Dựa theo phương pháp của: Folin, O., and Ciocalteu, V., (1929) [58]. * Nguyên lý: Dựa trên sự bắt màu xanh tớm đặc trưng của amino acid khi có mặt của thuốc thử Folin-Ciocalteu,s Phenol, hấp thụ tốt nhất ở bước sóng 660nm.
* Tiến hành thí nghiệm: + Chuẩn bị hoá chất:
1. Đệm Phosphate 50mM, pH=7.5
2. Dung dịch casein 0,65% trong 50mM đệm Phosphate: Cân 0,65g casein vào 100ml dung dịch đệm trên, đun nóng nhẹ đến 80-900
C trong 10 phút và khuấy cho tan (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 1M và HCl 1M).
3. Axit tricloacetic 110mM. Pha dung dịch TCA 6,1N (9,967g TCA/10ml nước cất siêu sạch), lấy 9ml TCA 6,1N pha với nước siêu sạch thành 500ml. 4. Dung dịch thuốc thử Folin và Ciocateu,
s phenol. Pha loãng Folin và Ciocateu,s phenol với nước cất siêu sạch theo tỉ lệ 1:3.
5. Na2CO3 500mM : Cân 53g Na2CO3 trong 1000ml nước siêu sạch
6. Đệm acetat natri 10mM, acetat canxi 5mM: Cân 0,82g acetat natri +0,79 acetat canxi trong 1000ml nước siêu sạch (chỉnh pH 7,5 bằng NaOH 0,1M, CH3COOH 0,1M).
7. L-Tyrosine 1μmol/ml: cõn 1,81mg tyrosine pha trong 10ml nước siêu sạch, dùng máy khuấy từ khuấy đều cho tan.
+ Dựng đường chuẩn L-Tyrosine: Pha dung dịch gốc 1μmol/ml L-Tyrosine trong đệm 50mM Phosphate. Từ đó pha loóng thành các nồng độ 0.01; 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0.1; 0.12; 0.14; 0.16; 0.18; 0.2 (μmol/ml). Lấy 400μl Tyrosine + 1000μl Na2CO3 + 200μl Folin. Ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đo ở bước sóng λ660nm.
Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ L-Tyrosine và giá trị OD được xõy dựng nhờ chương trình Microsoft Excel (hình 2-3)
Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa OD660 và hàm lượng Tyrosine y = 0.3536x - 0.0018 R2 = 0.9971 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.2 0.4 0.6 A 660 H àm l ư ợ ng Ty ros ine (m ic rom ol ) Hàm lượng Tyrosine Linear (Hàm lượng Tyrosine)
Hình 2-3. Đường chuẩn thể hiện mối tương giữa OD660 và hàm lượng Tyrosine
Phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng L-Tyrosine và giá trị OD660nm thu được là y=0.3536-0.0018. Trong đó: y là hàm lượng L-
Tyrosine trong 1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9971 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
* Đặt thí nghiệm xác định hoạt tớnh của Protease:
+ Thí nghiệm: 250μl dung dịch 0,65% casein + 50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút, bổ sung 250àl dung dịch TCA để dừng phản ứng.
+ Đối chứng: 250μl dung dịch 0,65% casein + 250àl dung dịch TCA +50μl dịch enzyme đã pha loãng phù hợp. Ủ ở 500
C trong 30 phút.
Li tâm mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng 10000 v/phỳt trong 5 phút. Lấy 400μl dịch li tâm + 1ml Na2CO3 500mM + 200μl Folin. Ủ 5-10phút, đo OD660. Từ giá trị OD ta tính được lượng enzyme (IU/ml) được tạo ra nhờ phương trình y=0.3536-0.0018 (trong đó: y là hàm lượng L-Tyrosine trong
1ml dịch; x là giá trị OD660nm tương ứng).
Qui ước: : Một đơn vị hoạt tính protease (IU) là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 àmol acid amin (tớnh theo L-Tyrosine) trong một phút ở điều kiện thí nghiệm.