reishi, Munnertake, Sachitake, Ở hàn Quốc là Youngzhi [30, 52].

Ganoderma là một trong những chi lớn nhất của bộ Polyrorales Sự

phõn loại và gọi tên các loài trong chi này có nhiều trường hợp lẫn lộn Sau

khi loại bỏ những tên gọi đồng nghĩa, khó hiểu, sai thì trong chi Ganoderma cũn 148 loài Trong đó Ganoderma lucidum (G.lucidum) là loài có mặt

thường xuyên nhất trong các nghiên cứu về nuôi trồng, phõn tích hoá học,

công dụng dược học, y học Trên thế giới, G.lucidum có khoảng 45 loài, ở

Việt Nam có 15 loài [5, 51]

Trong tự nhiên, nấm Linh Chi được tỡm thấy ở các rừng rậm vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt, nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao Chúng sống kí sinh trên cõy gỗ (thường là cõy thuộc bộ đậu Fabales) cũn sống hay đã mục nát Thể quả gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5-11), có thể ở trên thõn cõy (cuống thường ngắn, tai nấm nhỏ), quanh gốc cõy hoặc từ các rễ cõy (nổi hoặc ngầm gần mặt đất), khi ấy cuống nấm thường dài, có thể phõn nhánh và đôi khi tán nấm rất lớn (~30cm) Thể quả gồm 2 phần: cuống nấm và mũ nấm [5]

Cuống nấm dài hoặc ngắn, thường đớnh bờn, đôi khi trở thành đớnh tõm

do quá trình liền tán mà thành Cuống nấm thường hình trụ, ít khi phân nhánh, đôi khi uốn khúc cong quẹo, đường kính từ 0,3 - 3,5cm, chiều dài từ 2,7 – 22cm Lớp vỏ cuống láng đỏ- nâu đen- nâu đỏ, bóng, không có lông [5]

Mũ nấm khi non có hình trứng, lớn lên thành hình rẻ quạt, hay hình bán nguyệt, hình thận, kích thước thay đổi: rộng 2- 25cm, dài 3- 30cm, dày 0,5- 2cm Mặt trên bóng như đánh vecni, màu từ vàng chanh, vàng nghệ đến vàng nõu, vàng cam, đỏ nõu-nõu tớm, có đường võn đồng tõm, lượn sóng và võn tán xạ Phần cuống đính hơi gồ lên hoặc lừm xuống Mặt dưới màu nõu nhạt, mang các ống rất nhỏ, chứa bào tử Bào tử khi chín màu nõu Khi nấm trưởng thành thì phát tán bào tử [7].

Nấm linh chi mọc trong tự nhiên rất hiếm Hơn thế nữa, nấm tỡm được không mấy khi nguyên vẹn mà hay bị sõu bọ cắn nát Trong lịch sử không biết bao nhiêu người đã tỡm cách cấy giống và trồng loại nấm này

nhưng đều thất bại Mói tới năm 1971, hai nhà khoa học người Nhật tên là Yukio Naoi và Zenzaburo Kasai, Giáo sư của phõn khoa Nông nghiệp, Đại học Kyoto mới thành công trong việc gõy giống và người ta mới sản xuất được loại nấm một cách qui mô Từ đó linh chi được trồng và sử dụng trong việc bào chế theo qui mô công nghiệp [5]

1.2.5 Quy trình nuôi trồng nấm ăn và nấm dược liệu

Ở Việt Nam hiện nay chúng ta đã tiến hành nuôi trồng 10 loại nấm phổ biến có năng suất và chất lượng tương đương với các nước trong khu vực Quy trình chung trong trồng nấm ăn và nấm dược liệu trên các nguồn nguyên liệu truyền thống như mùn cưa, bông và rơm rạ được mô tả túm tắt theo hình 1.1 dưới đõy:

Nguồn nguyên liệu phổ biến để trồng nấm từ trước tới nay được biết tới vẫn là rơm rạ, mùn cưa, cây gỗ, bông phế thải, ngoài ra có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu khác như: bã mớa , bụi xơ dừa, bã sắn, vỏ hạt cafe, lừi ngô, bột cỏ nghiền là các nguyên liệu có hàm lượng cellulose tương đối cao Theo kết quả nghiên cứu từ ngành chức năng ở nhiều địa phương, nấm

sò trồng trên rơm rạ, bã mía, mạt cưa, bông phế liệu dễ xử lý, đều đạt hiệu suất sinh học (nấm tươi trên trọng lượng nguyên liệu khô) cao [1;

http://mushclubvn.com ]

