L ời cảm ơn
1.7 CLOSTRIDIUM SACCHAROBUTYLICUM
Clostridium saccharobutylicum có kích thước tế bào trong dung dịch lỏng có dạng thẳng, ngắn, hoặc que dài, với kích thước trung bình 1.4- 6.3 μm và chiều dài từ 3.8- 10 μm. Các dạng que, gậy có thể xuất hiện đơn lẻ hoặc thành căp hoặc thành cặp ngắn, và di động. Nội bào tử có hình oval, kích thước trung bình từ 1.1-1.8μm x 1.7-3.9 μm, giai đoạn cuối hoặc giai đoạn gần cuối với trên 15% trở thành 2 đầu cực
Khuẩn lạc trên môi trường CBM có đường kính 2-3 μm, có dạng vòm, màu vàng kem, có bề mặt trơn nhẵn, có gờ tròn hoặc không đều.
Các loài này ưa ấm: nhiệt độ phát triển tối ưu để sản xuất dung môi là 30 -34oC, và khoảng pH thích hợp từ 6.2-7.0.
Tất cả các giống được test catalase âm và nhạy cảm với rifampicin (10ng), urase và không sản xuất indole. Thủy phân được aesulin và gelatin. Tất cả các giống đều lên men arabinose, xylose, glucose, mannose, cellobiose, lactose, maltose, saccharose, inositol, melibiose, methyl-glucopyranoside, raffinose, salicin, trehalose, turanose, amygdalin, starch, glycogen và dextrin, lên men yếu ribose và không lên men glycerol, dulcitol,sorbitol, melezitose, rhamnose hoặc pectin. Hình thành sữa đông xuất hiện trong 24h đầu tiên.
Sản phẩm lên men bao gồm acetic và butyric acid, acetone, butanol, ethanol, CO2 và H2. Các giống công nghiệp ở đây được sử dụng để áp dụng cho quy trình lên men cho sản phẩm dung môi acetone, butanol từ các cơ chất đường khác nhau và các nguồn tinh bột đơn giản. Sự lên men công nghiệp tiêu thụ mật rỉ chứa 6-7.5 % đường có thể có lên men tại nhiệt độ 29-33 oC trong 29-33h cho giá trị pH cuối cùng 5.2-6.4, sản lượng dung môi thu được 27-33% và nồng độ dung môi đạt được 17-20 g/l ( lớn nhất 21 g/l), phần butanol thu được khoảng từ 55-74%. [20]
CHƯƠNG 2
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được tiến hành từ tháng 9/2009 đến tháng 7/2010 tại phòng Vi Sinh thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP. 6, P. Linh Trung, Quận ThủĐức, TP.HCM.
2.2 NGUYÊN LIỆU DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT SỬ DỤNG
2.2.1 Nguyên liệu:
Rơm rạ.
Rơm lấy từ tỉnh Long An, Việt Nam.
Enzyme: enzyme đuợc sử dụng là bộ biomass Kit gồm 5 loại sản phẩm có nguồn gốc từ Novo Nordisk bao gồm:
NS50012(viscozym), NS22002(Ultraflo), NS50013(cellulast) NS 22036(shearym), NS 50010 (Novozym)
Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn được sử dụng là Clostridium saccharobutylicum (trước đây được biết là C. acetobutylicum NRRL B643) [16]
2.2.2 Các thiết bị sử dụng
• Cân kỹ thuật
• Cân phân tích
• Máy ly tâm lớn và máy ly tâm Eppendof
• Một số dụng dụ thông dụng khác của phòng thí nghiệm:
Becher, erlen, ống đong, pipetman, pipet v….v….
• Tủ sấy: dùng để sấy khô các dụng cụ sau khi hấp, và cũng để phục vụ cho quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men.
• Kính hiển vi điện tử Nikon dùng để quan sát, và phục vụ cho quá trình đếm vi khuẩn.
• Máy đo pH:điều chỉnh pH cho dung dịch trước khi đem đi hấp và lên men. Và cũng để phục vụ cho quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men.
• Máy đo OD: dùng để đo mật độ quang, tính lượng đường khử .
• Buồng đếm hồng cầu: dùng để đếm vi khuẩn, phục vụ cho quá trình nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến quá trình lên men.
