MỞ ĐẦU Xã hội loài người ngày càng đi lên, thời đại công nghệ ngày càng mở rộng.Vì được sử dụng với nhu cầu quá lớn, các nguồn nhiên liệu cơ bản như than đá, dầu mỏ ngày càng cạn kiệt.Việc sử dụng những nguồn nhiên liệu cơ bản đó cũng gây ô nhiễm môi trường ngày càng lớn. Trước tình hình đó, việc kiếm ra các nguồn nhiên liệu sạch thay thế cho các nguồn nhiên liệu cơ b ản là điều cấp bách. Trên thế giới nhu cầu nhiên liệu ethanol , butanol đang phát triển nhanh chóng ở các nước lớn như Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ, Braxin và Châu Âu nhằm mục tiêu giảm sự tiêu thụ dầu mỏ và tăng sử dụng nhiên liệu sinh học. Ở Việt Nam vấn đề sản xuất nhiên liệu sinh học ngày càng được chú trọng. Nhiều nhà máy sản xuất cồn và bioethanol đang được đầu tư xây dự ng và sản xuất ethanol, butanol. Mặt khác Việt Nam là quốc gia với truyền thống trồng lúa nước lâu năm. Hàng năm sản lượng phụ phẩm nông nghiệp hay nói cách khác là rơm rạ được thải ra nhiều, một phần nhỏ được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc làm phân bón nhưng lượng sử dụng đó chỉ là một phần so với lượng thải ra. Trong khi đó rơm rạ là một nguồn nguyên li ệu giàu lignoxenlulose và hemixenlulose có khả năng chuyển đổi thành đường pentose và hexose. Thêm vào đó, các nghiên cứu về quy trình tạo butanol từ nguồn nguyên liệu biomass ở Việt Nam chưa có nhiều.Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu qui trình sản xuất butanol từ rơm rạ ”
Trang 1LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS.HOÀNG QUỐC KHÁNH
TP HỒ CHÍ MINH, 2011
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Con xin ghi khắc công ơn của Cha Mẹ
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Hoàng Quốc Khánh người đã tận tình chỉ bảo và cho em những lời khuyên quý báu, tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này
Em xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học nhiệt đới đã cho phép em làm việc tại viện
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã cho em những kiến thức quý báu trong thời gian em học tập tại trường
Em cũng xin cám ơn chị Đào Thị Thu Hiền và các cán bộ khác của Viện Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn cùng làm việc tại phòng thí nghiệm Vi Sinh , viện Sinh học nhiệt đới đã giúp đỡ trong thời gian tôi làm luận văn
TP HỒ CHÍ MINH, tháng 5 năm 2011
Lâm Đức Lập
Trang 3Lời cảm ơn ii
Muc lục iii
Danh sách các từ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL 3
1.2 BUTANOL 4
1.2.1 Butanol 4
1.2.2 Butanol sinh học 7
1.3 CÁC NGUỒN BIOMASS CHÍNH Ở VIỆT NAM 7
1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RƠM RẠ 8
1.5 CÁC ENZYM TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RƠM RẠ 9
1.5.1 Giới thiệu sơ lược enzym 9
1.5.2 Bộ Biomass Kit 10
1.5.3 Enzyme sử dụng trong quá trình thủy phân rơm rạ 11
1.5.3.1 Cellulase 11
1.5.3.2 β-glucanase 12
1.5.3.3 Hemicellulase 13
1.5.3.4 Xylanase 14
1.6 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BUTANOL TỪ RƠM RẠ 14
1.6.1 Tiền xử lý rơm rạ 15
1.6.1.1 Mục đích nguyên tắc và tầm quan trọng của việc tiền xử lý 15
1.6.1.2 Các phương pháp tiền xử lý 15
1.6.2 Thủy phân 18
1.6.3 Lên men Acetone- Butanol 19
1.6.3.1 Khái niệm chung 19
1.6.3.2 Các quá trình chuyển hóa trong sự lên men 20
1.6.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 25
1.7 CLOSTRIDIUM SACCHAROBUTYLICUM 30
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 32
2.2 NGUYÊN LIỆU DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG 32
2.2.1 Nguyên liệu 32
2.2.2 Các thiết bị sử dụng 32
2.2.3 Hóa chất sử dụng 33
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG 33
2.3.1 Tiền xử lý rơm rạ 33
2.3.2 Xử lý enzym 34
Trang 42.3.5 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn và lên men 35
2.3.5.1 Cấy và bảo quản vi khuẩn 35
2.3.5.2 Phương pháp nhân giống 36
2.3.5.3 Phương pháp đếm vi khuẩn 36
2.3.5.4 Phương pháp lên men 37
2.3.5.5 Phương pháp lấy mẫu 38
2.3.5.6 Phương pháp nhuộm đơn 39
2.4 CÁC BƯỚC THÍ NGHIỆM 39
2.4.1 Sơ đồ nghiên cứu 39
2.4.2 Giai đoạn tiền xử lý rơm rạ 40
2.4.2.1 Tiền xử lý bằng tác nhân vật lý 40
2.4.2.2 Tiền xử lý bằng tác nhân hóa học 40
2.4.3 Thủy phân bằng enzym: 42
2.4.3.1 Tối ưu hóa tổ hợp enzym 42
2.4.3.2 Tối ưu hóa nhiệt độ của tổ hợp enzym 43
2.4.3.3 Tối ưu pH của tổ hợp enzym: 44
2.4.3.4 Thủy phân rơm rạ đã xử lý cồn bằng Biomass Kit 45
2.4.3.5 Thủy phân rơm rạ đã xử lý acetone bằng Biomass Kit 46
2.4.4 Lên men 47
2.4.4.1 Chuẩn bị dịch lên men: 47
2.4.4.2 Lên men đối chứng 48
2.4.4.3 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men 48
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
3.1 TIỀN XỬ LÝ RƠM RẠ BẰNG DUNG MÔI HỮU CƠ: 53
3.2 THỦY PHÂN RƠM RẠ BẰNG BIOMASS KIT 56
3.2.1 Tối ưu hóa tổ hợp enzym 56
3.2.2 Tối ưu hóa nhiệt độ của tổ hợp enzym 57
3.2.3 Tối ưu pH của tổ hợp enzym 59
3.2.4 Thủy phân rơm rạ đã xử lý cồn bằng Biomass Kit 60
3.2.5 Thủy phân rơm rạ đã xử lý acetone bằng Biomass Kit 61
3.2.6 Tổng kết giai đoạn thủy phân bằng enzym 63
3.3 KẾT QUẢ GIAI ĐOẠN LÊN MEN 64
3.3.1 Phản ứng với lượng lớn để thu dịch lên men: 64
3.3.2 Lên men đối chứng 66
3.3.3 Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men 67
3.4 TÍNH TOÁN HIỆU SUẤT 70
3.5 THẢO LUẬN 71
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74
