L ời cảm ơn
3.3.1 Phản ứng với lượng lớn để thu dịch lên men:
Xử lý 30g rơm với 150 ml aceton trong vòng 3 ngày sau đó thu hồi theo trình tự sau: Mẫu ngâm với acetone sau 3 ngày sẽ đem ly tâm sau đó lọc lấy bã rơm, rửa lại bằng nước cất 2 đến 3 lần, sau đó sấy khô hoặc để khô tự nhiên. Mẫu rơm thu hồi sẽ dùng phản ứng với enzym.
A B
thành màu xanh, rơm bên trong cũng bị mũn ra hơn so với ban đầu.Lượng rơm thu hồi và hiệu suất được trình bày ở bảng 3.9a.
Bảng 3.9a Kết quả xác định lượng rơm thu hồi
Lượng rơm xử lý Lượng rơm thu hồi Hiệu suất.
30g 25.77g 85.90%
.
Thí nghiệm 8: Thủy phân 14g rơm đã xử lý aceton với 200ml tổ hợp enzym tối ưu, nhiệt độ 50oC, pH5.0, thời gian phản ứng là 4 giờ.
Sau phản ứng đun sôi diệt enzym trong 10’ rồi đem ly tâm 5000vòng/phút sau đó lọc qua phễu nhằm mục đích thu dịch và loại bỏ phần rơm thừa chưa phản ứng hết và protein do enzym biến tính, rửa lại bằng nước cất vài lần để tận thu lượng đường còn sót lại trên bã cho đến khi thu được 250ml dịch thủy phân thì dừng lại.
Dung dịch này sẽđược dùng ở giai đoạn lên men. Kết quả : Phân tích thành phần đường khử bằng HPLC
Bảng 3.9b Kết quảđịnh lượng đường khử của dịch thủy phân rơm rạ
Lượng rơm phản ứng (g) Lượng gluose(g) Lượng xylose(g) Lượng fructose (g) Các chất khác (g) Hiệu suất phản ứng enzym (%) 14 2.2 6.85 0.325 4.625 67%
Vì điều kiện chỉ có thể phân tích glucose, xylose và fructose còn những đường khác như mantose, arobinose và các đường khác nữa nhưng chúng có hàm lượng ít . Do đó ởđây chúng tôi tính hiệu suất phản ứng của enzym một cách tương đối như sau:
) (r m
m(glu): khối lượng glucose có trong mẫu m(xyl): khối lượng glucose có trong mẫu m(fru): khối lượng glucose có trong mẫu m(r): khối lượng rơm cho vô phản ứng
Hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân: N= (m(glu) +m(xyl) +m(fru))/ 0.25= 37.5(g/l)
3.3.2 Lên men đối chứng
Trước khi tiến hành các thí nghiệm lên men, thông thường phải kiểm tra xem giống vi sinh vật được sử dụng có thật sự còn hoạt lực hay đã bị thoái hóa giống. Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm đối chứng khả năng lên men của giống theo trình tự ở mục 2.4.4.2 và thu được kết quả dược trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10 Khảo sát khả năng lên men của giống
STT Dung dich lên men Nồng độ
Butanol(g/l)
pH sau khi lên men
Ghi chú
L1 Môi trường T6 37.47 4.52
L2 Dung dịch thủy phân 2.89 4.48
Dựa vào bảng 3.10 chúng tôi thấy giống vi khuẩn đang sử dụng có khả năng lên men tạo butanol trong môi trường T6 và trong dung dịch thủy phân rơm rạ. Đối với môi trường lên men thông dụng (môi trường T6) thì giống vi khuẩn cho kết quả khá tốt 37.47g/l còn đối với dịch thủy phân thì giống cũng lên men tạo được butanol 2.89g/l.
3.3.3Khảo sát các điều kiện tối ưu cho quá trình lên menThí nghiệm 10: Khảo sát pH Thí nghiệm 10: Khảo sát pH
Nhằm xác định pH tốt nhất cho sự lên men của giống, chúng tôi thực hiện thí nghiệm 10 trình bày ở mục 2.4.4.3 Kết thúc thí nghiệm chúng tôi thu được số liệu ở bảng 3.11.
Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH lên quá trình lên men
STT pH Nồng độ Butanol(g/l) pH sau khi lên men Ghi chú.