• Máy nghiền nhỏ: nghiền rơm thành rơm nhuyễn
• Nồi hấp tiệt trùng
• Tủ cấy
• Máy sắc ký lỏng HPLC của hãng SHIMADZA
2.2.3 Hóa chất sử dụng
Môi trường RCM (Reinforced Clostridia Medium) broth( xem thêm phụ lục 4) Môi trường RCM (Reinforced Clostridia Medium) agar ( xem thêm phụ lục 4) Thuốc thử DNS
Cồn tuyệt đối Aceton nguyên chất
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG
2.3.1 Tiền xử lý rơm rạ
Mục đích chính là loại bỏ lignin, một thành phần có trong rơm rạ. Lignin là nhân tố cản trở sự thủy giải của enzym, do đó tìm cách loại bỏ thành phần này là một mấu chốt quan trọng.
Phương pháp tiền xử lý được dùng ởđây là phương pháp cơ học và hóa học. Phương pháp cơ học là nghiền nhỏ. Phương pháp hóa học là ngâm mẫu với ethanol hoặc aceton với thời gian thay đổi từ 1 đến 8 ngày.
Sau thời gian ngâm thích hợp thì thu mẫu :
Mẫu ngâm sau thời gian quy định sẽđược ly tâm, sau đó lọc qua phễu thu được 2 phần là dung môi đã hòa tan lignin ở dưới và phần rơm ở trên. Qui trình như sau:
Mẫu ngâm Î ly tâm Î lọcÎ rửa lại bằng nước cất 2 lần Î sấy khô hoặc để khô tự nhiênÎ mẫu sẽ dùng phản ứng với enzym.
2.3.2 Xử lý enzym
Mục đích : phân giải celullose va hemicellullose thành các loại đường C5 và C6
Phương pháp : cho enzym và cơ chất tác động trực tiếp trong bểổn nhiệt.
2.3.3 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS
Nguyên tắc phương pháp:
Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitrosalycylic. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử sẽ tính được hàm lượng đường khử.[ 5]
Trình tự tiến hành :
Pha thuốc thử DNS
Dựng đường chuẩn (xem phụ lục 7.1)
Xác định hàm lượng đường khử dựa vào đường chuẩn.
2.3.4 Phương pháp đo nồng độ Glucose, ABE Nguyên lý
Glucose, saccharose, fructose và butanol, acetone, ethanol được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng (HPLC) sử dụng pha động là nước cất. Mẫu và chuẩn được chạy ở chếđộ: nhiệt độ cột 50°C, tốc độ pha động 0.6ml/phút.
Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân tách khá cao.
Trình tự tiến hành:
Cho chất chuẩn chạy qua để xác dịnh thời gian lưu
Dựng đường chuẩn : pha chất chuẩn thành các nồng độ khác nhau và cho chạy qua, dựa vào phần diện tích peak thu được, ta dựng thành đường chuẩn
Cho mẫu chạy qua, dựa vào thời gian lưu của các peak để xác định xem có chất chúng ta cần quan tâm hay không
Tính nồng độ chất cần quan tâm dựa vào đường chuẩn ( chi tiết xem thêm phụ lục 6 )
2.3.5 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn và lên men 2.3.5.1 Cấy và bảo quản vi khuẩn
Chuẩn bị môi trường RCM có agar. Hấp tiệt trùng, rót dung dịch vào ống nghiệm và để nghiêng đến khi agar đông lại.
Tiến hành gieo cấy giống vi khuẩn từống giống gốc của phòng thí nghiệm sang ống môi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn từ trước. Công việc này được tiến hành trong tủ cấy vô khuẩn để tránh bị nhiễm các vi sinh vật khác có ảnh hưởng xấu đến giống và quá trình lên men sau này.
Phương pháp cấy như sau:
- Dùng que cấy vòng và vô khuẩn trên đèn cồn
- Tháo nút bông ởống canh trường giống và ống môi trường - Đốt nóng miệng 2 ống nghiệm trên đèn cồn
- Đưa que cấy vào ống canh trường và lấy một ít canh trường vi khuẩn
- Đưa đầu que cấy vào đáy ống môi trường, hòa giọt canh trường vào giọt nước ngưng ởđáy
- Nhẹ nhàng và từ từ kéo đầu que cấy lên trên mặt thạch, từđáy lên theo hình sin - Lấy que cấy ra, vô khuẩn trên đèn cồn
- Hơ nóng nút bông và miệng 2 ống nghiệm (canh trường và môi trường). Đậy nút bông vào ống nghiệm
Giống vi khuẩn sau khi được cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủấm và giữở nhiệt độ 30°C, sau 48 giờ giống đã phát triển tốt, chúng tôi đặt các ống nghiệm vào tủ lạnh (nhiệt độ 4-6°C) để bảo quản giống, phục vụ cho quá trình nghiên cứu. Nếu muốn tiếp tục bảo quản thì thời gian sau này cần cấy chuyền sang môi trường mới.
