Nghiên Cứu Qui Trình Phân Lập Genistein Từ Hạt Đậu Nành

Sau 4 tháng làm đề tài kết quả đạt được: phân lập được 172mg GDN-3 từ hạt đậu nành, xác định được cấu trúc GDN-3 là genistein, định tính được các nhóm hợp chất có trong đậu nành alkaloid

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

cô quay để được dạng Cao Cao chiết này đem chạy sắc ký cột đồng thời kiểm tra song song với sắc ký lớp mỏng nhằm thu được hợp chất cần phân tách Sau khi phân tách được hợp chất tiếp tục tinh chế lại nhiều lần để được hợp chất sạch tinh khiết Chất sạch sẽ được gửi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân nhằm xác định cấu trúc của chất sạch

Sau 4 tháng làm đề tài kết quả đạt được: phân lập được 172mg GDN-3 từ hạt đậu nành, xác định được cấu trúc GDN-3 là genistein, định tính được các nhóm hợp chất có trong đậu nành (alkaloid, flavonoid, steroid, saponin, đường khử…), thử hoạt tính kháng oxy hóa của genistein

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v

2.1.3 Phân bố-sinh thái-cách trồng trọt 6

2.2.2 Y học và hóa sinh hiện đại 7

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt đậu nành 21

3.2.2 Các phương pháp chiết xuất 29

3.2.3 Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất 30

3.2.4 Xác định cấu trúc hóa học 32

3.2.5 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa 32

4.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA HẠT ĐẬU

4.2.2 Phân lập và tinh chế các chất từ cao EtOAc 40

4.4 QUY TRÌNH PHÂN LẬP GENISTEIN TỪ HẠT ĐẬU NÀNH 49

5.1 KẾT LUẬN 53 5.2 KIẾN NGHỊ 53 Tài liệu tham khảo 54

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR: Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance

DEPT: Detortionless Enhancement by Polarization Transfer

DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

EC50: 50% Efficient Concentration Value

IC50: 50% Inhibitory Capacity Value

1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation

ppm: Parts per million

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG Trang Bảng 4.1: Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các chất có trong hạt

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH Trang Hình 2.1: Cây đậu nành và bộ rễ 4

Hình 2.4: Quả đậu nành tươi 5

Hình 2.6: Cấu trúc của các isoflavone có trong đậu nành 12

Hình 2.9: Cấu trúc hóa học các cholesterol và các phytosterol 15

Hình 2.12: Sản phẩm Genistein và một số hợp chất Isoflavones 19

Hình 4.1: Kết quả định tính các hợp chất có trong hạt đậu nành 39

Hình 4.3: Sắc ký lớp mỏng cao EtOAc, hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) 41

DANH MỤC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ Trang

Sơ đồ 4.4: Qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành

Chương 1: MỞ ĐẦU

Ngày nay phụ nữ không những đóng vai trò quan trọng trong gia đình mà còn đảm nhiệm công việc ngoài xã hội Vì vậy tốc độ lão hóa của cơ thể sẽ trở nên nhanh hơn Một trong những nguyên nhân quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lão hóa của phụ nữ là sự thiếu hụt hormon estrogen (nội tiết tố nữ)

Như đã biết, các hormon của nữ giới gồm hai nhóm chính:

- Các estrogen mà chủ yếu là estradiol có tác dụng tạo nên vẻ đẹp quyến rũ của

nữ giới, tạo vóc dáng, làn da mịn màng và là tác nhân quyết định cho các chu kỳ kinh nguyệt, tạo trứng chín và rụng để chuẩn bị cho sự thụ thai nếu trứng gặp tinh trùng

- Các progestrogen mà đại diện là progesteron có chức phận bảo vệ thai nhi phát triển và đảm bảo sự tiết sữa cho con bú ở các bà mẹ nuôi con

Các hormon này được hình thành trong cơ thể ở tuổi dậy thì và đạt hàm lượng cao nhất ở tuổi 25 Sau đó hàm lượng của chúng giảm dần, nhất là ở thời kỳ mãn kinh hoặc sau khi sinh Điều này gây ra nhiều triệu chứng bất lợi cho nữ giới như: chứng đỏ mặc, huyết áp lên xuống thất thường gây ra khó chịu, tính khí thất thường,

bị nhiều stress, da khô, có nhiều vết nhăn, loãng xương, dòn dễ gãy, vỡ…, cơ thể nhanh lão hóa