4.1 KẾT LUẬN 75
4.2 ĐỀ NGHỊ 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO 77
PHỤ LỤC 81
Trang 5Bảng 1.1 Tính chất của Butanol 5
Bảng 1.2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 .8
Bảng 1.3 Thành phần của các nguyên liệu lignocellulose 9
Bảng 1.4 Vi khuẩn được sử dụng trong lên men acetone- butanol 28
Bảng 2.1 Xử lý hóa học bằng tác nhân cồn .41
Bảng 2.2 Xử lý hóa học bằng tác acetone .41
Bảng 2.3 Tối ưu hóa tổ hợp enzym .42
Bảng 2.4 Tối ưu hóa nhiệt độ của tổ hợp enzym .44
Bảng 2.5 Tối ưu hóa pH của tổ hợp enzym .45
Bảng 2.6 Thủy phân rơm rạ đã xử lý cồn bằng Biomass Kit 46
Bảng 2.7 Thủy phân rơm rạ đã xử lý acetone bằng Biomass Kit .47
Bảng 3.1 Kết quả các mẫu xử lý cồn theo thời gian .53
Bảng 3.2 Kết quả các mẫu xử lý acetone theo thời gian .54
Bảng 3.3 Lượng đường khử được tạo ra bởi các tổ hợp enzym khác nhau .56
Bảng 3.4 Kết quả định lượng đường khử của các mẫu trong thí nghiệm 4 .58
Bảng 3.5 Kết quả định lượng đường khử của các mẫu trong thí nghiệm 5 .59
Bảng 3.6 Kết quả định lượng đường khử sau thủy phân các mẫu ngâm cồn .60
Bảng 3.7 Lượng đường khử sau thủy phân các mẫu đã xử lý acetone 62
Bảng 3.8 Tổng kết giai đoạn thủy phân 63
Bảng 3.9a Kết quả xác định lượng rơm thu hồi .65
Bảng 3.9b Kết quả định lượng đường khử của dịch thủy phân rơm rạ .65
Bảng 3.10 Khảo sát khả năng lên men của giống 66
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH lên quá trình lên men 67
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men 68
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng giống lên quá trình lên men 69
Bảng 3.14 Tổng hợp các hiệu suất của quá trình: 71
Bảng 3.15 So sánh pH tại thời điểm tạo ra nhiều butanol 73
Trang 6Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của butanol 5
Hình 1.2 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase 11
Hình 1.3 Hoạt động thủy phân của glucannase 12
Hình 1.4 Hoạt động của hemicellulase 13
Hình 1.5 Hoạt động của xylanase 14
Hình 1.6 Sơ đồ sản xuất butanol từ rơm rạ 15
Hình 1.7 Sự biến đổi lignocellulose qua tiền xử lý 15
Hình 1 8 Sự tấn công của các enzyme lên cấu trúc cellulose 19
Hình 1.9 Các giai đoạn chuyển hóa của quá trình đường phân 20
Hình 1.10 Sơ đồ hình thành acid và dung môi 22
Hình 1.11 Sơ đồ hình thành butyrate 23
Hình 1.12 Sơ đồ hình thành ethanol 23
Hình 1.13 Sơ đồ hình thành acetone 24
Hình 1.14 Sơ đồ hình thành Butanol 24
Hình 2.1 Bình lên men 100ml 37
Hình 2.2 Ảnh hưởng pH lên sự lên men 49
Hình 2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sự lên men 50
Hình 2.4 Ảnh hưởng mật độ tế bào giống lên quá trình lên men 51
Hình 3.1 Khối lượng rơm sau khi tiền xử lý cồn 53
Hình 3.2 Khối lượng rơm sau khi tiền xử lý acetone 55
Hình 3.3 Lọc và thu hồi dung môi sau khi xử lý 55
Hình 3.4 Lượng đường khử được tạo ra bởi các tổ hợp enzym khác nhau 57
Hình 3.5 Lượng đường khử được tạo ra do hoạt động của tổ hợp enzym với những nhiệt độ khác nhau 58
Hình 3.6 Lượng đường khử được tạo ra do hoạt động của tổ hợp enzym với những pH khác nhau 59
Hình 3.7 Lượng đường khử sau thủy phân các mẫu đã xử lý cồn 60
Hình 3.8 Lượng đường khử sau thủy phân các mẫu đã xử lý acetone 62
Hình 3.9 Bình xử lý acetone sau 0 ngày( A) và sau 3 ngày (B) 64
Trang 7được sử dụng với nhu cầu quá lớn, các nguồn nhiên liệu cơ bản như than đá, dầu
mỏ ngày càng cạn kiệt.Việc sử dụng những nguồn nhiên liệu cơ bản đó cũng gây ô nhiễm môi trường ngày càng lớn
Trước tình hình đó, việc kiếm ra các nguồn nhiên liệu sạch thay thế cho các nguồn nhiên liệu cơ bản là điều cấp bách
Trên thế giới nhu cầu nhiên liệu ethanol , butanol đang phát triển nhanh chóng ở các nước lớn như Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ, Braxin và Châu Âu nhằm mục tiêu giảm sự tiêu thụ dầu mỏ và tăng sử dụng nhiên liệu sinh học
Ở Việt Nam vấn đề sản xuất nhiên liệu sinh học ngày càng được chú trọng Nhiều nhà máy sản xuất cồn và bioethanol đang được đầu tư xây dựng và sản xuất ethanol, butanol
Mặt khác Việt Nam là quốc gia với truyền thống trồng lúa nước lâu năm Hàng năm sản lượng phụ phẩm nông nghiệp hay nói cách khác là rơm rạ được thải ra nhiều, một phần nhỏ được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc làm phân bón nhưng lượng sử dụng đó chỉ là một phần so với lượng thải ra Trong khi đó rơm rạ
là một nguồn nguyên liệu giàu lignoxenlulose và hemixenlulose có khả năng chuyển đổi thành đường pentose và hexose
Thêm vào đó, các nghiên cứu về quy trình tạo butanol từ nguồn nguyên liệu biomass ở Việt Nam chưa có nhiều.Từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi thực hiện
đề tài “Nghiên cứu qui trình sản xuất butanol từ rơm rạ ”
Trang 8CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trang 91.1 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL
Nhiên liệu sinh học (còn được gọi là nhiên liệu từ nông nghiệp – Agofuel) theo định nghĩa rộng là những nhiên liệu rắn, lỏng hay khí được chuyển hóa từ sinh khối Tuy nhiên, phần này chỉ đề cập chính đến nhiên liệu sinh học dạng lỏng được sản xuất
từ sinh khối
Nói chung nhiên liệu sinh học mang lại những lợi ích sau:
- Giảm khí thải nhà kính
- Giảm gánh nặng lên nhiên liệu hóa thạch
- Tăng sự an toàn về năng lượng quốc gia
- Góp phần phát triển nông thôn
