Dựa theo phương pháp phenol-acid-sulfuric của Dubois và cs. (1956) [47]. * Nguyên lý: Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các ete methyl) không hoặc có các nhúm có tớnh khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý bằng phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền.
* Tiến hành thí nghiệm
- Dung dịch 5% phenol: Làm tan phenol ở 500C và bổ sung 5ml phenol lỏng vào 95ml H2O.
- Dung dịch H2SO4 đậm đặc.
- Dung dịch gốc 10àmol/ml D-xylose, sau đó pha loóng thành các nồng độ 0,2 đến 2,0 àmol/ml.
- Tiến hành dựng đường chuẩn D-xylose: Lấy 0,5ml mỗi nồng độ D-xylose, sau đó bổ sung lần lượt 0,5ml dung dịch 5% phenol, 2,5ml H2SO4 đậm đặc. Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Đo ở bước sóng 490nm thu được các giá trị OD tương ứng.
Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ D-xylose với giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Excel (Hình 2-5)
y = 2.4881x + 0.0016 R2 = 0.9984 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A490nm N ồ n g đ ộ x yl o se ( m ic ro m o l/m l)
Hình 2-5. Đồ thị chuẩn D-xylose (theo phương pháp phenol-sulfuric)
Phương trình thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D-xylose và giá trị OD490nm là y=2,4881x + 0,0016. Với y là lượng D-xylose trong 1ml dịch, x là giá trị OD490nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9984 chứng tỏ mối liên hệ giữa x và y là rất chặt chẽ.
- Thí nhiệm: Mẫu thí nghiệm được chiết và li tâm thu dịch trong. Tiến hành phản ứng tương tự như trên với bước 1 được thay thế bằng mẫu thí nghiệm có độ pha loãng phù hợp. Lượng đường tổng số được xác định theo phương trình y=2,4881x + 0,0016, trong đó y là lượng D-xylose trong 1ml dịch, x là giá trị OD490nm tương ứng.