L3 5.0 0.00 4.44 L4 5.5 0.00 4.43 L5 6.0 0.00 4.45 L6 6.5 0.06 4.45 L7 7.0 0.10 4.50 Tối ưu Dựa vào bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy :
Mẫu L3,L4, L5 không cho ra butanol chứng tỏ pH 5.0, 5.5,6.0 không thích hợp Mẫu L6 và L7 cho ra được butanol 0.06g/l và 0.1g/l vì pH thích hợp với giống. Như vậy pH thích hợp cho giống là trong khoảng 6.5 đến 7.
Kết quả : pH 7.0 cho kết quả tối ưu.
Thí nghiệm 11 : Khảo sát nhiệt độ
Nhằm xác định nhiệt độ tốt nhất cho sự lên men của giống, chúng tôi thực hiện thí nghiệm 11 trình bày ở mục 2.4.4.3. Kết thúc thí nghiệm chúng tôi thu được số liệu ở bảng 3.12.
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men
STT Nhiệt độ(oC) Nồng độ Butanol(g/l) pH sau khi lên men Ghi chú.
L8 31 0.00 4.78 L9 33 0.00 4.84 L10 35 0.00 4.80 L11 37 0.75 4.52 Tối ưu L12 39 0.00 4.82 Dựa vào bảng 3.12 chúng tôi nhận thấy:
Mẫu: L8, L9, L10, L12 đều không có butanol chứng tỏ nhiệt độ 31, 33, 35, 39(oC) đều không thích hợp cho quá trình lên men của giống vi sinh vật đang sử dụng .Có lẽ nhiệt độ 31,33, 35 chỉ giúp vi sinh vật sinh trưởng nhưng không thích hợp cho sự lên men .Ở mẫu L12 cũng chỉ thấy butanol dưới dạng vết, điều đó cho thấy nhiệt độ 390C cũng không thích hợp.Mẫu L11 cho ra được butanol chứng tỏ nhiệt độ 37oC là thích hợp cho sự lên men của giống trong dung dịch thủy phân rơm rạ.
Kết luận : 37oC là nhiệt độ tối ưu.
Thí nghiệm 12: Ảnh hưởng mật độ tế bào
Xác định mật độ tế bào vi khuẩn
Sau khi tăng sinh vi khuẩn trong dung dịch RCM broth trong 24h, ta pha loãng 10 lần, sau đó tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đã được trình bày trong mục 2.3.5.3. Kết quả như sau:
• Ô thứ nhất: 47
• Ô thứ hai: 55
• Ô thứ ba: 43 Tổng: 248 vi khuẩn
• Ô thứ tư: 49 • Ô thứ năm: 54
Từđó tính được số vi khuẩn trong 1ml mẫu: N = [(a/b) × 400/0.1] × 103 × n = [(248/80) × 400/0.1] × 103 × 10
= 1.24×108
Vậy, trong 1ml dung dịch tăng sinh có chứa khoảng 1.24 × 108 vi khuẩn. Từđó, ta có thể tính toán được số vi khuẩn cần cho vào dung dịch lên men để phục vụ cho quá trình thí nghiệm.
Kết quả khảo sát sựảnh hưởng của mật độ tế bào đối với quá trình lên men được trình bày ở bảng 3.13.
Bảng 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng giống lên quá trình lên men
STT Số ml dung dịch giống Nồng độ Butanol(g/l) pH sau khi lên men. Ghi chú L13 0.9(3%) 0.00. 4.84 L14 1.2(4%) 0.00. 4.76 L15 1.5(5%) 1.75 4.48 Tối ưu. L16 1.8(6%) 1.70 4.36 L17 2.1(7%) 0.00. 4.08 Dựa vào bảng 3.13 chúng tôi nhận thấy:
nồng độ lần lượt là 1.75g/l và 1.70g/l .
Ở hàm lượng 3% và 4% không tạo được butanol do mật độ giống ít nên bị nồng độđường trong dung dịch cao ức chế sự tạo thành butanol.
Ở hàm lượng 7% không tạo được butanol do mật độ giống nhiều đã sử dụng lượng đường và tạo ra lượng axit ồ ạt, giảm nhanh pH môi trường làm cho quá trình chuyển hóa từ axit thành dung môi bị ức chế.
Như vậy hàm lượng giống 5% thích hợp nhất cho sự lên men( tương đương số lượng vi khuẩn là 6.2 × 108 ).