2.3.5.2 Phương pháp nhân giống
Giống vi khuẩn trước khi đưa vào lên men cần được nhân giống nhằm tăng sinh khối, tăng hoạt lực giống. Ở quy mô phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành nhân giống như sau: sau khi vi khuẩn đã phát triển trên môi trường thạch nghiêng, chúng tôi cấy vào ống nghiệm chứa 15ml dịch môi trường RCM đã được hấp tiệt trùng, tiếp đó nuôi ở nhiệt độ thường (28-30°C) trong 24 giờ.
2.3.5.3 Phương pháp đếm vi khuẩn
Đểđánh giá ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn lên quá trình lên men, cần phải xác định mật độ vi khuẩn trong dung dịch tăng sinh, từ đó quyết định thể tích dung dịch này vào dung dịch lên men và khảo sát. Chúng tôi đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu với kính hiển vi điện tử.
Tiến hành
- Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm
- Lắc đều dịch tế bào vi khuẩn và dùng Pipet pasteur để lấy một giọt cho và khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng đếm nhờ cơ chế mao dẫn
- Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi và để yên trong vài phút
- Chỉnh kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ô đếm ở khu vực buồng đếm. Chỉnh thị trường sao cho một thị trường chứa trọn một ô lớn (4 x 4 = 16 ô nhỏ)
- Đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại điện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm.
Cách tính
Số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức: N = [(a/b) x 400/0.1] x 103 x n
• N: số lượng tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu
• a: số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ)
• b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn
• 400: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm
• 0.1: thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm
• 103: cố chuyển mm3 thành ml
• n: độ pha loãng mẫu.
2.3.5.4 Phương pháp lên men
Mục đích: của thí nghiệm lên men trong đề tài này là:
Chứng minh dung dịch thủy phân có thể dùng để lên men tạo ra ABE.
Tiến hành:
- Chuẩn bị các dụng cụ và dung dịch lên men đã được hấp tiệt trùng để cho vào tủ cấy, gồm có:
o Các dung dịch lên men
o Pipetman 1000µml và 200µml
o Đầu tuýp 1000µml và 200µml
o Parafin lỏng
o Đèn cồn
o Giấy
- Bật đèn UV trong 15 phút, sau đó tắt và chờ thêm 15 phút - Mang ống nghiệm đã tăng sinh vào tủ cấy và bắt đầu cấy - Đốt lửa đèn cồn
- Lau tay bằng cồn 70°
- Mở nắp ống nghiệm tăng sinh, hơ miệng ống nghiệm trên lửa đèn cồn - Dùng Pipetman cho lần lượt vi khuẩn vào dung dịch lên men
- Dùng một đầu tuýp mới cho parafin vào dung dịch lên men đến khi lớp parafin này dày khoảng 3cm
- Đậy nắp bình lên men
- Bọc giấy bạc cho bình để tránh bị nhiễm khuẩn.
2.3.5.5 Phương pháp lấy mẫu
- Chuẩn bị các dụng cụđã được hấp tiệt trùng để cho vào tủ cấy, gồm có:
o Pipetman 1000µml, đầu tuýp 1000µml,đầu lọc 45µm
o Xilanh, eppendof, đèn cồn, cồn 70°, giấy - Chuẩn bị máy ly tâm
- Bật đèn UV trong 15 phút, sau đó tắt và chờ thêm 15 phút - Mang dung dịch đã lên men vào tủ cấy và bắt đầu lấy mẫu - Đốt lửa đèn cồn
- Lau tay bằng cồn 70°
- Mở nắp bình lên men, hơ miệng bình trên lửa đèn cồn
- Dùng Pipetman lấy lần lượt 1ml dịch lên men cho vào các Eppendof
- Cho các Eppendof vào máy ly tâm và chạy ở chế độ 13000 vòng/phút trong vòng 5 phút
- Lấy các Eppendof ra, lọc dung dịch qua đầu lọc 45µm vào một Eppendof khác - Bảo quản Eppendof này ở nhiệt độ 0-4°C trước khi đem phân tích
2.3.5.6 Phương pháp nhuộm đơn
Để có thể rõ hơn về hình dạng và đo kích thước tế bào vi sinh vật, thường dùng phương pháp nhuộm đơn[2].