+ Sử dụng bã mía: Bã mía là phế liệu của nhà máy đường, số lượng

thải ra hàng năm rất lớn, nếu sử dụng cho trồng nấm sòsẽ tạo ra một lượng sản phẩm không nhỏ cho xã hội và cho xuất khẩu Mới đây, các nhà khoa học và kỹ sư thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thực vật (TTCNSHTV), Viện Di truyền Nông nghiệp, đã nghiên cứu và thử nghiệm thành công một nguồn nguyên liệu bã mía sẵn có có thể dùng để nuôi trồng nấm rơm, nấm

sò, mộc nhĩ, nấm mỡ, nấm hương và nấm Linh Chi với năng suất khá cao năng suất trung bình của nấm rơm trên bã mía khô đạt 12,8%, trong khi năng suất trung bình của nấm rơm trên rơm rạ khô đạt 12,6% Năng suất trung bình của nấm mỡ trên bã mía khô đạt 23,2%, thấp hơn năng suất trung bình của nấm mỡ trồng trên rơm rạ 3%, nhưng năng suất trung bình của nấm Linh Chi trồng trên bã mía đạt 11,35%, cao hơn năng suất của nấm Linh Chi được trồng trên mùn cưa cao su 1,8% Năng suất của nấm sò trồng trên bã mía khô đạt 80%, cao hơn 1,88 lần năng suất nấm sò trồng trên rơm rạ; năng suất của mộc nhĩ trồng trên bã mía đạt 95,04%, trong khi đó, năng suất mộc nhĩ trồng trên mùn cưa đạt 93,92% Một tấn mùn cưa giá 600.000 – 700.000 đ/tấn, trong khi đó nguồn bã mía hầu như cho không, dân chỉ mất chi phí vận

chuyển (Nguồn: TBKTVN, 13/7/2001; Khoa học- Công nghệ Tuyên Quang; http://agriviet.com)

+ Sử dụng mùn cưa: Nguyên liệu sử dụng chính là mùn cưa cao su

của các loại gỗ không có tinh dầu, nhiều nơi cũng có thể dùng mùn cưa tạp của cỏc cõy lỏ rộng, gỗ mềm, như xoài, mít, sung, điều, điệp Nuôi trồng nấm sò trên mùn cưa cho năng suất từ 60-70%

+ Sử dụng rơm rạ: Nuôi trồng nấm sò trên mùn cưa thích hợp cho

nuôi trồng công nghiệp, nhưng để phổ biến rộng rãi trong dân, nhất là giải quyết xoỏ đúi giảm nghèo, thì việc đầu tư khá tốn kém Vì vậy nếu ở những vùng có rơm rạ, có thể có phương pháp đơn giản hơn để trồng nấm sò với nguyên liệu là rơm rạ Ngoài ra, ở các vùng trồng lúa lại khan hiếm mùn cưa, nên sử dụng rơm rạ làm nguyên liệu trồng nấm sò, vừa hạ giá thành, vừa thu được năng suất cao Nấm sò trồng trên rơm rạ cho năng suất trung bình 50-70% (500-700kg nấm/1tấn nguyên liệu)

+ Sử dụng xơ dừa: Tại Kiên Giang, sau một năm thử nghiệm, cho

thấy nấm sò được trồng trên bụi xơ dừa cho kết quả tốt Ngành Nông nghiệp huyện Châu Thành, tỉnh Kiên Giang đã sản xuất thử 1.000 bịch, trong thời gian này, nhiệt độ và độ ẩm không khí trong nhà trồng được giữ ổn định bằng cách tưới và phun liên tục (khoảng 4-6 lần/ngày) Thời gian thu hoạch

từ 7-10 ngày/đợt, mỗi vụ thu hoạch từ 3-4 đợt Trong 1.000 bịch phụi, cú

828 bịch cho ra nấm với tổng lượng thu 124 kg, năng suất trung bình 150g nấm/bịch Trưởng phòng Nụng-Lõm - Ngư nghiệp huyện Châu Thành, tỉnh