- Là nguồn năng lượng bền vững trong tương lai
Ngược lại, nhiên liệu sinh học cũng có một số hạn chế:
- Nguồn nguyên liệu phải được tái tạo nhanh
- Công nghệ sản xuất phải được thiết kế và tiến hành sao cho cung cấp nhiên liệu lớn nhất với giá thấp nhất và mang lại mang lại lợi ích về môi trường nhất
Nhiên liệu sinh học là dạng nhiên liệu tái tạo nhắm đến tính chất trung tính về carbon Điều này có nghĩa là carbon được thải ra trong quá trình đốt cháy nhiên liệu để cung cấp năng lượng vận chuyển hay sinh điện năng được hấp thụ và cân bằng với lượng carbon hấp thụ bởi cây cối Những cây này sau đó lại được thu hoạch để tiếp tục sản xuất nhiên liệu, những nhiên liệu trung tính về carbon không gây ra sự tăng carbon trong khí quyển, vì thế không góp phần vào hiệu ứng trái đất nóng lên [3]
Sau đây là một số loại nhiên liệu sinh học thế hệ đầu tiên theo phân loại của từ điển bách khoa toàn thư trực tuyến Wikipedia.org:
Trang 10- Dầu thực vật: dầu thực vật có thể dùng làm nhiên liệu sử dụng cho rất nhiều loại động cơ diesel đời cũ, và chỉ ở điều kiện khí hậu ấm áp.Trong đa số trường hợp, dầu thực vật được sử dụng để sản xuất biodiesel
- Biodiesel: được sản xuất từ dầu hoặc chất béo qua quá trình Transesterification và là một chất lỏng giống như diesel từ dầu mỏ
- Bioalcohols: là những rượu được sản xuất từ quá trình lên men sinh học Bioalcohols phổ biến là ethanol, rồi đến propanol và butanol
- Biogas: được sinh ra từ quá trình tiêu hủy kỵ khí các chất hữu cơ bởi các vi sinh vật kỵ khí Sản phẩm phụ dạng rắn từ quá trình này có thể được sử dụng làm nhiên liệu hoặc phân bón Biogas chứa chủ yếu là methane
- Nhiên liệu sinh học dạng rắn: như gỗ, than hoặc phân khô
Để đảm bảo an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường bền vững, nhiều quốc gia
và các tổ chức quốc tế trong vài thập kỷ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch, tiến tới xây dựng ngành “nhiên liệu sạch” cho quốc gia mình Các nước đã nghiên cứu thành công mà sử dụng nhiên liệu sinh học là Brazil, Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu có Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Bỉ, Áo,… Châu Á có Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Sở dĩ nhiều quốc gia đẩy nhanh chương trình nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học vì đã cam kết thực hiện nghị định Kyoto về cắt giảm khí thải nhà kính và để đảm bảo an ninh năng lượng khi nguồn dầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần vào cuối thế kỷ này
1.2 BUTANOL
1.2.1 Butanol
Định nghĩa : n-Butanol hay n-butyl alcohol là một rượu bậc nhất với cấu trúc 4
carbon và cấu trúc phân tử C4H10O Đây là một trong những loại rượu đặc biệt, với hơn 2 nguyên tử carbon nhưng có thể hòa tan trong nước
Trang 11Nguồn gốc : n-Butanol xuất hiện trong tự nhiên dưới dạng một sản phẩm phụ
của quá trình lên men đường và các hydrocarbon khác, có mặt trong nhiều loại thực phẩm và đồ uống n-butanol được sử dụng làm hương liệu nhân tạo tại Mỹ, trong bơ, kem, trái cây, rượu rum, bánh, kẹo,… Nó cũng được sử dụng nhiều trong các sản phẩm tiêu dùng
Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của butanol
Trang 12Hệ số khúc xạ 1.399 (20 °C)
Nhiệt hóa học
Enthalpy tạo thành ΔfHo298 −328±4 kJ/mol
Enthalpy đốt cháy ΔcHo298 −2670±20 kJ/mol
n-Butanol được sản xuất trong công nghiệp từ nguyên liệu của hóa dầu propylene Propylene qua quá trình Hydroformylation sẽ chuyển hóa thành butyraldehyde Sau đó butyraldehyde được hydro hóa để thành n-butanol
Ứng dụng của butanol:
Trong công nghiệp, n-butanol là nguyên liệu để sản xuất butyl acrylate, dibutyl phthalate, dibutyl sebacate, và các loại esters, ete Ngoài ra n-butanol còn được sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, polymer, plastic,…
n-Butanol được sử dụng làm nguyên liệu tạo ra dầu bôi trơn và làm dung môi
để trích ly tinh dầu n-Butanol cũng được sử dụng trong quá trình trích ly thuốc kháng sinh, hoocmone, và vitamin; làm dung môi hòa tan sơn, lớp phủ, nhựa thiên nhiên, nhựa tổng hợp, thuốc nhuộm, long não,… n-butanol còn được sử dụng như một chất pha tạp trong lịnh vực dệt sợi, dầu thắng, chất tẩy rửa, tẩy nhờn, chống thấm, chất ổn định, xử lý gỗ
n-butanol đang có triển vọng sẽ thay thế nguyên liệu xăng dầu truyền thống trong tương lai Tiêu chuẩn cho việc pha trộn ethanol hay methanol vào xăng đã hiện hành trên nhiều quốc gia, gồm có EU, Mỹ, Brazil Ethanol pha trộn thông thường đang thay thế cho xăng khoảng 5% đến 10% Butanol có thể làm tốt việc này hơn ethanol 60%, tức thay thế cho xăng từ 8% tới 16% Việc sử dụng butanol làm nhiên liệu sẽ
Trang 13giải quyết được khoảng 10% vấn đề năng lượng toàn cầu Nhưng hiệu quả của butanol vẫn chưa được định rõ bởi một nghiên cứu nào
Một số ứng dụng khác của n-butanol: da nhân tạo, butyl este, kẹo cao su, tinh dầu quả, sơn, phim chiếu bóng, phim chụp ảnh, áo mưa, tơ nhân tạo, kính an toàn, vecni sơn mài, quần áo chống thấm
1.2.2 Butanol sinh học
n-Butanol là một sản phẩm phụ của một số quá trình lên men, trong đó giống
Clostridium cho ra n-butanol nhiều nhất, và các nghiên cứu hiện tại đang trên đường
làm tăng tối đa lượng n-butanol từ biomass Butanol được sản xuất từ quá trình lên
men gọi là biobutanol Quá trình này thường sử dụng các chủng vi khuẩn thuộc họ