Phương pháp gồm 3 bước:
Bước 1: Trải trùng (hay làm vết bôi)
Lấy một giọt dung dịch mẫu, trải mỏng trên mặt phiến kính, để khô. Bước 2:Cốđịnh mẫu
Hơ nhẹ phía dưới phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 đến 4 lần.
Mục đích :
Giết chết tế bào sống
Gắn chặt tế bào vào phiến kính khi rửa không bị trôi Làm cho tế bào dễ bắt màu hơn.
Bước 3: nhuộm màu
Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn ( xanh metilen 0.1% hay fuchsin zieh) lên vết trải trong 1-2’
Rửa nước, làm khô,quan sát với vật kính dầu.
2.4 CÁC BƯỚC THÍ NGHIỆM:
2.4.1 Sơđồ nghiên cứu:
Tiền xử lý Î thủy phân Î lên men.
Diễn giải các bước tiến hành thí nghiệm
a/ Giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu: dùng phương pháp cơ học là cắt nhỏ và nghiền rơm rạ thành dạng bột nhỏ, tiếp theo sẽ ngâm trong dung môi cồn hoặc acetone.
b/ Giai đoạn thủy phân: Trước khi thủy phân nguyên liệu đã qua xử lý, chúng ta cần xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân (Xác định tổ hợp enzyme tối ưu, pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu cho enzym hoạt động) bằng cách thủy phân cùng một khối lượng nguyên liệu với các tổ hợp enzym khác nhau, giá trị pH khác nhau, nhiệt độ khác nhau.
Thủy phân với mẫu nguyên liệu đã xử lý bao gồm :
Thủy phân với mẫu ngâm cồn: thủy phân cùng một khối lượng các mẫu nguyên liệu đã ngâm với cồn.
Thủy phân với mẫu ngâm acetone: thủy phân cùng một khối lượng các mẫu nguyên liệu đã ngâm với acetone.
c/ Giai đoạn lên men có 3 bước: Bước 1: Chuẩn bị dịch lên men
Xử lý nguyên liệu: Xử lý mẫu với phương pháp tốt nhất đã tìm ra. Thủy phân lấy dịch: Thủy phân nguyên liệu với các điều kiện tối ưu .
Bước 2: Lên men đối chứng
Khảo sát khả năng lên men tạo butanol của C. Saccharobutylicum
Lên men với môi trường T6 và với dung dịch thủy phân
Bước 3: Nhằm khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, mật độ giống lên quá trình lên men bằng cách lên men với các giá trị pH, nhiệt độ, mật độ giống vi sinh vật khác nhau.
Sau đây là chi tiết từng bước.
2.4.2 Giai đoạn tiền xử lý rơm rạ
2.4.2.1 Tiền xử lý bằng tác nhân vật lý :
- Phương pháp: rơm sau khi thu hoạch được phơi khô, sau đó đem cắt nhuyễn thành từng khúc ( mỗi khúc 1cm) sau đó xay nhuyễn bằng máy nghiền.
2.4.2.2 Tiền xử lý bằng tác nhân hóa học :
Tiền xử lý hóa học bằng tác nhân cồn Thí nghiệm 1:
- Mục đích: khảo sát thời gian ngâm cồn thích hợp nhằm loại bỏ lignin ra khỏi nguyên liệu rơm rạ tạo điều kiện thích hợp cho enzyme thủy phân.
Bố trí thí nghiệm theo bảng 2.1 Bảng 2.1 Xử lý hóa học bằng tác nhân cồn Mẫu C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 Rơm (g) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Ethanol 99o 10 10 10 10 10 10 10 10 Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 8
- Chỉ tiêu theo dõi: màu dung môi, độ giảm của khối lượng rơm tiền xử lý - Yếu tố cốđịnh: nhiệt độ phòng, hàm lượng và nồng độ ethanol
Tiền xử lý hóa học bằng tác nhân acetone Thí nghiệm 2
- Mục đích: khảo sát thời gian ngâm acetone thích hợp nhằm loại bỏ lignin ra khỏi nguyên liệu rơm rạ tạo điều kiện thích hợp cho enzyme thủy phân.
- Tiến hành: Tiến hành thí nghiệm với 8 lô mẫu đánh dấu từ A1 đến A8. Bố trí thí nghiệm như bảng 2.2
Bảng 2.2 Xử lý hóa học bằng tác nhân acetone