Để khắc phục tình trạng trên, y học hiện đại đã và đang sử dụng “ liệu pháp thay thế hormon” (Hormone replacement Therapy; HRT) tức sử dụng hormon có nguồn gốc tổng hợp Tuy nhiên lại gây ra một số nguy cơ lớn như ung thư vú, ung thư màng trong tử cung, buồng trứng, huyết khối tĩnh mạch và đột qụy do thiếu máu cục bộ, tăng nguy cơ tim mạch

Các hợp chất thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng và được cho an toàn khi

sử dụng Do đó con người ngày càng quay về với thiên nhiên nơi bắt đầu của mọi sự sống

Đậu nành có chứa các chất có hoạt tính tương tự hormon estrogen và an toàn hơn nhiều Đó là các isoflavone, còn gọi là “ estrogen thực vật” (phytoestrogen) Hoạt chất thuộc nhóm isoflavone chủ yếu có trong đậu nành là genistein

Nhằm phân lập một hợp chất quan trọng và có giá trị này, đề tài luận văn với tên “Nghiên cứu qui trình phân lập Genistein từ hạt đậu nành”

Mục tiêu của đề tài gồm:

1 Phân lập Genistein từ hạt đậu nành

2 Phân tích định các nhóm hợp chất từ hạt đậu nành

3 Chứng minh cấu trúc

4 Thử hoạt tính kháng oxi hóa của Genistein bằng phương pháp DPPH

Chương 2: TỔNG QUAN

2.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC [1, 11, 20, 23]

2.1.1 Tên

Tên khoa học: Glycine max (L.) Merr

Tên khác: đậu nành, đậu tương, hoàng đậu miêu

Tên nước ngoài: soja (Pháp), soya (Anh, Tây Ban Nha), soia (Ý),…

Họ: Fabaceae (họ đậu)

2.1.2 Mô tả thực vật cây đậu nành

Cây thân thảo đứng, sống hàng năm, cao 40-80 cm Thân cành mảnh, có lông màu trắng Lá kép mọc so le, gồm 3 lá chét hình bầu dục hoặc trái xoan, gốc tròn, đầu nhọn, dài 3-12 cm, rộng 2-8 cm, lá chét bên lệch, hai mặt có lông rải rác Lá rụng trước khi quả chín

Cụm hoa mọc thành chùm ngắn ở kẽ lá, hoa nhỏ màu tím hoặc màu trắng, đài hình chuông, phủ lông mềm, tràng có cánh cờ rộng, không có tai, nhị một bó, bầu có lông Tràng hoa gồm 5 cánh hoa (cánh cờ to nhất ở phía sau, phủ lên hai cánh bên, hai cánh này lại phủ lên hai cánh trước Hai cánh trước dính nhau thành lòng máng) Bầu một lá noãn Bộ nhị gồm 10 nhị, trong đó 9 nhị dính, nhị thứ mười rời, ở phía sau Hoa lưỡng tính, tự giao Có hiện tượng thụ phấn chéo

Có 3-8 quả trên một chùm Qủa đậu có rất nhiều lông mềm, mọc thõng xuống, dài khoảng 3-4 cm, hơi thắt lại giữa các hạt, hạt 2-5 cm, màu trắng vàng, tùy loài

Cây đậu nành có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác Điều này có được là nhờ hoạt động cố định N2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng

sinh trên rễ cây họ đậu

Hình 2.1: Cây đậu nành và bộ rễ

Hình 2.2: Hoa đậu nành

Hình 2.3: Lá đậu nành

Hình 2.4: Quả đậu nành tươi Hình 2.5: Quả và hạt đậu nành khô

2.1.3 Phân bố- sinh thái- cách trồng trọt

Đậu nành là giống cây trồng cổ điển Cây đậu nành được biết có nguồn gốc

xa xưa từ Trung Quốc và được coi là cây thực phẩm cho đời sống con người từ hơn

4000 năm trước, sau đó được truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ 8, vào nhiều thế kỷ sau có mặt ở các nước Châu Á như Thái Lan, Malaisia, Korea và Việt Nam Cây đậu nành có mặt ở Châu Âu vào đầu thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ là thế kỷ 18 Hàng năm trên Thế Giới có khoảng 52,6 triệu hecta trồng đậu nành, với tổng sản lượng 96 triệu tấn Hoa Kỳ là nước đứng đầu Thế Giới (48% tổng diện tích với 56% tổng sản lượng), Braxin (10 triệu ha, 16 triệu tấn), Trung Quốc (7,5 triệu ha, 10 triệu tấn)… Diện tích và sản lượng đậu nành của Việt Nam còn ở mức rất khiêm tốn (14,900 ha; 12,000 tấn), song bước đầu đã có sản phẩm tham gia vào thị Thế Giới