Clostridium, thông thường nhất là Clostridium acetobutylicum, và Clostridium Beijirinskii Sản phẩm phụ của quá trình này gồm có: acetic, lactic, propionic acids,
acetone, isopropanpol và ethanol [6] [27]
1.3 CÁC NGUỒN BIOMASS CHÍNH Ở VIỆT NAM
Ở Việt Nam cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt Nam Rơm rạ chiếm một phần rất lớn trong các nguồn biomass ở Việt Nam
Bảng 1.2 cho thấy vị trí và tiềm năng rất lớn của rơm trong viêc sử dụng làm nguồn nguyên liệu Rơm chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm
2000 với lượng năng lượng chứa đựng là 866.600 GJ Rơm hứa hẹn là một nguồn năng lượng lớn cho nước ta
Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nói riêng và từ biomass nói chung không được sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam Phần lớn rơm rạ được bón trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nông, làm
thức ăn cho gia súc … hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10%
Trang 14Bảng 1.2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [4]
STT Biomass Lượng (triệu tấn) Năng lượng chứa
đựng (GJ)
Phần trăm(%)
1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA RƠM RẠ
Theo nghiên cứu của Howard R.L.1*, Abotsi E2., Jansen van Rensburg E.L.1 và Howard S.3 thành phần rơm rạ bao gồm các thành phần chính được biểu diễn theo bảng 1.3.Tuy nhiên thành phần hóa học của rơm rạ thay đổi tùy thuộc vào vùng miền, khu vực và điều kiện nuôi cấy Do đó theo nghiên cứu khác cho ta thấy trong rơm rạ chứa các thành phần chủ yếu cũng bị thay đổi
Trang 15Bảng 1.3 Thành phần của các nguyên liệu lignocellulose
(Maiorella, 1985; Roberto et al.,2003)
Qua đó cho ta thấy nguyên liệu rơm rạ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng với lượng cao cellulose, hemicellulose hay nói cách khác nguyên liệu rơm rạ là nguồn nguyên
liệu lignocellulose có giá trị [4]
1.5 CÁC ENZYM TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RƠM RẠ[4]
1.5.1 Giới thiệu sơ lược enzyme
Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học với mức
độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp Enzyme có trong tất cả các tế bào sinh vật sống, là chất xúc tác sinh học
Từ nhiều thập kỉ trước enzyme được sử dụng mang tính chất kinh nghiệm thuần túy Công nghệ enzyme ra đời mang lại một bước ngoặt mới trong sự phát triển về nghiên cứu và ứng dụng các enzyme
Trang 161.5.2 Bộ Biomass Kit
Các enzyme chính được sử dụng thủy phân nguyên liệu lignocellulose là NS50013 (cellulase) có thể bổ sung NS50010 (β-glucosidase) NS50013 sẽ bẻ gãy cellulose trong nguyên liệu tiền xử lý thành cello-oligomer và cellobiose, trong khi NS50010 sẽ chuyển đổi cellobiose thành glucose
Phụ thuộc vào thuộc tính của nguyên liệu và phương pháp tiền xử lý, người ta sẽ
có sự kết hợp của NS50013 (cellulase), NS50010 (β-glucosidase), NS22036 (xylanase), NS22002 (hemicellulase), và NS50012 (multi-component complex) một cách tươn ứng
Để thu được sản lượng lớn nhất từ sự thủy phân enzyme Sự trộn lẫn enzyme tốt nhất phụ thuộc trên thành phần của các nhánh khác nhau (cellulose, hemicellulose, lignin) trong cơ chất sinh khối
• NS50013 (cellulast) là hỗn hợp các enzyme cellulase thực hiên vai trò xúc tác bẻ gãy nguyên liệu cellulose thành glucose, cellobiose, và các đường đa khác Chúng có thể được sử dụng để giảm độ nhớt hoặc tăng sản lượng khai thác của các sản phẩm khác nhau có nguồn gốc thực vật
• NS50010 (Novozyme) thành phần là enzym β-Glucosidase hay còn gọi là cellobiase thủy phân cellobiose tạo thành glucose NS50010 có thể được dùng để bổ sung vào NS50013 để tăng năng suất của các loại đường lên men
• NS50012 là hỗn hợp enzym bao gồm arabinase, β-glucanase, cellulase, hemicellulase, pectinase, và xylanase Thực hiện vai trò bẻ gãy vách tế bào ly trích những thành phần có ích từ mô thực vật
Enzym được sản xuất từ giống Asp aculeatus
• NS22036 là enzyme endo-xylanase tinh khiết sử dụng để thủy phân sinh khối hemicellulose thành đường pentose
Trang 17• NS22002 có hai enzyme chính β-Glucanase, xylanase, nhưng chúng cũng có hoạt động của các enzyme khác là cellulase, hemicellulase, và pentosanase Enzym
được sản xuất bởi sự lên men chìm của giống Humicolainsolen.
1.5.3 Enzyme sử dụng trong quá trình thủy phân rơm rạ
1.5.3.1 Cellulase
Cellulase là một loại enzyme, có thể được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc
sinh vật đơn bào; có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose Ký hiệu là EC
3.2.1.4
Nhóm enzyme cellulase
Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp đồng của 3 enzyme khác nhau
• “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC
3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả
tan và không tan
• “Exo -1,4-β-D-glucanases” Bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase
(EC3.2.1.74), enzyme này có tác dụng giải phóng D-glucose
từ 1,4-β-D-glucan và thủy phân chậm D-cellobiose;
Hình 1.2 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase[30]
Ngoài ra còn có enzyme 1,4-β-D-glucancellobiohydrolase (EC3.2.1.91) (CBH), enzyme này sẽ giải phóng cellobiose từ 1,4-β-glucan
Trang 18• “β-D-glucosidase” hay còn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) có tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer của glucose.