Kiên Giang, cho biết: “Trồng nấm bào ngư trên bụi xơ dừa không chỉ góp phần giải quyết tình trạng ô nhiễm môi trường tại địa phương do bụi xơ dừa gây ra mà còn góp phần tăng thu nhập cho người dân từ việc tận dụng những khoảng đất trống bỏ hoang xung quanh nhà Từ 1 bịch (trọng lượng khoảng 1-1,2 kg) nếu được chăm sóc theo đúng quy trình có thể cho ra 250- 300g sản phẩm nấm bào ngư” Chi phí đầu tư cho 1kg nấm bào ngư từ 6-7

ngàn đồng Sản phẩm nấm bán được từ 12-15 ngàn đồng/kg, người sản xuất

có thể lãi 6-8 ngàn đồng/kg Như vậy với 10.000 bịch phôi bụi xơ dừa có thể

sản xuất ra 2.000 kg nấm bào ngư và cho lợi nhuận 12- 16 triệu đồng (Theo www.longhoa.com)

+Sử dụng thân cây Mai Dương để làm nguồn nguyên liệu trồng nấm

do trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh khởi xướng Biện pháp này vừa giúp kiểm soát sự xâm lấn của cây Mai Dương mà còn kích thích được cộng đồng dân cư xung quanh vùng tham gia cùng Với giá trị kinh tế từ nấm, sẽ giúp người dân sống quanh khu đệm tích cực tham gia

để cải thiện thu nhập của chính họ Hiện nay đã trồng thành công nấm mèo, nấm bào ngư trên thân cây Mai Dương, thu được lợi nhuận khá cao và người

ta đang tiến hành nghiên cứu trồng nấm Linh chi trên thân cây Mai Dương.[Nguyễn Minh Thư (ĐH MỞ TP.HCM) - Lê Duy Thắng (ĐH KHTN TP.HCM)]

+ Sử dụng bã sắn: để nuôi trồng nấm sò và nấm linh chi mới đõy cũng

đã được nghiên cứu Barbasova M.C.S và cộng sự năm 1996 đã dùng bã sắn

để nuôi cấy nấm Sò Pleurotus sajorcaju thu được kết quả tốt Nấm sẽ phát

triển mạnh khi bổ sung thêm vào bã sắn 0,8g/kg cao nấm men M.R Beux và cộng sự năm 1996 cũng thông báo họ đã sử dụng bã sắn và bã mớa để nuôi

nấm linh Chi (Lentinula edodes) N.V.Quyết cũng đã sử dụng bã sắn nuôi

trồng nõm sò, nấm linh chi đạt hiệu suất 76% và 9,2%

Sử dụng bã sắn để nuôi trồng nấm cho năng suất cao hơn các nguồn nguyên liệu kể trên, tuy nhiên giá thành nguyên liệu bã sắn bán trên thị trường cao hơn (1000-1.200đ/kg) Mặt khác, khâu lí và bảo quả nguyên liệu trong quá trình nuôi trồng rất phức tạp vì bã sắn rất dễ bị nhiễm các loại nấm mốc do trong bã sắn hàm lượng tinh bột cũn lại tương đối cao

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật kiểm định nghiên cứu bao gồm: Bacillus subtilis (B.subtilis), Escherichia coli (E.coli), Staphyllococcus sp , S aureus 7YB, Salmonella enteritidis (S enteritidis), Salmonella typhymurium (S typhymurium), Aspergillus oryzae NM1(A.oryzae NM1) Các chủng vi sinh

vật nghiên cứu khác được lấy từ bộ sưu tập giống của bộ môn Công nghệ sinh học – Vi sinh Khoa Sinh học, Trường đại học sư phạm Hà Nội Phần lớn các chủng được phõn lập từ rừng ngập mặn

Giống nấm: Nấm Sò (Pleurotus pulmonarius), nấm linh chi (Ganoderma lucium) mua từ Viện di truyền Nông nghiệp

Môi trường 3: Glucose: 10 g; pepton: 2 g; KH2PO4 7H2O: 5 g; MgSO4.7H2O 0,5 g; thạch : 20 g; nước biển: 1000 ml; pH: 5,0-6,0

+ Môi trường lên men bề mặt: Cơ chất là bã sắn được làm ẩm đến 75% bằng dung dịch khoáng gồm: KH2PO4: 4,2 g; KCl: 0,5 g; KNO3: 13 g; MgSO4: 0,5 g; FeSO4: 0,01 g; NaCl: 11,25 g, pha trong 1 lít nước máy