Cây đậu nành thích hợp với điều kiện khí hậu từ nhiệt đới, cận nhiệt đới đến

cả các vùng có khí hậu tương đối lạnh Tất cả các loại đất có pH 6-7 đều có thể trồng đậu nành Giống như các cây họ đậu khác, đậu nành gieo trồng bằng hạt Đậu nành thường được trồng luân canh với cây bắp

Hạt được gieo theo rãnh ở độ sâu 3-4 cm (nếu đất đủ ẩm) hoặc 4-6 cm (nếu đất khô) Khoảng cách giữa các rãnh thường từ 30-45 cm, giữa các cây trong rãnh

từ 5-20 cm Mỗi vụ cần xới đất làm cỏ 2-3 lần Lần thứ nhất khi cây có 2-3 lá kép, kết hợp bón thúc cho mỗi ha 50 kg urê (tránh để phân dính lên lá) Lần thứ hai xới sâu 5-7 cm và vun gốc khi cây đậu tương chuẩn bị ra hoa (sau lần một khoảng 12-

15 ngày) Nếu trời mưa, đất đóng váng có thể xới lần thứ ba Sau khi cây ra hoa không nên xới, vun đất vì ảnh hưởng tới việc ra hoa kết quả

2.2 TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

2.2.1 Y học dân gian Việt Nam [1]

Từ lâu đậu nành cùng với một số thảo dược có sẵn trong tự nhiên được dân gian dùng làm thuốc để phục hồi sức khỏe và đã đúc kết thành các bài thuốc cổ truyền để lưu giữa và truyền lại cho ngày sau

• Bài thuốc có đậu nành:

- Chữa cơ thể suy nhược, ra mồ hôi trộm: đậu nành 100g, hạt tiểu mạch lép 50g, đại táo 5 quả, nước vừa đủ, nấu chín, ăn trong ngày

- Chữa thần kinh suy nhược, kém trí nhớ, hồi hộp, mệt mỏi, kém ăn, mất

ngủ: đậu nành 5g, liên nhục 8g, hoài sơn 4g, ý dĩ 4g, sa nhân 0,8g, sơn tra 2g, cẩn tích 4g, toan táo nhân 1,2g, tá dược vừa đủ, làm viên chia 2-3 lần uống trong ngày Dùng nhiều ngày

- Thuốc dinh dưỡng cho trẻ em: bột đậu nành phối hợp với bột ngũ cốc và

bột ca cao nấu thành bột đặc cho trẻ em ăn Tỷ lệ theo kiểu khẩu vị và số lượng theo nhu cầu của trẻ Có thể phối hợp bột đậu nành với bột thịt cóc cho trẻ an chữa còi xương suy dinh dưỡng

2.2.2 Y học và hóa sinh hiện đại [1, 8, 9, 10, 11, 12]

2.2.2.1 Tác dụng bảo vệ gan

Tác dụng của các soyasaponin 1,2,3 và 4 đã được thử nghiệm theo phương pháp nuôi cấy tế bào gan Hoạt tính bảo vệ giảm dần theo thứ tự soyasaponin 3>4>1>2 Kết quả cho thấy các soyasaponin có 3 đơn vị đường Tác dụng bảo vệ gan là do một phân tử đường liên kết với aglycon ở C3 Soyasaponin 3 mạnh hơn soyasaponin 4 có lẽ là do sự hiện diện của một đơn vị galactosyl mang nhóm hydroxymethyl (CH2OH)

Kinjo và cộng sự (1998): Điều trị trên in vitro các tế bào gan chuột bị gây tổn

thương bằng soysaponin B Tác động của hai nhóm soyasaponin 1 và 2 tương đương trong khi tác động của nhóm 3 và nhóm 4 thì hiệu quả hơn nhiều

Jun và cộng sự (2002): Điều trị các tế bào gan người bị ung thư bằng soyasaponin Kết quả các soyasaponin ức chế sự đột biến gen tùy thuộc vào liều và ngăn cản sự hình thành khối u

2.2.2.2 Tác dụng ức chế monoaminoxydase A (MAO)

Nghiên cứu hoạt tính của MAO dùng serotonin làm cơ chất cho thấy Flavonoid của đậu nành có tác dụng ức chế MAO

2.2.2.3 Tác dụng chống oxy hóa (antioxydant)

Sự peroxyd hóa lipid được tiến hành trên microsom tim và gan của chuột cống trắng Dùng adriamycin là chất sinh ra các gốc tự do, nên làm tăng sự oxy hóa lipid Tác dụng chống oxy hóa của isoflavone chiết từ đậu nành được nghiên cứu so sánh với α-tocopherol Kết quả cho thấy isoflavone có tác dụng mạnh hơn α–tocopherol 80-100 lần