Nhóm enzyme endo và exo thường được gọi chung là enzyme cellulase, còn
β- glucosidase do có cấu trúc khác và cơ chế khác nên tách thành nhóm riêng
Các nguồn sản xuất cellulase
Nấm mốc là một trong vi sinh vật chính sản xuất cellulase, mặc dầu một vài vi
khuẩn và xạ khuẩn đã cho biếu diễn về hoạt động sản xuất cellulase Trichoderma và Aspergillus thường dùng để sản xuất cellulase và sản xuất enzyme thô Trichoderma
sản xuất lớn endo-glucanase và exo-glucanase, nhưng chỉ mức độ thấp
ß-glucosidase, trong khi Aspergillus sản xuất lớn endo-ß- glucanase,ß-ß-glucosidase, sản xuất mức độ thấp exo-ß- glucanase Trichoderma reesei QM-9414 được phân lập bởi
the U.S Army Natick Laboratory, được lựa chọn là giống tốt nhất sản xuất cellulase
1.5.3.2 β-glucanase
Glucanase sẽ tấn công trên các sợi cellulose giải phóng thành các đoạn, mảnh nhỏ
hơn của cellulose hay tạo ra các sản
phẩm sẽ được tấn công xa hơn bởi exo
-cellulase thành glucose tự do
a Endo-p-glucanase, 1,4 -ß-D-glucan glucanohydrolase chia cắt ngẫu nhiên các nhánh của chuỗi cellulose sản phẩm thu nhận glucose và cello-oligo saccharide
b Exo-P- [29]glucanase, 1,4 -ß -
D-glucan cellobiohydrolase, exo-tấn công
Hình 1.3 Hoạt động thủy phân của glucannase
Trang 19trên đầu kết thúc không khử của cellulose với cellobiase như cấu trúc chủ yếu
Exo-ß-glucanase được xem như nguyên nhân chia cắt trong liên kết hydro của
cellulose(Reese et al 1950), theo sau đó bằng sự thủy phân của các cellulose có thể dùng được với endo-ß-gucanase Endo-ß-glucanase hoạt động ngẫu nhiên trên các chuỗi cellulose,
trong khi exo-ß-glucanase hoạt động trên phần phơi ra chuỗi cellobiose hoặc
glucose
1, 4 beta glucan + H2O —› các sợi cellobiose
Cellobiose + H2O —› glucose
Beta-glucanase có các ứng dụng khác như:
Tiêu hóa các sợi nhằm cứu chữa các bệnh giảm khả năng tiêu hóa như malabsorption Nó rất quan trọng trong cơ thể người vì con người không có khả năng tổng hợp
1.5.3.3 Hemicellulase
Hemicellulase là nhóm enzyme
bẻ gãy hemicellulose nên được bổ sung vào thành phần thức ăn cho vật nuôi, công nghiệp bánh nướng
Trang 20Hemicellulase thương mại
các enzyme chứa các thành phần xylanase, mananase từ Aspergillus niger Product
Number H2125
1.5.3.4 Xylanase
Xylanase EC:3.2.1.8 Synonyms:endo-1,4-β-xylanase
Xylanase xúc tác sự thủy phân các liên kết 1,4-β-D-xylosidic trong xylan
Hình 1.5 Hoạt động của xylanase.[40]
Ngoài ra vi sinh vật là nguồn giàu có các enzyme xylanase, sản xuất bởi các giống
và loài khác nhau của vi khuẩn, xạ khuẩn, và nấm mốc Trong khi một vài loài
Bacillus tiết ra mức độ cao các xylanase ngoại bào, nấm mốc sợi nhỏ tiết ra lượng cao
protein ngoại bào, sự tiết ra xylanase thường phụ thêm vào các enzyme cellulotic- ví
dụ như loài Trichoderma, Penicillium và Aspergillus.
1.6 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT BUTANOL TỪ RƠM RẠ
Quy trình sản xuất:
Các biomass sẽ được tiền xử lý để tạo điều kiện cho enzym dễ hoạt động, sau
đó sẽ thủy phân bằng các enzym thích hợp cho ra dung dịch đường có chứa các loại đường C5 và C6 và các loại đường co khả năng lên men khác Giai đoạn lên men sẽ sử dụng các vi sinh vật thích hợp để lên men tạo ra sản phẩm
Trang 21Hình 1.6 Sơ đồ sản xuất butanol từ rơm rạ [4]
1.6.1 Tiền xử lý rơm rạ
1.6.1.1 Mục đích, nguyên tắc và tầm quan trọng của việc tiền xử lý
Cellulose có cấu trúc polyme mạch thẳng tuyến tính của các phân tử glucose được nối liền nhau bằng liên kết ß (1-4) glycoside (Gardner, 1974) Có nhiều nhóm hydroxyl (OH) nằm dọc chuỗi liên kết cellulose với các nhóm hydroxyl của các chuỗi cellulose khác hình thành cấu trúc tinh thể chặt, kín
Mục đích của sự tiền xử lý làm giảm tinh thể của cellulose, tăng diện tích bề mặt biomass, loại hemicellulose và bẻ gãy sự gắn dính của lignin
Sự tiền xử lý làm cellulose dễ bị enzyme tác động, dễ dàng hơn trong việc chuyển đổi các polymer cacbohydrate thành các đường, có thể lên men với sản lượng nhiều hơn và tốc độ chuyển hóa nhanh hơn
1.6.1.2 Các phương pháp tiền xử lý
Nguồn Dr K Subramanian 2009
Hình 1.7 Sự biến đổi lignocellulose qua tiền xử lý
Enzym thủy
Biomass Dung dịch thủy phân
chứa đường
Các sản phẩm lên men ( acetone, butanol, ethanol, CO2, H2 …)
Trang 22Lignocellulose của vách tế bào thực vật bao gồm các thành phần cellulose, hemicellulose, pectin, lignin Lignin trong thực vật tập trung vào không gian giữa các
tế bào và tích tụ ở đó Lignin tan trong các dung môi thông thường và không bị thủy phân trong các polysaccharide khác Mặt khác lignin cùng với cellulose và hemicellulose tạo nên cấu trúc bền chắc làm ảnh hưởng lớn đến hoạt động của enzyme Do đó cần phải có các quá trình tiền xử lý để xử lý lignin tạo điều kiện cho quá trình thủy phân xảy ra tối ưu nhất Các phương pháp tiền xử lý đã được nghiên cứu như sau
• Hóa học
Kỹ thuật tiền xử lý hóa học lignocellulose thường sử dụng các phương pháp sau:
a Tiền xử lý axit: các axit thường sử dụng là axit HCl và H2SO4 Các axit sẽ làm tan hemicellulose điều đó dẫn đến các enzyme sẽ thủy phân cellulose tốt hơn Tuy nhiên dung dịch axit dư phải được trung hòa với kiềm như Ca(OH)2, NaOH, NH4OH Các muối tạo ra sau trung hòa sẽ ảnh hưởng đến sự lên men của giống vi sinh vật.[24] [22][17]
b Tiền xử lý oxi hóa: bao gồm sự thêm vào các dung dịch oxi hóa như hydrogen peroxide hoặc acid peracetic vào biomass Tiền xử lý loại bỏ hemicellulose và lignin dẫn tới sự tăng lên của cellulose Hydrogen peroxide tiền xử lý tiêu thụ oxi hóa loại bỏ