2.1.3 Hoá chất

+ Các hoá chất dùng cho nghiên cứu enzyme được mua từ Merck (Đức) và Sigma (Mỹ) bao gồm: oat spell xylan (OSX), D-xylose, DNS

dinitro salysilic axit, BSA (Bovine serum albumin), Coomassie brilliant blue-R250 (CBB-R250)

+ Các hoá chất thông dụng khác được mua của Trung Quốc và Việt Nam: KNO3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, CH3COONa, HCl,

H2SO4, HNO3, C2H5OH, Agar (thạch)

Các hoá chất trên đều tinh sạch ở mức độ phõn tích

+ Bã sắn, cám con cò, cám ngô mua từ cửa hàng thức ăn gia súc

2.1.4 Thiết bị

- Tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức)

- Máy li tõm (Sorvall, Mỹ)

- Nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật)

- Quang phổ kế (UV-vis, Shimazdu Nhật)

- Máy lắc ổn nhiệt (BR300LF và Memmert, Đức)

- Máy đo pH (MP 200R, Thụy Sỹ)

- Cõn phõn tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ)

- Máy cất nước hai lần (Hamilton, Anh)

- Máy lọc nước siêu sạch (Millipore, Mỹ)

- Máy Vortex (Kika, Đức)

- Máy đo chất lượng nước (31 chỉ tiêu- Aqualytic, Đức)

- Micropipet (Gilson, Pháp) các loại từ 20àl – 10ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Hoạt hoỏ cỏc vi sinh vật [15]

- Đối với vi khuẩn: Các vi khuẩn bảo quản trong môi trường thạch nghiêng thích hợp cho mỗi loại ở 40C hoặc ở 200C Trước khi sử dụng, các vi khuẩn được hoạt hoá trên môi trường dịch thể, nuôi lắc các ống nghiệm trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ, sau đó cấy trải trên môi trường thạch đĩa để

tạo thành những khuẩn lạc mọc riêng rẽ, cấy truyền sang ống nghiệm chứa các môi trường thạch Sử dụng giống đã được hoạt hoá cho những nghiên cứu tiếp theo

- Đối với nấm mốc: Để có thể hoạt hoá nấm mốc phương pháp làm tương tự như đối với các vi khuẩn nhưng môi trường sử dụng là môi trường MT1 và MT3

2.2.1.2 Phương pháp lên men bề mặt [24]

Môi trường cơ chất bã sắn đã được làm ẩm đến 75% bằng dịch khoáng

và được thanh trùng ở 1210C, 1 atm trong 30 phút Để nguội, bổ sung A oryzae NM1 và trộn đều nhằm phõn tán bào tử trong sinh khối lên men Hỗn

hợp cơ chõt - giống được ủ trong 36h ở điều kiện 330C

2.2.2 Phương pháp hoá sinh

2.2.2.1 Xác định khả năng sinh enzyme (amylase, cellulase, chitinase, protease) bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch

Dựa theo phương pháp của Williams, (1983) [14, 59]

* Chuẩn bị cơ chất cho từng loại enzyme: Môi trường gồm 2% thạch

có bổ sung 1% tinh bột tan hoặc 1% chitin hoặc 0.5% CMC hoặc 1% gelatin Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, đổ vào các đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 25ml sau đó để nguội

* Chuẩn bị dịch thử enzyme: Bã sắn trồng nấm sò và nấm linh chi sau khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền đồng thể tỉ lệ 1g cơ chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch trong để thử hoạt tính

* Thử hoạt tính: Dùng khoan nút chai khoan 2 lỗ trên đĩa thạch Nhỏ 100àl dịch trong thu được vào mỗi lỗ Đặt vào tủ lạnh 40

C từ 8 -12h để enzyme khuếch tán vào thạch, sau đó chuyển sang tủ ấm 300C khoảng 24h Hoạt tính enzyme được hiện hình bằng vòng phân giải khi sử dụng các thuốc thử tương ứng Hoạt tớnh Amylase và chitinase được hiện hình bằng

dung dịch lugol (1g KI với 2g I2 trong 300ml nước) Hoạt tớnh cellulase được hiện hình bằng dung dịch công gô đỏ 1% Hoạt tớnh Protease được hiện hình bằng dung dịch Amonisunfat bóo hoà Hoạt tớnh các enzyme được đánh giá sơ bộ bằng độ lớn vòng phõn giải (D-d, mm), trong đó D là đường kớnh vòng phõn giải, d là đường kớnh lỗ thạch