Goodman và cộng sự (1997): Cộng đồng hawai (n=332 ca ung thư, 511 ca chứng) được cho ăn đậu nành và chất xơ trong 8 năm Kết quả cho thấy chế độ ăn nhiều đậu nành làm giảm đáng kể nguy cơ bị ung thư màng trong tử cung

Zheng và cộng sự (1999): Nghiên cứu sự đào thải qua nước tiểu của isoflavone ở phụ nữ bị ung thư vú Kết quả sự đào thải qua nước tiểu của các isoflavone thấp nhất là ở những phụ nữ bị ung thư

Dalais và cộng sự (2004): 29 bệnh nhân nam bị ung thư tuyến tiền liệt được cho ăn chế độ ăn nhiều hoặc ít chất isoflavone Kết quả chế độ ăn giàu isoflavone làm giảm các kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt Người ta cho rằng cơ chế tăng sinh các tế bào ác tính

Adlercreutz (2002): Nghiên cứu tác động bảo vệ của các isoflavone và các

sinh các khối u ở vú, tuyến tiền liệt và ở ruột Tác động chống lại sự hình thành khối

u của các isoflavone hiệu quả hơn khi được tiêu thụ từ tuổi vị thành niên

2.2.2.4 Tác dụng làm giảm cholesterol máu

Chế độ ăn uống nhiều đậu nành thì ít chất béo bão hòa và cholesterol, ít năng lượng hơn nhiều so với chế độ ăn thịt Mặc khác, chế độ ăn giàu đậu nành góp phần đáng kể làm cải thiện lipid máu: làm giảm triglycerid, giảm cholesterol toàn phần, giảm LDL (Low Density Lipid) nhưng lại làm tăng HDL (Hight Density Lipid)

Anderson và cộng sự (1995): Tổng hợp từ 38 nhiên cứu những người ăn hằng ngày protein chiết từ đậu nành với lượng khác nhau Hiệu quả cao hơn ở bệnh nhân cao cholesterol máu Tác dụng không thấy khác biệt nhiều ở các nồng độ protein 50%, 70% hay 90%

Zhan và cộng sự (2005): Tổng hợp từ 23 nghiên cứu từ 1995-2002 đánh giá tác động phòng chống nguy cơ bệnh tim mạch của protein và isoflavone đậu nành Protein đậu nành làm giảm cholesterol máu, giảm LDL, giảm triglycerid một cách hiệu quả, đồng thời làm tăng HDL

West và cộng sự (2005): 18 phụ nữ mãn kinh và 14 đàn ông cao cholesterol máu tuân theo chế độ ăn 25g/ngày protein đậu nành có bổ sung 90mg isoflavone hoặc uống sữa 25g/ngày trong 6 tuần lễ Có sự giảm mức cholesterol máu đáng kể khi ăn protein đậu nành

2.2.2.5 Tác dụng phòng chống các bệnh tim mạch

Nhiều nghiên cứu cho thấy tác động của globuline glycinine và conglycinine chống lại các bệnh tim mạch

β-Anthony và cộng sự (1997): cho khỉ ăn protein đậu nành có bổ sung isoflavone Nhận thấy có sự ức chế hình thành các tổn thương và xơ vữa động mạch

Hallund và cộng sự (2006): 30 phụ nữ mãn kinh được cho ăn ngũ cốc có hoặc không có isoflavone trong vòng 8 tuần lễ Thức ăn ngũ cốc có chứa isoflavone

có khả năng gây dãn động mạch

2.2.2.6 Tác dụng kiểu estrogen

Trong đậu nành, có các hợp chất giống như estrogen gọi là phytoestrogen tức

là estrogen thực vật Thử nghiệm trên phụ nữ mãn kinh, khi nồng độ estrogen giảm thường xuất hiện các cơn bốc hỏa người rạo rực, khó chịu Dùng đậu nành 25g (2 cốc sữa đậu nành hoặc 1 bì đậu phụ) sẽ làm giảm các biểu hiện trên

Các nhà khoa học Mỹ đã chứng minh 2 chất phytoestrogen trong đậu nành là daidzein và genistein ngoài tác dụng kiểu estrogen còn có tác dụng ngừa ung thư vú

ở phụ nữ, ngừa ung thư tuyến tiền liệt ở nam giới và ngừa ung thư dạ dày cho cả nam nữ