Trang 23thành lignin tháo gỡ và hòa tan lignin và làm mất mạng lưới lignocellulose như vậy cải thiện khả năng tác động của enzyme
c Tiền xử lý alkali bao gồm sự ứng dụng của các dung dich kiềm như NaOH hoặc KOH loại bỏ lignin và một phần hemicellulose, tăng hiệu quả thủy phân của enzyme tới cellulose Tiền xử lý kiềm bẻ gãy các liên kết ester giữa lignin, cellulose và hemicellulose, ngăn ngừa sự vỡ ra từng mảnh của các polymer hemicellulose Tiền xử
lý có thể thực hiện tại nhiệt độ thấp nhưng đòi hỏi thời gian dài và nồng độ bazơ cao.[17]
d.Tiền xử lý ammonia khi phản ứng tiền xử lý ammonia đã có vài tính chất đáng quan tâm Nó có hiệu quả phản ứng đặc sắc cho nguyên liệu lignocellulose, tính chọn lọc cao cho phản ứng với lignin Nó dễ bay hơi cao làm cho nó dễ dàng thu nhận và sử dụng lại Nó không làm ô nhiễm và không ăn mòn hóa học Phản ứng của aqueous amonnia với lignin chia cắt các liên kết C-O-C trong lignin tốt như các liên kết ether
và ester trong phức hợp lignin-carbohydrate Trên thế giới hiện nay đã phát triển các quy trình tiền xử lý amonia là ARP[21] [11], SSA, SSCF, AFEX [ 13,25,10] đã chứng minh hiệu quả của phương pháp này
e.Tiền xử lý Organosolv : Tiền xử lý Organosolv thuận lợi cho sự tiêu hóa của enzyme chủ yếu bởi sự khử lignin và loại bỏ hemicellulose, phần còn lại rất giàu cellulose Quy trình Organosolv sử dụng các dung môi hữu cơ nóng như ethanol tại pH axit tới việc cắt phân đoạn các thành phần biomass Tuy nhiên phương pháp này vẫn có những nhược điểm như sau: dung môi tiền xử lý Organosolvent mắc tiền, việc tách riêng, thu hồi và dùng lại các dung môi đòi hỏi một quy trình tốn kém, yêu cầu sự đòi hỏi nghiêm ngặt về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự bay hơi và khả năng hòa tan [15]
Trang 24• Tiền xử lý sinh học
Hiệu quả của tiền xử lý rơm rạ được sử dụng 4 loại nấm trắng thối rữa là
hanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Ceriporiopsis subvermispora, và Pleurotus ostreatus có khả năng thay đổi cấu trúc trong thành phần của rơm rạ được
tiền xử lý tốt như sự thủy phân của các enzyme [18] [12]
1.6.2 Thủy phân
Thủy phân là quá trình thủy giải các nguồn nguyên liệu thành dung dịch đường
có khả năng lên men.Glucose cấu thành khoảng 60% của đường tổng có giá trị trong nguyên liệu cellulose
Có 3 hướng chính để thủy phân rơm rạ:
a Thủy phân cellulose bằng acid ở nhiệt độ và áp suất cao tạo glucose
b Dùng enzyme cellulase bẻ gãy mạch cellulose thành glucose
c Quá trình khí hóa: cellulose, biomass được đốt cháy không hoàn toàn, chuyển thành syngas (CO2, CO, H2)
Trong đó phương pháp sử dụng enzyme để thủy phân cấu trúc của cellulose ưa chuộng nhất
Quá trình thủy phân bằng enzym bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như : cấu trúc nguyên
liệu, nhiệt độ , pH, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, ảnh hưởng của các chất kìm hãm
Mỗi yếu tố đều có sự ảnh hưởng nhất định, tuy nhiên yếu tố nhiệt độ và pH là ảnh
hưởng mạnh nhất
Trang 25Nguồn theo Gustavo H Goldman
Hình 1.8 Sự tấn công của các enzyme lên cấu trúc cellulose
1.6.3 Lên men Aceton-Butanol
1.6.3.1 Khái niệm chung
Lên men acetone - butanol là một dạng của quá trình lên men butyric, xảy ra trong môi trường kị khí và pH môi trường lên men axít yếu Tác nhân lên men là nhóm
vi khuẩn Clostridium, chúng lên men được Saccarose, polysaccarit, dịch thủy phân Sản phẩm chính là acetone, butanol, sản phẩm phụ là axit acetic, CO2, H2O
Trang 26Nhiều chủng có khả năng lên men hydratcarbon(gluxit) để tạo các sản phẩm khác nhau
như axit butyric, butanol, acetone Ví dụ: Clostridium acetobutylicum trong môi
trường hơi kiềm lên men axit butyric còn trong môi trường hơi axit lên men acetone, butanol Do vậy chủng này đã được dùng trong công nghiệp để sản xuất 3 loại sản phẩm trên [8]
1.6.3.2 Các quá trình chuyển hóa trong sự lên men
Sự phân giải một hợp chất giàu năng lượng như Glucose trải qua một chuỗi dài những phản ứng, trong đó có những phản ứng xảy ra không cần sự hiện diện của oxy và có những chuỗi phản ứng lệ thuộc vào oxy [4]
Giai đoạn 1: Đường phân (Glycolysis)
Hình 1.9 Các giai đoạn chuyển hóa của quá trình đường phân
Trang 27Ðường phân là giai đoạn đầu tiên của quá trình hô hấp glucose xảy ra không cần sự hiện diện của O2 Ðường phân xảy ra trong dịch tế bào chất của tất cả tế bào sống, và là chuỗi phản ứng đã xảy ra ở những sinh vật đầu tiên khi mà trái đất còn chưa có O2
Glucose là một hợp chất bền vững, ít có xu hướng phân cắt ra thành những chất đơn giản hơn, do đó tế bào muốn lấy năng lượng từ glucose trước tiên phải đầu tư cho nó một ít năng lượng để hoạt hóa phân tử Do đó, giai đoạn đầu của đường phân
là cung cấp ATP cho phân tử glucose Trong các phản ứng chuẩn bị hai phân tử ATP gắn gốc phosphat cuối cùng của nó vào phân tử glucose
Giai đoạn II: Sự oxy hoá Pyruvic acid
Acid pyruvic trong dịch tế bào chất được chuyển vào ngăn trong của ty thể Qua một chuỗi phản ứng phức tạp, sử dụng cơ chế duy nhất có sự tham gia của hệ thống enzyme gọi là pyruvat – ferredoxin oxidoreductaza, acid pyruvic bị oxy hóa thành CO2 và một gốc acetyl 2C, chất này gắn với một coenzim được gọi là coenzim
A (CoA) tạo ra chất acetyl-CoA Khi acid pyruvic được oxy hóa, điện tử và ion H+ bị lấy đi, và một lần nữa NAD+ là chất nhận điện tử và ion H+ để tạo ra NADH Chuỗi phản ứng phức tạp này có thể được tóm tắt trong phương trình sau:
Acetyl – CoA
Acid pyruvic+ CoA+ NAD+ → CH − −C CoA+ CO + NADH + H+