2.2.2.2 Xác định hoạt độ cacboxymethylcellulase và amylase

Dựa theo phương pháp của Miller G.L (1959) [49]

* Nguyên lý: CMC-ase phõn cắt cacboxymethylcellulase (CMC) và amylase phõn cắt tinh bột thành các oligosaccharide và glucose có tớnh khử

có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng

+ Dựng đường chuẩn D-glucose: Pha dung dịch gốc 10μmol/ml D-glucose trong đệm 50mM Na-acetat Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6;

10 (μmol/ml) Lấy 50μl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450μl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dịch thuốc thử DNS Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm

Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-1)

y = 15.759x + 0.5181

R 2 = 0.9912

0 2 4 6 8 10

Hình 2-1 Đường chuẩn xác định hàm lượng D-glucose bằng DNS

Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị OD540nm thu được là y=15,759x + 0,15181 Trong đó: y là hàm lượng

D-glucose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng Hệ số tương quan

R2 = 0,9912 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ

+ Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của CMC-ase và amylase:

- Thí nghiệm: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp Ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 750μl dung dịch DNS để dừng phản ứng

- Đối chứng: 450μl dung dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750μl dung dịch DNS + 50μl dịch enzyme đã pha loóng thích hợp Ủ ở 50oC trong

30 phút

Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5-7 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540nm Từ giá trị OD ta tớnh được lượng đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình

y=15,759x + 0,15181 (trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch; x

là giá trị OD540nm tương ứng)

Quy ước: Một đơn vị hoạt tớnh (IU) của CMC-ase (hoặc amylase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1μmol đường khử trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm dùng glucose là đường chuẩn

2.2.2.3 Xác định hoạt độ xylanase

Dựa theo phương pháp của Bailey (1992) [31].

* Nguyên lý: Xylanase (endoxylanase 1,4- xylanase) phõn cắt cơ chất xylan thành các oligoxylose và các xylose có tớnh khử, có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng

* Tiến hành thí nghiệm:

+ Dung dịch cơ chất 1% oat spelts xylan (OSX): Cõn 1gam OSX pha trong đệm 50mM Na-acetat, pH 5,5

+ Dung dịch thuốc thử DNS được pha như đã trình bày ở trên

+ Dựng đường chuẩn D-xylose: Pha dung dịch gốc 10àmol/ml D- xylose trong đệm Na-acetat 50mM Từ đó pha loãng thành các nồng độ (àmol/ml): 0; 2; 4; 6; 8 ;10 Dựng 50àl dịch D-xylose ở các nồng độ + 450 àl dung dịch 1% oat spelts xylan (OSX) + 750àl dịch thử DNS Đun cách thủy 5 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng và đo độ hấp phụ OD ở bước sóng λ540nm ta được giá trị tương ứng

Đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D- xylose và giá trị

OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-2)

y = 11.653x + 0.197

R 2 = 0.995

0 2 4 6 8 10 12

Hình 2-2 Đường chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS)

Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-xylose và giá trị OD540nm thu được là y=11.653x+0.197 Trong đó: y là hàm lượng D-

xylose trong 1ml dịch; x là giá trị OD540nm tương ứng Hệ số tương quan R2 =

0,995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ

* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của xylanase

+ Thí nghiệm: 450àl dung dịch 1% OSX+ 50àl dịch enzyme đã pha loãng

thích hợp Ủ ở 500

C trong 5 phút, bổ sung 750àl dung dịch DNS để dừng phản ứng

+ Đối chứng: 450àl dung dịch 1% OSX+ 750àl dung dịch DNS+ 50àl dịch

enzyme đã pha loãng thích hợp Ủ ở 500C trong 5 phút

Đun cách thủy mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng trong 5 đến 7 phút, sau đó cho qua nước lạnh Đo độ hấp phụ ở bước sóng 540nm Từ giá trị OD

ta tính được lượng đường khử được tạo ra nhờ phương trình

y=11.653x+0.197 (trong đó: y là hàm lượng D-xylose trong 1ml dịch; x là

giá trị OD540nm tương ứng)

Qui ước: Một đơn vị hoạt độ xylanase (IU) là lượng enzyme cần thiết

để giải phóng 1 àmol đường khử trong một phút ở điều kiện thí nghiệm dùng xylose là đường chuẩn