2.2.2.7 Tác dụng dinh dưỡng:

Đậu nành có một tỷ lệ các chất đạm, chất béo, chất đường, chất khoáng và các nguyên tố vi lượng Đặc biệt chất béo trong đậu nành có một tỷ lệ acid béo thiết yếu tới 50% là acid linoleic, 6,5% là acid linolenic Các acid béo này là thành phần rất quan trọng của màng tế bào thần kinh Vì vậy chúng có vai trò rất quan trọng cho sự phát triển cơ thể kể cả hệ thần kinh và quá trình tái tạo lại tế bào

2.3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC [1, 10, 11, 22]

2.3.1 Protein

Protein của đậu nành có giá trị cao không chỉ về sản lượng thu hoạch mà nó còn chứa đầy đủ tám loại acid amin thiết yếu cho cơ thể con người: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin và threonin Hàm lượng lysin trong đậu nành cao hơn hẳn so với các loại rau củ khác Các acid amin có hàm lượng thấp hơn trong đậu nành là methionin và cystein

Trong phân đoạn protein đậu nành, người ta còn tìm thấy một lượng đáng kể β-amylase, cytochrome C, lectine, lipoxygenase, urease, lunasin và protease- inhibitor Tuy nhiên, trong hạt đậu nành còn có chứa khoảng 1% lipoxygenase Chất này oxy hóa chất béo không bão hòa thành aldehyd mạch ngắn, gây ra vị đắng khó chịu cho các sản phẩm từ đậu nành

2.3.2 Lipid

Đậu nành chứa ít lipid nhưng trong hạt đậu nành chứa 18-20% lipid toàn phần, trong đó đến 85% là các hợp chất của acid béo không bão hòa (acid linoleic, acid linolenic)

Trong đậu nành cũng chứa lượng đáng kể lecithin, được sử dụng trong công nghiệp sản xuất nhũ tương

2.3.3 Glucid

Đậu nành nói chung có chứa α-galactooligosacharid khó tiêu hóa như rafinose, stachyose hay verbascose Các hợp chất này bị chuyển hóa bởi hệ vi khuẩn ruột tạo khí, gây triệu chứng đầy hơi

2.3.4 Chất khoáng

Các chất khoáng có trong đậu nành là kali, phosphor, magne, kẽm, canxi

2.3.5 Vitamin

Trong hạt đậu nành có chứa nhiều vitamin, không chỉ là các vitamin tan

trong dầu như các vitamin A, D, E, K mà còn có các vitamin tan trong nước như các

vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Riboflavine (B2), Niacine (B3), Acid pantotheic

(B5), Pyroxidin (B6), Acid folic (B9) Trong hạt đậu nành còn chứa một lượng đáng

kể vitamin nhóm E (tocopherol và tocotrienol), vốn là nhóm vitamin có hoạt tính

chống oxy hóa cao

2.3.6 Isoflavone và các glycoside của nó:

Người ta đã tìm thấy trong đậu nành có chứa 12 chất thuộc nhóm isoflavone,

dưới dạng các aglycol hoặc dưới dạng glycosid Ba aglycol được tìm thấy trong đậu

nành là daidzein, genistein, glycitein (Hình 2.6)

Daidzein

Hinh 2.6: Cấu trúc của các isoflavone có trong đậu nành

Các dẫn chất glycosid của genistein, daidzein và glycitein tạo thành các chất như:

genistin, daidzin, glycitin (Hình 2.7)

OH O

OH

O OH

OH

HO

Daidzin Hình 2.7: Cấu trúc các glycoside của isoflavone

Hàm lượng các isoflavone trong đậu nành phụ thuộc rất nhiều vào giống đậu nành, điều kiện khí hậu, sinh thái Trong hạt đậu nành hàm lượng isoflavone thay đổi từ 1-3%

OH

R 3

OAc OAc

O O

OH

CH 2 OH

OH OH

OR 2

OH COOH

Saponin đậu nành là một nhóm các hợp chất có cấu trúc triterpen phức tạp

gồm khung aglycol kỵ nước nối với một hay nhiều nhóm đường thân nước Các

soyasaponin nhóm A có hai chuỗi đường trong khi nhóm B chỉ có một chuỗi đường

và có thể mang thêm nhóm 2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one

(DDMP)

2.3.8 Phytosterol

Các phytosterol có cấu trúc tương tự như cholesterol Các phytosterol chính

là β-sitosterol (24-α-ethylcholesterol), campesterol (24-α-methylcholesterol) và

Hình 2.9: Cấu trúc hóa học của cholesterol và của các phytosterol

Các phytosterol có những hoạt tính dược học quan trọng như làm giảm

cholesterol máu, kháng khối u, kháng tiểu đường, kháng viêm,… Các phytosterol

cũng tham gia thành phần cấu tạo của màng tế bào Nhờ cấu trúc tương tự như

cholesterol nên các phytosterol có trong đậu nành ức chế sự hấp thu và sinh tổng

hợp cholesterol

2.3.9 Chất ức chế protease

Hai chất ức chế protease được nghiên cứu nhiều nhất là Bowman-Birk (BBI)

và Kunitz (KI) BBI là một peptid ngắn 7900Da có khả năng ức chế trypsine và chymotrypsine trong khi KI chỉ ức chế trypsine

Hoạt tính bảo vệ chống lại các tổn thương gây ra bởi tia xạ hay các gốc tự do của BBI đã được chứng minh trên các tế bào của các cơ quan hay mô khác nhau và

ở chuột, cho thấy khả năng phòng nhiều loại bệnh ung thư khác nhau như ở ruột, phổi, da hay ở khoang miệng

2.3.10 Phytate

R R

R R

Hình 2.10 : Cấu trúc của acid phytic

Acid phytic: inositol-1,2,3,4,5,6-hexaphosphate hay myo-insitol hexakisphosphate (Hình 2.13)

Acid phytic vừa có tác động không có lợi cho cơ thể ở pH sinh lý Ban đầu, người ta cho rằng acid phytic tạo phức với các ion Fe2+ , Ca2+, Mg2+ và Zn2+ ; ức chế sự hấp thu các ion này Hơn nữa, acid phytic còn tương tác với protein, làm ức chế một vài enzyme như α-amylase làm chậm sự tiêu hóa amidon và làm giảm glucose trong máu

2.4 Genistein [7, 13, 14, 17, 18, 21, 24]

OH O

OH

Hình 2.11: Genistein Tên IUPAC : 5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-one

Tên khác : 4´,5,7,-Trihydroxyisoflavone

Công thức nguyên : C15H10O5

Trọng lượng phân tử : 270,24g/mol

Trạng thái : tinh thể màu vàng, hình kim

Độ tan : dễ tan trong methanol, DMSO

Điểm nóng chảy : 297-298oC

Genistein thuộc nhóm các isoflavone, có hàm lượng cao trong đậu nành cũng như các sản phẩm từ đậu nành Ngoài ra genistein cũng có mặt trong nhiều loại rau quả và ngũ cốc (cỏ ba lá đỏ, củ sắn dây…) với hàm lượng khác nhau Genistein đã được chứng minh là một phytoestrogen và có khả năng phát huy nhiều tác dụng cũng như ảnh hưởng khác nhau khi có mặt trong cơ thể

Cơ chế tác động của genistein:

• Hoạt tính anti-estrogen: Do cấu trúc tương tự hormon estrogen của người nên genistein có khả năng gắn với các receptor của estrogen, do đó làm giảm nồng

độ estrogen trong máu

• Ức chế hoạt tính các enzyme đặc hiệu như tyrosine kinase (enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình chuyển nhóm phốt phát từ ATP đến tyrosin), AND-topoisomerase I và II (enzyme tháo xoắn AND) có trong các tế bào tăng sinh

• Ức chế enzyme caspase, enzyme tác động trong quá trình thoái biến neuron nên genistein có tác động tốt trong việc phòng bệnh Alzheimer

• Nhờ hoạt tính chống oxy hóa nên genistein có khả năng ức chế các sản phẩm peroxyd, các gốc tự do, các chất oxy hóa có khả năng gây đột biến DNA

Các nhà khoa học đã đi sâu nghiên cứu hoạt tính của genistein và đạt được các kết quả như sau:

Singh và cộng sự (2006): Khảo sát tác dụng của genistein in vitro và in vivo trên các tế bào ung thư bàng quang của chuột Trên in vitro và in vivo nhận thấy sự

ức chế tăng sinh tế bào ung thư phụ thuộc vào liều, làm giảm khoảng 50% kích thước khối u ở chuột

Li và cộng sự (2005): Điều trị in vitro các tế bào ung thư (tuyến tiền liệt, vú,

tụy và phổi) bằng genistein trong 24 giờ Kết quả genistein ức chế đáng kể sự tăng sinh của các khối u

Lin và cộng sự (2005): Tác động của daidzein và genistein trên các tế bào ung thư vú Cả hai chất đều có tác động ức chế phosphodiesterase ở các mô tăng sinh

Cao và cộng sự (2006): Điều trị các tế bào ung thư tuyến tụy bằng daidzein hay bằng genistein Cả hai chất làm giảm khả năng sống các tế bào ung thư

Hedlund và cộng sự (2006): Điều trị các tế bào ung thư tuyến tiền liệt bằng các isoflavone khác nhau như genistein, daidzein, glycitein Genistein và daidzein làm giảm hẳn sự tăng sinh tế bào biểu mô lành tính Glycitein làm giảm đáng kể sự tăng sinh của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt

Tuy nhiên, các nhà khoa học thuộc trường King’s College Lodon (2006) đã phát hiện genistein sẽ tiêu diệt tinh trùng trước khi chúng kịp kết hợp với trứng Vì vậy phụ nữ chuẩn bị có thai được khuyến cáo nên tránh ăn những thức ăn có chứa đậu nành trong một vài ngày

• Một số sản phẩm về Genistein trên thị trường thế giới:

Hình 2.12: Sản phẩm Genistein và một số hợp chất Isoflavone

Chương 3: NGUYÊN VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN LIỆU:

3.1.1 Hạt đậu nành

Hạt đậu nành được mua ở siêu thị sản phẩm của công ty trách nhiệm hữu hạn

thương mại và dịch vụ Xuân Hồng Địa chỉ: 44/12 Phan Xích Long – phường 16 -

• Cột sắc ký

• Đèn UV 254 và UV 365

• Cân phân tích PRECISA XB 220A

• Bản sắc ký Silicagel F254 MERCK (Silicagel 60 F254, 20×20cm)

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

3.2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của hạt đậu nành [2, 3, 5]

Nguyên tắc: chiết tách hỗn hợp các chất có trong hạt đậu nành thành ba phân đoạn theo độ phân cực tăng dần bằng cách chiết hạt đậu nành lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol và nước Sau đó xác định các nhóm hợp chất bằng các phản ứng đặc trưng

3.2.1.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất alkaloid

• Thuốc thử alkaloid: Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng màu hoặc kết tủa

với alkaloid

-Thuốc thử Mayer

Công thức: 1,35 g HgCl2 hòa tan trong 100 ml dung dịch KI 5%

Dấu hiệu nhận biết: tạo kết tủa màu trắng vàng

Công thức: Hòa tan 5 g Iod trong 100 ml dung dịch KI 10%

Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu sáng đến nâu đen

-Thuốc thử Bouchardat

Công thức: I2 2,5 g và 5,0 g KI hòa tan trong 10 ml nước cất

Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu nâu hoặc màu vàng đậm

-Thuốc thử Hager

Acid picric bão hòa trong H2O

Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu từ vàng cam đến đỏ

3.2.1.2 Khảo sát sự hiện diện của hợp chất coumarine

• Thuốc thử coumarine

- Dung dịch NaOH 10%

- Dung địch HCl đđ

- Nước cất

- p-Nitroaniline 3 - 5 giọt

• Định tính coumarine

Lấy dịch trích ethanol 98% làm mẫu thử

- Phản ứng mở vòng lactone:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử, thêm vào một trong 2 ống 0,5

ml NaOH 10% Đun cả hai ống trên bếp cách thủy đến sôi, lấy ra để nguội, thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất

Nếu chất lỏng trong ống có kiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính Tiếp tục đem acid hóa ống có kiềm với vài giọt HCl đđ, nếu dung dịch đang trong suốt lại xuất hiện vẩn đục hoặc kết tủa thì đó là dấu hiệu dương tính

- Phản ứng diazo hóa:

Lấy 2 ml mẫu vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml dung dịch Na2CO310% và 4

ml nước cất Nếu dung dịch trong ống chuyển sang màu đỏ thẫm là dấu hiệu dương tính

3.2.1.3 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất flavonoid

3.2.1.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất glycosid

• Thuốc thử glycosid

-Thuốc thử Tollen

Công thức: pha 0,5 ml dung dịch AgNO3 10% với 0,5 ml dung dịch NaOH 10% Sau đó nhỏ từ từ dung dịch NH4OH đến khi tan kết tủa

Dấu hiệu nhận biết: có Ag kết tủa

Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện màu đỏ tím

3.2.1.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất steroid

• Thuốc thử steroid

- Thuốc thử Liebermann-Burchard

Anhydrid acetic: 20 ml

H2SO4 đậm đặc: 1 ml

Dấu hiệu nhận biết: xuất hiện một vòng ngăn cách giữa hai lớp chất lỏng có màu từ hồng đến xanh lá

Dung dịch tách làm 2 lớp: lớp H2SO4 có màu xanh, lớp CHCl3 có màu nâu đỏ

3.2.1.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất saponin

• Dựa vào chỉ số tạo bọt để xác định sự hiện diện của saponin

a Cơ sở của phương pháp

Dược điển của Pháp định nghĩa chỉ số tạo bọt như sau: Chỉ số tạo bọt của saponin là độ loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1 cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, tiến hành trong điều kiện quy định

b Cách tiến hành thử nghiệm và dấu hiệu nhận biết

Cân 1 g bột dược liệu cho vào erlen 500 ml chứa sẵn 100 ml nước sôi Tiếp tục cho nước trong erlen sôi nhẹ trong 30 phút nữa Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đến 100 ml Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16 cm, đường kính 16 mm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1, 2, 3, 4, 5… 10 ml dịch lọc Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10 ml Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, mỗi giây lắc 2 lần Để yên trong 15 phút, sau đó đo chiều cao các cột bọt

Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1 cm thì chỉ số bọt là dưới 100, thì coi như không có saponin

Chỉ số bọt (CSB) được tính theo công thức: CSB=100 x 10i

CSB:Chỉ số bọt

i: ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1 cm

Ví dụ: Bọt ở ống thứ 2 có chiều cao 1 cm Khối lượng này coi như đã pha

loãng 100 lần Như vậy, nguyên liệu có chỉ số tạo bọt bằng 500

• Dựa vào các phản ứng đặc trưng

- Thuốc thử Liebermann

Anhydrid acetic

H2SO4 đậm đặc

Dấu hiệu nhận biết:

+ Nếu vòng ngăn cách có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene

+ Nếu vòng ngăn cách có màu xanh lá cây thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

-Phản ứng Kahlenberg

SbCl3bão hòa trong CHCl3

Dấu hiệu nhận biết:

+ Nếu có huỳnh quang màu xanh thì sơ bộ nhận định có saponin triterpene

+ Nếu huỳnh quang màu vàng thì sơ bộ nhận định có saponin steroid

3.2.1.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất tanin

Dung dịch NaCl bão hòa 10 ml

Dấu hiệu nhận biết: tủa trắng

- Thuốc thử acetate chì

Pha bão hòa trong nước

Dấu hiệu nhận biết: cho kết tủa màu vàng nhạt

-Dung dịch FeCl3

Pha 1% trong nước

Dấu hiệu nhận biết: tạo phức màu đen

3.2.1.8 Khảo sát sự hiện diện của đường khử

• Thuốc thử đường khử: Feling

Feling A: CuSO4 tinh thể 0,6928g , nước cất vừa đủ 10ml

Feling B: Kali natritactrat 3,46g, NaOH 1g, nước cất vừa đủ 10ml

Dấu hiệu nhận biết: kết tủa đỏ gạch khi đun nóng

3.2.1.9 Khảo sát sự hiện diện của acid hữu cơ

• Thuốc thử: Na2CO3 Dấu hiệu nhận biết: sủi bột khí

3.2.2 Các phương pháp chiết xuất [2, 3, 5]

Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết xuất

và cách chiết

Một phương pháp chiết xuất thích hợp chỉ có thể được hoạch định một khi đã biết rõ thành phần hóa học của cây Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung

áp dụng cho tất cả các hợp chất trong cây

3.2.2.1 Phương pháp ngâm dầm

Kỹ thuật chiết ngâm dầm không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy Tránh sử dụng bình nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây Có thể tăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc nhẹ

3.2.2.2 Phương pháp ngấm kiệt:

Dụng cụ gồm một bình ngấm kiệt, hình trụ đứng, bằng thủy tinh, ở dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung môi chảy ra, khi đã ngâm mẫu cây trong dung môi sau một thời gian nhất định Dung dịch chảy ra được hứng trong một erlen để bên dưới, trên cao có một bình lóng chứa dung môi để nhỏ vào bình ngấm kiệt này

Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới

3.2.2.3 Chiết bằng Soxhlet:

Quá trình ly trích được tự động, liên tục nên nhanh chóng Nhược điểm của phương pháp này là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu cây, trong suốt quá trình chiết xuất mẫu cây luôn luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên những hợp chất kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị phân giải

3.2.2.4 Chiết bằng cách đun hoàn lưu:

Bột cây và dung môi hữu cơ được chứa trong một bình cầu có gắn ống sinh hàn Đun hoàn lưu trên bếp cách thủy ở nhiệt độ sôi của dung môi, sau một thời gian cần thiết dung dịch chiết được lấy ra và lọc qua giấy lọc Dung môi mới được cho vào và tiếp tục chiết 3,4 lần đến khi kiệt

Hiếm khi người ta đun bột cây với dung môi là nước vì nước có nhiệt độ sôi cao và áp suất hơi nhỏ nên rất khó cô cạn Để chiết xuất những hợp chất tan nhiều trong nước, người ta thường dùng hỗn hợp Methanol-Nước hoặc Ethanol-Nước

3.2.2.5 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước:

Đây là phương pháp đặc biệt để ly trích tinh dầu và những hợp chất dễ bây hơi có trong cây