Cuối giai đoạn II, 2 trong 6C trong glucose ban đầu được giải phóng ra dưới dạng
CO2 Acetyl-CoA là chất trung gian hình thành các nhánh của con đường lên men sinh acid và dung môi
Trang 28 Giai đoạn III
Hình thành acetate
Nhóm phosphate thay thế CoA của acetyl – CoA để tạo acetyl phosphate Enzyme
chịu trách nhiệm cho quá trình này là phosphate acetyltransferase Cuối cùng, nhóm
phosphate kết hợp với ADP để tạo ra ATP và acetate với sự tham gia của acetate kinase
phosphate acetyltransferase
acetate kinase
• Hình thành Butarate
Acetyl – CoA được chuyển hoá thành acetoacetyl – CoA nhờ enzyme thiolase
Acetoacetyl – CoA nhận H2 nhờ enzyme β – hydroxybutyryl – CoA dehydrogenase
tạo thành β – hydroxybutyryl CoA Sau đó loại nước dưới tác dụng của enzyme
crotonase tạo thành crotonyl – CoA Nhờ enzyme butyryl – CoA dehydrogenase
Trang 29chuyển thành butyryl – CoA Nhóm phosphate thay thế CoA để tạo butyryl phosphate Enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình này là phosphobutyrylase Cuối cùng, nhóm phosphate kết hợp với ADP để tạo ra ATP và butyrate với sự tham gia của butyrate kinase
Acetyl - CoA Acetoacetyl - CoA Hydroxybutyryl CoA
Crotonyl - CoA Butyryl - CoA
Butyryl phosphate Butyrate
Hình 1.11 Sơ đồ hình thành butyrate
Clostridium bắt đầu lên men tạo acid nhưng khi pH thấp hơn 5, chúng chuyển sang sản xuất dung môi acetone, ethanol và butanol nhằm ngăn chặn sự hạ thấp pH tiếp theo
Trang 30• Hình thành acetone
Dưới tác dụng của enzyme acetoacetyl – CoA transferase, acetoacetyl – CoA được chuyển hoá thành acetoacetic Sự loại bỏ CO2 của acetoacetic khi được xúc tác bởi enzyme acetoacetic decaboxylase dẫn đến sự tạo thành acetone
Hình 1.14 Sơ đồ hình thành Butanol
Trang 31Acetoacetyl – CoA chuyển hoá thành β – hydroxybutyryl CoA sau đó chuyển thành
crotonyl – CoA Crotonyl – CoA chuyển thành butyryl – CoA nhờ butyryl – CoA dehydrogenase Butyryl – CoA chuyển nhóm CoA tạo thành butyric nhờ enzyme butyric transferase Mặt khác, butyryl – CoA vừa nhận H2 và đồng thời tách nhóm CoA tạo thành butyraldehyde Chất này sau đó nhận H2 tạo thành butanol
1.6.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
Nhiệt độ
Mỗi loại vi sinh vật đều có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của
chúng Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của vi khuẩn giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật khác như vi khuẩn lactic và vi khuẩn, nấm men hoang dại Ở nhiệt
độ 35 – 38°C, vi khuẩn hoang dại phát triển nhanh gấp 3-4 lần so với ở nhiệt độ 30°C
Mặc khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyd,…
Nguyên liệu
Rơm rạ ở mỗi vùng mỗi địa phương có thành phần hóa học khác nhau như thành phần cellulose và hemicellulose… Do đó chất lượng của dịch thủy phân rơm rạ khác nhau về thành phần đường có thể lên men
Các chất ức chế sinh ra trong quá trình tiền xử lý rơm rạ
Các phương pháp tiền xử lý loại bỏ lignin trong rơm rạ và sau đó tiến hành thủy phân để chuyển hóa cellulose và hemicellulose thành đường có thể làm cho thành phần dịch lên men có nhiều chất gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn
Độ pH
Nồng độ ion H+ trong môi trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi khuẩn Chúng có khả năng thay đổi diện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm
Trang 32thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi loài sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion ổn định nhất, trạng thái này phụ thuộc vào độ pH của môi trường
Trong điều liện lên men butanol, pH tối ưu để tạo butanol là 6 – 7 Nếu pH thấp, vi khuẩn sẽ bị ức chế Nếu pH cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ của quá trình lên men sẽ tạo ra nhiều hơn, lên men có hiệu suất thấp
Nồng độ dung dịch lên men
Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của vi khuẩn Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và kéo dài thời gian lên men Ngược lại, nếu nồng độ đường thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho vi khuẩn không đủ chất dinh dưỡng để phát triển Thông thường nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22% khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ)
Thời gian
Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng vi khuẩn,… Thời gian lên men được tính bắt đầu từ lúc cấy chủng vi khuẩn vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tuỳ thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men Ta muốn
có nhiều butanol thì phải chọn thời điểm dừng lên men thích hợp nếu không butanol sẽ
tiếp tục chuyển hóa thành những chất khác
Thành phần các chất dinh dưỡng trong môi trường
Môi trường lên men cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là
Trang 33glucid ở dạng monosacchacide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vô
cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng
Hàm lượng giống vi khuẩn
Vi khuẩn là nhân tố quan trọng trong quá trình lên men, chuyển hóa đường thành butanol và các sản phẩm khác Hàm lượng giống vi khuẩn cũng quyết định tới năng suất của quá trình lên men Nếu hàm lượng quá thấp, vi khuẩn sẽ sử dụng nhiều đường cho quá trình sinh sản, làm tiêu tốn thời gian và nguyên liệu Nếu hàm lượng vi khuẩn cao quá, nồng độ đường lại giảm, làm nồng độ butanol cũng giảm theo
Việc bổ sung giống lên men cũng phải được lựa chọn Thông thường lượng vi khuẩn cấy vào là 15 triệu tế bào/ml dịch lên men
Giống vi khuẩn