2.2.2.4 Hoạt tính Protease

Dựa theo phương pháp của: Folin, O., and Ciocalteu, V., (1929) [58]

* Nguyên lý: Dựa trên sự bắt màu xanh tớm đặc trưng của amino acid khi có mặt của thuốc thử Folin-Ciocalteu,s Phenol, hấp thụ tốt nhất ở bước sóng 660nm

3 Axit tricloacetic 110mM Pha dung dịch TCA 6,1N (9,967g TCA/10ml nước cất siêu sạch), lấy 9ml TCA 6,1N pha với nước siêu sạch thành 500ml

4 Dung dịch thuốc thử Folin và Ciocateu,

s phenol Pha loãng Folin và Ciocateu,s phenol với nước cất siêu sạch theo tỉ lệ 1:3

5 Na2CO3 500mM : Cân 53g Na2CO3 trong 1000ml nước siêu sạch

6 Đệm acetat natri 10mM, acetat canxi 5mM: Cân 0,82g acetat natri +0,79 acetat canxi trong 1000ml nước siêu sạch (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 0,1M,

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ L-Tyrosine và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-3)

Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa OD660

và hàm lượng Tyrosine

y = 0.3536x - 0.0018

R2 = 0.9971

-0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

Hình 2-3 Đường chuẩn thể hiện mối tương giữa OD660 và hàm lượng

Tyrosine

Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng L-Tyrosine và giá trị OD660nm thu được là y=0.3536-0.0018 Trong đó: y là hàm lượng L-

Tyrosine trong 1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng Hệ số tương quan R2

= 0,9971 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ

* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của Protease:

+ Thí nghiệm: 250μl dung dịch 0,65% casein + 50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp Ủ ở 500

C trong 30 phút, bổ sung 250àl dung dịch TCA để dừng phản ứng

+ Đối chứng: 250μl dung dịch 0,65% casein + 250àl dung dịch TCA +50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp Ủ ở 500

C trong 30 phút

Li tâm mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng 10000 v/phỳt trong 5 phút Lấy 400μl dịch li tâm + 1ml Na2CO3 500mM + 200μl Folin Ủ 5-10phút, đo

OD660 Từ giá trị OD ta tính được lượng enzyme (IU/ml) được tạo ra nhờ

phương trình y=0.3536-0.0018 (trong đó: y là hàm lượng L-Tyrosine trong

1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng)

Qui ước: : Một đơn vị hoạt tính protease (IU) là lượng enzym cần thiết

để giải phóng 1 àmol acid amin (tớnh theo L-Tyrosine) trong một phút ở điều kiện thí nghiệm

2.2.2.5 Xác định hoạt tính kháng sinh

Dựa theo phương pháp của Egorov et al., (1969)

* Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định: Nuụi cỏc vi sinh vật kiểm định B subtilis, E.coli, Staphyllococcus sp., S aureus 7YB, S enteritidis, S typhymurium trên môi trường MPA dịch thể

* Chuẩn bị dịch trích ly từ hệ sợi của nấm: Bã sắn trồng nấm sò và nấm linh chi sau khi thu hái quả thể đem nghiền với nước bằng máy nghiền đồng thể tỉ lệ 1g cơ chất/5 ml nước, lọc bỏ sợi bằng giấy lọc, li tâm thu dịch trong để thử hoạt tính

* Thử hoạt tớnh kháng sinh: Trộn vi sinh vật kiểm định vào môi trường MPA thạch nóng chảy ở 40- 500

C, đổ vào đĩa petri, để nguội Dùng khoan nút chai (= 8mm) khoan 4 lỗ trên đĩa thạch Nhỏ 100àl dịch trích ly

từ hệ sợi của nấm vào lỗ thạch Để đĩa petri vào tủ lạnh 40

C từ 8h-12h cho dịch nấm khuếch tán vào thạch, sau đó nuôi trong tủ ấm 300

C trong 24h Hoạt tính kháng sinh được đánh giá bằng độ lớn vòng vô khuẩn (D-d, mm), trong đó D là đường kớnh vòng vô khuẩn, d là đường kớnh lỗ thạch

2.2.2.6 Phương pháp xác định Protein tổng số

Dựa theo phương pháp của Bradford (1976) [34]

*Nguyên lý: Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt của dịch nhuộm Bradford (thành phần chớnh là Coomassie Brilliant Blue G-

