L ời cảm ơn
2.4 CÁC BƯỚC THÍ NGHIỆM
2.4.1 Sơđồ nghiên cứu:
Tiền xử lý Î thủy phân Î lên men.
Diễn giải các bước tiến hành thí nghiệm
a/ Giai đoạn tiền xử lý nguyên liệu: dùng phương pháp cơ học là cắt nhỏ và nghiền rơm rạ thành dạng bột nhỏ, tiếp theo sẽ ngâm trong dung môi cồn hoặc acetone.
b/ Giai đoạn thủy phân: Trước khi thủy phân nguyên liệu đã qua xử lý, chúng ta cần xác định các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân (Xác định tổ hợp enzyme tối ưu, pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu cho enzym hoạt động) bằng cách thủy phân cùng một khối lượng nguyên liệu với các tổ hợp enzym khác nhau, giá trị pH khác nhau, nhiệt độ khác nhau.
Thủy phân với mẫu nguyên liệu đã xử lý bao gồm :
Thủy phân với mẫu ngâm cồn: thủy phân cùng một khối lượng các mẫu nguyên liệu đã ngâm với cồn.
Thủy phân với mẫu ngâm acetone: thủy phân cùng một khối lượng các mẫu nguyên liệu đã ngâm với acetone.
c/ Giai đoạn lên men có 3 bước: Bước 1: Chuẩn bị dịch lên men
Xử lý nguyên liệu: Xử lý mẫu với phương pháp tốt nhất đã tìm ra. Thủy phân lấy dịch: Thủy phân nguyên liệu với các điều kiện tối ưu .
Bước 2: Lên men đối chứng
Khảo sát khả năng lên men tạo butanol của C. Saccharobutylicum
Lên men với môi trường T6 và với dung dịch thủy phân
Bước 3: Nhằm khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên men, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, mật độ giống lên quá trình lên men bằng cách lên men với các giá trị pH, nhiệt độ, mật độ giống vi sinh vật khác nhau.
Sau đây là chi tiết từng bước.
2.4.2 Giai đoạn tiền xử lý rơm rạ
2.4.2.1 Tiền xử lý bằng tác nhân vật lý :
- Phương pháp: rơm sau khi thu hoạch được phơi khô, sau đó đem cắt nhuyễn thành từng khúc ( mỗi khúc 1cm) sau đó xay nhuyễn bằng máy nghiền.
2.4.2.2 Tiền xử lý bằng tác nhân hóa học :
Tiền xử lý hóa học bằng tác nhân cồn Thí nghiệm 1:
- Mục đích: khảo sát thời gian ngâm cồn thích hợp nhằm loại bỏ lignin ra khỏi nguyên liệu rơm rạ tạo điều kiện thích hợp cho enzyme thủy phân.
Bố trí thí nghiệm theo bảng 2.1 Bảng 2.1 Xử lý hóa học bằng tác nhân cồn Mẫu C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 Rơm (g) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Ethanol 99o 10 10 10 10 10 10 10 10 Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 8
- Chỉ tiêu theo dõi: màu dung môi, độ giảm của khối lượng rơm tiền xử lý - Yếu tố cốđịnh: nhiệt độ phòng, hàm lượng và nồng độ ethanol
Tiền xử lý hóa học bằng tác nhân acetone Thí nghiệm 2
- Mục đích: khảo sát thời gian ngâm acetone thích hợp nhằm loại bỏ lignin ra khỏi nguyên liệu rơm rạ tạo điều kiện thích hợp cho enzyme thủy phân.
- Tiến hành: Tiến hành thí nghiệm với 8 lô mẫu đánh dấu từ A1 đến A8. Bố trí thí nghiệm như bảng 2.2
Bảng 2.2 Xử lý hóa học bằng tác nhân acetone
Mẫu A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Rơm (g) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Acetone (ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 Thời gian (ngày) 1 2 3 4 5 6 7 8
- Chỉ tiêu theo dõi: màu, độ giảm của khối lượng rơm rạ tiền xử lý. - Yếu tố cốđịnh: nhiệt độ phòng, hàm lượng và nồng độ acetone.
2.4.3 Thủy phân bằng enzym 2.4.3.1 Tối ưu hóa tổ hợp enzym Thí nghiệm 3:
Mục đích: xác định tổ hợp 3 trong 5 enzym, tổ hợp nào tốt nhất cho sự thủy phân rơm rạ.
Tiến hành: Thủy phân một lượng rơm như nhau bằng các tổ hợp enzym khác nhau, đánh giá tổ hợp enzym nào tốt nhất thông qua lượng đường khử tạo ra. Vì novozym là β-glucosidase là enzym quan trọng nên trong mọi tổ hợp đều sử dụng, còn 2 enzym còn lại là tổ hợp chập 2 của 4 enzym còn lại. Do đó có 6 loại tổ hợp được bố trí thí nghiệm như bảng 2.3. Bảng 2.3 Tối ưu hóa tổ hợp enzym Mẫu Rơm nhuyễn chưa xử lý hóa học (g) Tổ hợp enzym(ml) Đệm pH 5.5 (ml) T p/ứ (phút) T oC
T1 0,1 2ml Nov+2ml Celu +2ml Ult 4 60 50 T2 0,1 2ml Nov+2ml celu +2ml vis 4 60 50 T3 0,1 2ml Nov+2ml Celu +2ml She 4 60 50 T4 0,1 2ml Nov+ +2ml Ult +2ml Vis 4 60 50 T5 0,1 2ml Nov +2ml Ult +2ml She 4 60 50 T6 0,1 2ml Nov+2ml Vis +2ml She 4 60 50
- Yếu tố cốđịnh: khối lượng rơm phản ứng ( 0.1g), pH phản ứng 5.5, thời gian phản ứng 60’, nhiệt độ phản ứng 50oC.
- Yếu tố thay đổi: tổ hợp enzym ( Novozym + Celulast + Ultrafol, Novozym + celulast + viscozym, Novozym + Celulast + Shearzym, Novozym+ Ultrafol + Viscozym, Novozym + Ultrafol + Shearzym, Novozym + Viscozym +Sherzym)
Thao tác định lượng đường khử sau khi phản ứng thủy phân bằng enzym:
Sau phản ứng đun sôi diệt enzym trong 10’ tiếp theo ly tâm 5000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy dịch nổi. Từ dung dịch mẫu này hút 1ml pha loãng 100 lần sau đó hút 5ml dung dịch pha loãng phản ứng với 3ml thuốc thử DNS, đo mật độ quang ở 540nm để xác định giá trị OD rồi định lượng đường khử trong mẫu. Dựa vào kết quả lượng đường khử xác định tổ hợp enzym tối ưu .
(tổ hợp enzym tối ưu :Eopt).