Có nhiều giống vi khuẩn có khả năng sinh acetone và butanol, mỗi giống có khả năng lên men khác nhau Giống được lựa chọn dựa trên một số nhân tố, và phải phù hợp với hoàn cảnh và điều kiện sản xuất của từng khu vực Giống vi khuẩn của
công nghiệp ABE thường là chủng Clostridium, gồm có Clostridium acetobutylicum Clostridium beijerinkii, Clostridiumsaccharobutylicum, Clostridium
saccharoperbutylacetonicum Giống C acetobutylicum và C.beijerinkii phù hợp với
những quy trình sinh acetone – butanol từ ngô là chủ yếu, trong khi đó
C.saccharobutylicum và C.saccharoperbutylacetonicum lại sử dụng mật rỉ làm môi
trường cho quá trình ABE.[9]
Một số giống vi khuẩn được sử dụng trong lên men tạo acetone- butanol được trình bày ở bảng 1.4
Trang 34Bảng 1.4 Vi khuẩn được sử dụng trong lên men acetone- butanol [23]
thêm vào
Các chất
bổ sung khác
Bacillus butacone
Mật rỉ đường Protein động
thực vật
Mật rỉ từ củ cải đường
Phức hợp nitơ
B saccharobutylicum Mật rỉ đảo đường CaCO3
Gluten trong ngũ cốc CaCO3
Trang 35Cl saccharoacelObutylicum Mật rỉ đường
mía
Protein đang phân hủy Mật rỉ Louisiana (NH4)2SO4 CaCO3
Mật rỉ mía (NH4)2SO4 Gluten
trong bột xay thô Mật rỉ đảo đường NH3
CI saccharobutyl-isopropyl-
Protein đang phân hủy
Trang 36
1.7 CLOSTRIDIUM SACCHAROBUTYLICUM
Clostridium saccharobutylicum có kích thước tế bào trong dung dịch lỏng có dạng
thẳng, ngắn, hoặc que dài, với kích thước trung bình 1.4- 6.3 μm và chiều dài từ
3.8-10 μm Các dạng que, gậy có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc thành căp hoặc thành cặp ngắn,
và di động Nội bào tử có hình oval, kích thước trung bình từ 1.1-1.8μm x 1.7-3.9 μm, giai đoạn cuối hoặc giai đoạn gần cuối với trên 15% trở thành 2 đầu cực
Khuẩn lạc trên môi trường CBM có đường kính 2-3 μm, có dạng vòm, màu vàng kem, có bề mặt trơn nhẵn, có gờ tròn hoặc không đều
Các loài này ưa ấm: nhiệt độ phát triển tối ưu để sản xuất dung môi là 30 -34oC, và khoảng pH thích hợp từ 6.2-7.0
Tất cả các giống được test catalase âm và nhạy cảm với rifampicin (10ng), urase và không sản xuất indole Thủy phân được aesulin và gelatin Tất cả các giống đều lên
men arabinose, xylose, glucose, mannose, cellobiose, lactose, maltose, saccharose,
inositol, melibiose, methyl-glucopyranoside, raffinose, salicin, trehalose, turanose, amygdalin, starch, glycogen và dextrin, lên men yếu ribose và không lên men glycerol, dulcitol,sorbitol, melezitose, rhamnose hoặc pectin Hình thành sữa đông xuất hiện trong 24h đầu tiên
Sản phẩm lên men bao gồm acetic và butyric acid, acetone, butanol, ethanol,
CO2 và H2 Các giống công nghiệp ở đây được sử dụng để áp dụng cho quy trình lên men cho sản phẩm dung môi acetone, butanol từ các cơ chất đường khác nhau và các nguồn tinh bột đơn giản Sự lên men công nghiệp tiêu thụ mật rỉ chứa 6-7.5 % đường
có thể có lên men tại nhiệt độ 29-33 oC trong 29-33h cho giá trị pH cuối cùng 5.2-6.4, sản lượng dung môi thu được 27-33% và nồng độ dung môi đạt được 17-20 g/l ( lớn nhất 21 g/l), phần butanol thu được khoảng từ 55-74% [20]
Trang 37CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Trang 382.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được tiến hành từ tháng 9/2009 đến tháng 7/2010 tại phòng Vi Sinh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP 6, P Linh Trung, Quận
Thủ Đức, TP.HCM
2.2 NGUYÊN LIỆU DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG
2.2.1 Nguyên liệu:
Rơm rạ
Rơm lấy từ tỉnh Long An, Việt Nam
Enzyme: enzyme đuợc sử dụng là bộ biomass Kit gồm 5 loại sản phẩm
có nguồn gốc từ Novo Nordisk bao gồm:
NS50012(viscozym), NS22002(Ultraflo), NS50013(cellulast)
• Máy ly tâm lớn và máy ly tâm Eppendof
• Một số dụng dụ thông dụng khác của phòng thí nghiệm:
Becher, erlen, ống đong, pipetman, pipet v….v…
• Tủ sấy: dùng để sấy khô các dụng cụ sau khi hấp, và cũng để phục vụ cho quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men
• Kính hiển vi điện tử Nikon dùng để quan sát, và phục vụ cho quá trình đếm vi khuẩn
Trang 39• Máy đo pH: điều chỉnh pH cho dung dịch trước khi đem đi hấp và lên men Và
cũng để phục vụ cho quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình lên
men
• Máy đo OD: dùng để đo mật độ quang, tính lượng đường khử
• Buồng đếm hồng cầu: dùng để đếm vi khuẩn, phục vụ cho quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình lên men
• Máy nghiền nhỏ: nghiền rơm thành rơm nhuyễn
• Nồi hấp tiệt trùng
• Tủ cấy
• Máy sắc ký lỏng HPLC của hãng SHIMADZA
2.2.3 Hóa chất sử dụng
Môi trường RCM (Reinforced Clostridia Medium) broth( xem thêm phụ lục 4)
Môi trường RCM (Reinforced Clostridia Medium) agar ( xem thêm phụ lục 4)
Mục đích chính là loại bỏ lignin, một thành phần có trong rơm rạ Lignin là nhân
tố cản trở sự thủy giải của enzym, do đó tìm cách loại bỏ thành phần này là một mấu chốt quan trọng
Phương pháp tiền xử lý được dùng ở đây là phương pháp cơ học và hóa học Phương pháp cơ học là nghiền nhỏ Phương pháp hóa học là ngâm mẫu với ethanol hoặc aceton với thời gian thay đổi từ 1 đến 8 ngày
Sau thời gian ngâm thích hợp thì thu mẫu :
Mẫu ngâm sau thời gian quy định sẽ được ly tâm, sau đó lọc qua phễu thu được 2
Trang 40Mẫu ngâm Î ly tâm Î lọcÎ rửa lại bằng nước cất 2 lần Î sấy khô hoặc để khô
tự nhiênÎ mẫu sẽ dùng phản ứng với enzym
tinh khiết với thuốc thử sẽ tính được hàm lượng đường khử [ 5]
Trình tự tiến hành :
Pha thuốc thử DNS
Dựng đường chuẩn (xem phụ lục 7.1)
Xác định hàm lượng đường khử dựa vào đường chuẩn
2.3.4 Phương pháp đo nồng độ Glucose, ABE
sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao