Nghiên Cứu Qui Trình Phân Lập Genistein Từ Hạt Đậu Nành

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ********** NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP GENISTEIN TỪ HẠT ĐẬU NÀNH Giáo viên hướng dẫn: ThS Phùng Văn Trung Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 12 năm 2009 i TÓM TẮT Đề tài thực phòng Các Hợp Chất Thiên Nhiên-Viện Công Nghệ Hóa Học-Viện Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam Thành Phố Hồ Chí Minh Đề tài có tên: “ Nghiên Cứu Qui Trình Phân Lập Genistein từ Hạt Đậu Nành” Đề tài tiến hành từ tháng đến tháng 12 năm 2009 Để phân lập hợp chất genistein từ hạt đậu nành, trước tiên cần chọn dung môi thích hợp sau đậu nành tiến hành ngâm dung môi Sau 24 thu dịch chiết đem cô quay để dạng Cao Cao chiết đem chạy sắc ký cột đồng thời kiểm tra song song với sắc ký lớp mỏng nhằm thu hợp chất cần phân tách Sau phân tách hợp chất tiếp tục tinh chế lại nhiều lần để hợp chất tinh khiết Chất gửi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhằm xác định cấu trúc chất Sau tháng làm đề tài kết đạt được: phân lập 172mg GDN-3 từ hạt đậu nành, xác định cấu trúc GDN-3 genistein, định tính nhóm hợp chất có đậu nành (alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, đường khử…), thử hoạt tính kháng oxy hóa genistein iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix Chương 1:MỞ ĐẦU Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC 2.1.1 Tên 2.1.2 Mô tả thực vật đậu nành 2.1.3 Phân bố-sinh thái-cách trồng trọt 2.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 2.2.1 Y học dân gian Việt Nam 2.2.2 Y học hóa sinh đại 2.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 11 2.3.1 Protein 11 2.3.2 Lipid 11 2.3.3 Glucid 11 2.3.4 Chất khoáng 12 2.3.5 Vitamin 12 2.3.6 Isoflavone glycoside 12 2.3.7 Saponine 14 2.3.8 Phytosterol 15 iv 2.3.9 Chất ức chế protease 16 2.3.10 Phytate 16 2.4 GENISTEIN 17 Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN LIỆU 20 20 3.1.1 Hạt đậu nành: 20 3.1.2 Dụng cụ - hóa chất: 20 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.2.1 Khảo sát sơ thành phần hóa học hạt đậu nành 21 3.2.2 Các phương pháp chiết xuất 29 3.2.3 Phương pháp phân lập tinh chế hợp chất 30 3.2.4 Xác định cấu trúc hóa học 32 3.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 32 Chương 4: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ 36 4.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HẠT ĐẬU NÀNH 36 4.1.1 Phương pháp tiến hành 36 4.1.2 Kết 37 4.1.3 Nhận xét 39 4.2 PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC HỢP CHẤT 40 4.2.1 Chiết xuất 40 4.2.2 Phân lập tinh chế chất từ cao EtOAc 40 4.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA GDN-3 44 4.4 QUY TRÌNH PHÂN LẬP GENISTEIN TỪ HẠT ĐẬU NÀNH 49 4.5 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA 50 Chương 5: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 53 5.1 KẾT LUẬN 53 5.2 KIẾN NGHỊ 53 Tài liệu tham khảo 54 v DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CHCl3: Chloroform 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance d: Doublet (NMR) dd: Doublet of doublet (NMR) DEPT: Detortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO: Dimethyl sulfoxide DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50: 50% Efficient Concentration Value IC50: 50% Inhibitory Capacity Value EtOAc: Ethyl acetate EtOH: Ethanol C-NMR: H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation IR: Infrared J: Coupling constant m: Multiplet (NMR) MeOH: Methanol MS: Mass Spectrometry NMR: Nuclear Magnetic Resonance EP: Ether petrole vi ppm: Parts per million Rf: Retention factor s: Singlet (NMR) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) UV: Ultraviolet (Tia tử ngoại, tia cực tím) δ: Chemical shift HDL: Hight Density Lipid LDL: Low Density Lipid ATP: Adenosine Triphosphate vii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG Trang Bảng 4.1: Kết khảo sát sơ thành phần hóa học chất có hạt đậu nành 37 Bảng 4.2: Kết sắc ký đồ phân đoạn thu sau khai triển sắc ký cột cao EtOAc 42 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ 13C-NMR DEPT CỦA GDN-3 45 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR HMBC GDN-3 46 Bảng 4.5: Bảng so sánh liệu phổ GDN-3 genistein công bố 47 Bảng 4.6: Cách pha mẫu 51 Bảng 4.7: Độ hấp thu mẫu thử mẫu chuẩn 517nm 52 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH Trang Hình 2.1: Cây đậu nành rễ Hình 2.2: Hoa đậu nành Hình 2.3: Lá đậu nành Hình 2.4: Quả đậu nành tươi Hình 2.5: Quả hạt đậu nành khô Hình 2.6: Cấu trúc isoflavone có đậu nành 12 Hình 2.7: Cấu trúc glycoside isoflavone 13 Hình 2.8: Cấu trúc hóa học soyasaponin 14 Hình 2.9: Cấu trúc hóa học cholesterol phytosterol 15 Hình 2.10: Cấu trúc acid phytic 16 Hình 2.11: Genistein 17 Hình 2.12: Sản phẩm Genistein số hợp chất Isoflavones 19 Hình 3.1: Hạt đậu nành 20 Hình 4.1: Kết định tính hợp chất có hạt đậu nành 39 Hình 4.2: Sắc ký cột thường cao EtOAc 41 Hình 4.3: Sắc ký lớp mỏng cao EtOAc, hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) 41 Hình 4.4: Dạng tinh thể GDN-3 43 Hình 4.5: TLC GDN-3 hệ CHCl3-MeOH (9:1) 43 Hình 4.6: Dạng bột GDN-3 43 ix DANH MỤC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 4.1: Chuẩn bị dịch chiết định tính 36 Sơ đồ 4.2: Qui trình phân lập cao EtOAc 40 Sơ đồ 4.3: Phân lập chất từ cao EtOAc 43 Sơ đồ 4.4: Qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành x Chương 1: MỞ ĐẦU Ngày phụ nữ đóng vai trò quan trọng gia đình mà đảm nhiệm công việc xã hội Vì tốc độ lão hóa thể trở nên nhanh Một nguyên nhân quan trọng ảnh hưởng đến trình lão hóa phụ nữ thiếu hụt hormon estrogen (nội tiết tố nữ) Như biết, hormon nữ giới gồm hai nhóm chính: - Các estrogen mà chủ yếu estradiol có tác dụng tạo nên vẻ đẹp quyến rũ nữ giới, tạo vóc dáng, da mịn màng tác nhân định cho chu kỳ kinh nguyệt, tạo trứng chín rụng để chuẩn bị cho thụ thai trứng gặp tinh trùng - Các progestrogen mà đại diện progesteron có chức phận bảo vệ thai nhi phát triển đảm bảo tiết sữa cho bú bà mẹ nuôi Các hormon hình thành thể tuổi dậy đạt hàm lượng cao tuổi 25 Sau hàm lượng chúng giảm dần, thời kỳ mãn kinh sau sinh Điều gây nhiều triệu chứng bất lợi cho nữ giới như: chứng đỏ mặc, huyết áp lên xuống thất thường gây khó chịu, tính khí thất thường, bị nhiều stress, da khô, có nhiều vết nhăn, loãng xương, dòn dễ gãy, vỡ…, thể nhanh lão hóa Để khắc phục tình trạng trên, y học đại sử dụng “ liệu pháp thay hormon” (Hormone replacement