250 (CBB-250) có tớnh bám đặc hiệu đối với các amino acid trên bề mặt các phõn tử protein cần phõn tích Các phõn tử thuốc thử có chứa 6 nhúm phenyl và 2 nhúm acid sulfuric Do đó, các tương tác chủ yếu xảy ra với các đuôi kị nước (tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine), tích điện õm (arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc không đồng hoá trị

- Tiến hành dựng đường chuẩn BSA

- Bước 1: Chuẩn bị dung dịch thuốc thử như hướng dẫn nêu trên

- Bước 2: Chuẩn bị dung dịch BSA hàm lượng 0,1mg/ml bằng cách pha loãng 10 lần dung dịch mẹ đã chuẩn bị với H2O khử ion

- Bước 3: Tiến hành xây dựng đường chuẩn theo bảng sau:

Mẫu thử Thể tích dung dịch BSA (μl) Thể tích H 2 0 μl Thể tích thuốc thử Braford (μl)

- Bước 4: Ủ trong điều kiện phòng 15- 20 phút

- Bước 5: Đo độ hấp thụ ở 595 trên máy quang phổ Photometric UV

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ BSA (μg/ml) và giá trị OD595 được xõy dựng trên chương trình Microsoft Excel (Hình 2-4)

Từ đồ thị trên ta có phương trình đường chuẩn y= 23,184x-0,4094, với

y là lượng BSA có trong 1ml dịch, x là giá trị OD595 tương ứng Hệ số tương quan R2=0,9944 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ

- Thí nghiệm

Tiến hành thí nghiệm bằng cách lấy 100μl dung dịch protờin cần kiểm tra (đã pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm 1000μl thuốc thử Bradford Ủ trong 15-20 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở 595nm Hàm lượng protờin

được xác định theo phương trình y= 23,184x-0,4094 ở trên

2.2.2.7 Phương pháp xác định lượng đường tổng số

Dựa theo phương pháp phenol-acid-sulfuric của Dubois và cs (1956) [47]

* Nguyên lý: Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các ete methyl) không hoặc có các nhúm có tớnh khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý bằng phenol và H2SO4 đặc Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền

Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ D-xylose với giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Excel (Hình 2-5)

y = 2.4881x + 0.0016

R 2 = 0.9984

0 0.5 1 1.5 2

Hình 2-5 Đồ thị chuẩn D-xylose (theo phương pháp phenol-sulfuric)

Phương trình thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D-xylose và giá trị

OD490nm là y=2,4881x + 0,0016 Với y là lượng D-xylose trong 1ml dịch, x là

giá trị OD490nm tương ứng Hệ số tương quan R2 = 0,9984 chứng tỏ mối liên

hệ giữa x và y là rất chặt chẽ

- Thí nhiệm: Mẫu thí nghiệm được chiết và li tâm thu dịch trong Tiến hành phản ứng tương tự như trên với bước 1 được thay thế bằng mẫu thí nghiệm

có độ pha loãng phù hợp Lượng đường tổng số được xác định theo phương

trình y=2,4881x + 0,0016, trong đó y là lượng D-xylose trong 1ml dịch, x là

giá trị OD490nm tương ứng

2.2.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng tinh bột

Dựa theo phương pháp của Phạm Thị Trõn Chõu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường [20, 22]

* Nguyên lý: Dưới tác dụng của acid, thuỷ phõn hoàn toàn tinh bột thành glucose Định lượng đường khử, suy ra hàm lượng tinh bột có trong nguyên liệu

+ Dung dịch Fehling B: Hoà tan 200g muối Seignet, 150g NaOH trong 1 lít nước cất

Trước khi dùng pha Fehling A với Fehling B theo tỉ lệ 1/1 được thuốc thử Fehling

+ Dung dịch KMnO4 1/30N: cõn 1,06 g KMnO4, hoà tan trong 1 lít nước cất + Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: Hoà tan 50 g Fe2(SO4)3 vào 20 g

H2SO4 đậm đặc (d= 1,84) trong nước cất và dẫn tới 1 lít

- Thí nghiệm:

+ Cõn 2 g nguyên liệu, nghiền nhỏ, trộn đều, chuyển sang cốc Cho váo cốc

100 ml nước cất, khuấy đều trong khoảng từ 45 đến 60 phút, sau đó lọc tinh bột bằng phễu có giấy lọc Tráng lại cốc và rửa tinh bột nhiều lần bằng nước cất để loại toàn bộ đường khỏi tinh bột