Therapy; HRT) tức sử dụng hormon có nguồn gốc tổng hợp Tuy nhiên lại gây số nguy lớn ung thư vú, ung thư màng tử cung, buồng trứng, huyết khối tĩnh mạch đột qụy thiếu máu cục bộ, tăng nguy tim mạch 12 Nakamori T (2002) Antiobesity effects of soy protein and soy peptides Food Style 13 NTP-CEHR (2006), NTP-CEHR breif on the potential human reproductive and developmental effects of genistein 14 QIJU WU (2003), Purification and antioxidant activities of soybean isoflavones: 1-21 15 Rowell C., Carpenter M., Lamartiniere C.A (2005) Chemoprevention ò breast cancer, protiomic decovery of genistein action in the rat mammary gland J Nutr 16 Russo A., Cardile V., Lombardo L., Vanella L., Acquaviva R (2006) Genistin inhibits UV light-induced plasmid DNA damage and cell growth in human melanoma cells J Nutr Biochem, 172:103-108 TÀI LIỆU INTERNET 17 http://www.americannutrition.com/store/nowfoods/NF3287.html 18 http://argiviet.com/nd/905-ky-thuat-canh-tac-cay-dau-nanh 19 http://www.ehponline.org/member/2006/8700/8700.html 20 http://www.evitamins.com/product.asp?pid 21 http://www.fr.wikipedia.org/wiki/soja 22 http://www.riteshape.com/women2.html 23 http://www.surprmed.cosmetic.com 24 http://www.thuvienkhoahoc.com/tusach/Genistein 54 DANH SÁCH CÁC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: CÁC PHỔ CỦA GDN-3 Trang Phụ lục 1.1a 1.1b: Phổ 1H-NMR PL1 Phụ lục 1.2a 1.2b: Phổ 13C-NMR PL3 Phụ lục 1.3a 1.3b: Phổ DEPT PL5 Phụ lục 1.4a, 1.4b 1.4c: Phổ HMBC PL7 Phụ lục 1.5a 1.5b: Phổ HSQC PL10 Phụ lục 1.1a Phụ lục 1.1b Phụ lục 1.2a Phụ lục 1.2b Phụ lục 1.3a Phụ lục 1.3b Phụ lục 1.4a Phụ lục 1.4b Phụ lục 1.5a Phụ lục 1.5b [...]... sống Đậu nành có chứa các chất có hoạt tính tương tự hormon estrogen và an toàn hơn nhiều Đó là các isoflavone, còn gọi là “ estrogen thực vật” (phytoestrogen) Hoạt chất thuộc nhóm isoflavone chủ yếu có trong đậu nành là genistein Nhằm phân lập một hợp chất quan trọng và có giá trị này, đề tài luận văn với tên Nghiên cứu qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành Mục tiêu của đề tài gồm: 1 Phân lập. .. đậu nành Mục tiêu của đề tài gồm: 1 Phân lập Genistein từ hạt đậu nành 2 Phân tích định các nhóm hợp chất từ hạt đậu nành 3 Chứng minh cấu trúc 4 Thử hoạt tính kháng oxi hóa của Genistein bằng phương pháp DPPH 2 Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC [1, 11, 20, 23] 2.1.1 Tên Tên khoa học: Glycine max (L.) Merr Tên khác: đậu nành, đậu tương, hoàng đậu miêu Tên nước ngoài: soja (Pháp), soya (Anh,... đậu có rất nhiều lông mềm, mọc thõng xuống, dài khoảng 3-4 cm, hơi thắt lại giữa các hạt, hạt 2-5 cm, màu trắng vàng, tùy loài 3 Cây đậu nành có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác Điều này có được là nhờ hoạt động cố định N2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ đậu Hình 2.1: Cây đậu nành và bộ rễ Hình 2.2: Hoa đậu nành 4 Hình 2.3: Lá đậu nành Hình 2.4: Quả đậu nành. .. proteaseinhibitor Tuy nhiên, trong hạt đậu nành còn có chứa khoảng 1% lipoxygenase Chất này oxy hóa chất béo không bão hòa thành aldehyd mạch ngắn, gây ra vị đắng khó chịu cho các sản phẩm từ đậu nành 2.3.2 Lipid Đậu nành chứa ít lipid nhưng trong hạt đậu nành chứa 18-20% lipid toàn phần, trong đó đến 85% là các hợp chất của acid béo không bão hòa (acid linoleic, acid linolenic) Trong đậu nành cũng chứa lượng đáng... trong cồn • Ether petrole • Chloroforme • Methanol • Diethylether • Nước cất • Iod 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 3.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt đậu nành [2, 3, 5] Nguyên tắc: chiết tách hỗn hợp các chất có trong hạt đậu nành thành ba phân đoạn theo độ phân cực tăng dần bằng cách chiết hạt đậu nành lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol và nước Sau đó xác định các nhóm hợp chất... Quả và hạt đậu nành khô 5 2.1.3 Phân bố- sinh thái- cách trồng trọt Đậu nành là giống cây trồng cổ điển Cây đậu nành được biết có nguồn gốc xa xưa từ Trung Quốc và được coi là cây thực phẩm cho đời sống con người từ hơn 4000 năm trước, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ 8, vào nhiều thế kỷ sau có mặt ở các nước Châu Á như Thái Lan, Malaisia, Korea và Việt Nam Cây đậu nành có... vậy phụ nữ chuẩn bị có thai được khuyến cáo nên tránh ăn những thức ăn có chứa đậu nành trong một vài ngày • Một số sản phẩm về Genistein trên thị trường thế giới: 18 Hình 2.12: Sản phẩm Genistein và một số hợp chất Isoflavone 19 Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN LIỆU: 3.1.1 Hạt đậu nành Hạt đậu nành được mua ở siêu thị sản phẩm của công ty trách nhiệm hữu hạn thương mại và... trồng đậu nành Giống như các cây họ đậu khác, đậu nành gieo trồng bằng hạt Đậu nành thường được trồng luân canh với cây bắp Hạt được gieo theo rãnh ở độ sâu 3-4 cm (nếu đất đủ ẩm) hoặc 4-6 cm (nếu đất khô) Khoảng cách giữa các rãnh thường từ 30-45 cm, giữa các cây trong rãnh từ 5-20 cm Mỗi vụ cần xới đất làm cỏ 2-3 lần Lần thứ nhất khi cây có 2-3 lá kép, kết hợp bón thúc cho mỗi ha 50 kg urê (tránh để phân. .. estrogen Trong đậu nành, có các hợp chất giống như estrogen gọi là phytoestrogen tức là estrogen thực vật Thử nghiệm trên phụ nữ mãn kinh, khi nồng độ estrogen giảm thường xuất hiện các cơn bốc hỏa người rạo rực, khó chịu Dùng đậu nành 25g (2 cốc sữa đậu nành hoặc 1 bì đậu phụ) sẽ làm giảm các biểu hiện trên Các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh 2 chất phytoestrogen trong đậu nành là daidzein và genistein ngoài... và cộng sự (2005): Tổng hợp từ 23 nghiên cứu từ 1995-2002 đánh giá tác động phòng chống nguy cơ bệnh tim mạch của protein và isoflavone đậu nành Protein đậu nành làm giảm cholesterol máu, giảm LDL, giảm triglycerid một cách hiệu quả, đồng thời làm tăng HDL West và cộng sự (2005): 18 phụ nữ mãn kinh và 14 đàn ông cao cholesterol máu tuân theo chế độ ăn 25g/ngày protein đậu nành có bổ sung 90mg isoflavone ... Nhằm phân lập hợp chất quan trọng có giá trị này, đề tài luận văn với tên Nghiên cứu qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành Mục tiêu đề tài gồm: Phân lập Genistein từ hạt đậu nành Phân. .. Minh Đề tài có tên: “ Nghiên Cứu Qui Trình Phân Lập Genistein từ Hạt Đậu Nành Đề tài tiến hành từ tháng đến tháng 12 năm 2009 Để phân lập hợp chất genistein từ hạt đậu nành, trước tiên cần chọn... dịch chiết định tính 36 Sơ đồ 4.2: Qui trình phân lập cao EtOAc 40 Sơ đồ 4.3: Phân lập chất từ cao EtOAc 43 Sơ đồ 4.4: Qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành x Chương 1: MỞ ĐẦU Ngày phụ nữ