+ Chuyển phễu lọc chứa tinh bột sang bình tam giác (250 ml), dùng đũa thuỷ tinh nhỏ chọc thủng giấy lọc, dồn tinh bột xuống bình tam giác bằng nước cất (khoảng 80-100 ml) Sau đó cho 125 ml HCl 25% vào bình tam giác, đun cách thuỷ 2,5 đến 3 giờ, thỉnh thoảng lắc bình Sau khi kết thúc thời gian thuỷ phõn tinh bột, làm nguội bình, trung hoà dung dịch thuỷ phõn bằng NaOH 10% Chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức (250 ml), dùng nước cất dẫn đến mức của bình Khuấy đều, lọc dung dịch, được dịch lọc trong suốt để định lượng đường khử (glucose, mantose )

+ Định lượng đường khử bằng phương pháp Bectrand [20]: Lấy 5 ml dịch lọc mẫu ở trên, hoà cùng 20 ml dung dịch Fehling Đun sôi hỗn hợp trong 3 phút (kể từ khi xuất hiện bọt đầu tiên), để cho kết tủa đỏ gạch lắng xuống, rửa kết tủa nhiều lần bằng nước cất nóng

Hoà tan kết tủa bằng dung dịch Fe2(SO4)3

Chuẩn độ bằng dung dịch KMnO4 1/30N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giõy

+ Sau khi xác định được khối lượng glucose có trong dung dịch phõn tích (mg) tớnh hàm lượng tinh bột (%) trong nguyên liệu theo công thức sau:

X: Lượng glucose (mg) có trong dung dịch phõn tích

V1: Số ml dung dịch thuỷ phõn (250ml)

V2: Số ml dung dịch đem phõn tích

g: Lượng nguyên liệu đem phõn tích (mg)

0,9: Hệ số tớnh chuyển từ glucose thành tinh bột

2.2.2.9 Phương pháp xác định hàm lượng Cellulose

+ Phần A: 1g đem sấy khô ở 800

+ Phần B: 1g, xử lý bằng dung dịch KOH 24% ở 250C trong 4 giờ Sau đó rửa sạch bằng nước và sấy khô ở 800C

+ Phần C: Nguyên liệu ở phần B được xử lý với dung dịch 72% H2SO4 trong

3 giờ Sau đó rửa lại bằng dung dịch 5% H2SO4 và rửa sạch bằng nước Sấy khô ở 800C

Tớnh toán lượng Hemicellulose, Cellulose và Lignin trong 2 gam theo công thức sau:

A-B: Hemicellulose

X.0,9.V1.100

%X=

V2.g

B-C: Cellulose

C: Lignin

2.2.2.10 Xác định hàm lượng các chất khoáng còn lại sau lên men

Hàm lượng các chất khoáng được xác định bằng máy PC Multi Direct, hóng Aqualytic (Đức) dùng xác định 31 chỉ tiêu trong nước Phương pháp

được tiến hành dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất như trình bày dưới đõy

Cõn lần đầu 1g mỗi loại mẫu nghiền nhỏ, cho thêm 100ml nước, khuấy bằng máy khuấy từ trong 4-5 giờ sau đó tiến hành các bước tuỳ vào loại khoáng cần thử mà các bước tiến hành như phần dưới

Nếu kết quả nằm ngoài khối lượng cho phép của máy thử, tuỳ trường hợp ta tăng hay giảm lượng mẫu ban đầu và làm lại các bước

* Hàm lượng các gốc phosphate

+ Đổ 10ml nước đã loại ion vào ống nghiệm (24mm) của máy, đậy nắp + Bỏ vào buồng đo, đảm bảo 2 đỉnh tam giác thẳng hàng

+ Ấn Zero

+ Cho thêm 1 viên Phosphate No.1 LR vào lọ mẫu Dùng que khuấy chuyên

dụng khuấy cho tan

+ Cho thêm 1 viên Phosphate No.2 LR vào lọ mẫu Dùng que khuấy chuyên

dụng khuấy cho tan

+ Đậy nắp ống nghiệm lại lắc nhẹ cho đều

+ Bỏ vào buồng đo, đảm bảo 2 đỉnh tam giác thẳng hàng

+ Ấn TEST chờ 10 phút

+ Kết quả chỉ ra trên màn hình là lượng PO4 tớnh bằng mg/l

* Hàm lượng gốc Sulphat (SO 4