Hoàn thiện quy trình lên men pseudomonas sp ở quy mô 5 l và đánh giá hiệu lực của chế phẩm sinh học từ pseudomonas sp phòng ngừa bệnh héo xanh do vi khuẩn ralstonia solanacearum gây ra trên cây cà chua

HCM BÁO CÁO NGHI M THU HOÀN THI N QUY TRÌNH LÊN MEN Pseudomonas sp Ở Q Y 5L Đ U LỰC CỦ Ừ Pseudomona Ừ Ralstonia solanacearum Y CN Trần Hải My T n p H C Min , n 01/2019 Y BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TP.HCM TRUNG TÂM NGHIÊN C U VÀ PHÁT TRI N NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã c ỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) HỒN THI N QUY TRÌNH LÊN MEN Pseudomonas sp Ở Q Y 5L Đ U LỰC CỦ Ừ Pseudomona Ừ Ralstonia solanacearum Y Y ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) Trần Hải My T n p H C Min , n 01/2019 TĨM TẮT Nghiên cứu đánh giá lại tính độc vi khuẩn Ralstonia solanacearum khả đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas ĐL7 với vi khuẩn R solanacearum điều kiện nhà màng Kết cho thấy vi khuẩn R solanacearum có độc tính có khả nhiễm bệnh nhân tạo Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas ĐL7 với vi khuẩn R solanacearum cấp độ đối kháng (tỷ lệ bệnh 33,33%) với mức hoạt tính đối kháng Chủng vi khuẩn Pseudomonas ĐL7 định danh chủng P putida với số tƣơng đồng 98% Quy trình lên men P putida ĐL7 có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum quy mơ lít đƣợc hồn thiện với tỷ lệ giống 5% môi trƣờng NBRIP – rỉ đƣờng với thông số lên men hệ thống bioreactor nhƣ DO 60-80%, pH 7, nhiệt độ 28ºC thời gian lên men 28 Nghiên cứu tạo đƣợc quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ vi khuẩn P putida ĐL7 Sau tháng bảo quản, mật độ vi khuẩn P putida ĐL7 chế phẩm 2,76 x 108 CFU/g, độ ẩm 18,14% hoạt tính đối kháng với vi khuẩn R solanacearum giữ ổn định (8 ± 0,2 mm) Ở phạm vi nghiên cứu này, liều lƣợng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn P putida ĐL7 g/cây xem mức tối thiểu mang lại hiệu lực phòng ngừa bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum gây cà chua (khoảng 65,00%) điều kiện nhà màng Từ khóa: bệnh héo xanh, đối kháng, Pseudomonas, Ralstonia solanacearum Trang i BM20-QT.QLKH MỤC LỤC Trang TÓM TẮT i MỤC LỤC ii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH viii THÔNG TIN ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu chung bệnh héo xanh 1.2 Sơ lƣợc vi khuẩn R solanacearum 1.2.1 Đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn R solanacearum 1.2.2 Các hình thức xâm nhập R Solanacearum vào chủ 1.3 Một số biện pháp phòng ngừa bệnh héo xanh cà chua 1.3.1 Biện pháp canh tác 1.3.2 Biện pháp hóa học 1.3.3 Biện pháp sinh học 1.4 Sơ lƣợc vi khuẩn Pseudomonas sp chế đối kháng Ralstonia solanacearum 1.4.1 Sơ lƣợc vi khuẩn Pseudomonas sp 1.4.2 Cơ chế đối kháng Pseudomonas Ralstonia solanacearum 10 1.5 Một số nghiên cứu nƣớc 10 1.6 Sơ lƣợc kết nghiên cứu 2014 11 CHƢƠNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 Trang ii BM20-QT.QLKH 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 2.1.1 Thời gian 13 2.1.2 Địa điểm 13 2.2 Vật liệu hóa chất 13 2.2.1 Vật liệu 13 2.2.2 Hóa chất 13 2.3 Nội dung nghiên cứu 14 2.4 Phƣơng pháp thực xử lý thống kê 15 2.4.1 Nội dung 1: Đánh giá lại khả đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas sp với vi khuẩn R solanacearum 15 2.4.2 Nội dung 2: Hồn thiện quy trình lên men Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum quy mơ lít 18 2.4.3 Nội dung 3: Đánh giá thời gian bảo quản chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 20 2.4.4 Nội dung 4: Xác định hiệu lực liều lƣợng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum điều kiện nhà màng 22 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Nội dung 1: Đánh giá lại khả đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas sp với vi khuẩn R solanacearum 25 3.1.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá lại tính độc vi khuẩn R solanacearum 25 3.1.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá lại khả đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas sp với vi khuẩn R solanacearum điều kiện nhà màng 26 3.2 Nội dung 2: Hồn thiện quy trình lên men Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum quy mơ lít 28 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng oxy hòa tan (DO - dissolved oxygen) đến trình nhân giống vi khuẩn Pseudomonas sp hệ thống bioreactor 28 Trang iii BM20-QT.QLKH 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ giống thời gian thu sinh khối Pseudomonas sp thích hợp hệ thống bioreactor 32 3.3 Nội dung 3: Đánh giá thời gian bảo quản chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 34 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát chất độn thích hợp cho vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 34 3.3.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá thời gian bảo quản chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 37 3.4 Nội dung 4: Xác định hiệu lực liều lƣợng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum điều kiện nhà màng 39 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Kiến nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 PHỤ LỤC Trang iv BM20-QT.QLKH DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ tiếng việt ctv Cộng tác viên DO Dissolved oxygen ĐC Đối chứng MĐTB Mật độ tế bào MT Môi trƣờng NT Nghiệm thức Trang v BM20-QT.QLKH DANH SÁCH BẢNG Bảng Tựa bảng 1.1 Các race quan trọng, ký chủ phân bố địa lý R solanacearum Trang 2.1 Các nghiệm thức đánh giá lại khả đối kháng chủng vi khuẩn Pseudomonas sp với vi khuẩn R solanacearum điều kiện nhà màng 16 2.2 Mức độ hoạt tính đối kháng (TCVN 9300:2014) 18 2.3 Các nghiệm thức khảo sát hàm lƣợng oxy hòa tan (%) 18 2.4 Các nghiệm thức khảo sát tỷ lệ giống (%) 19 2.5 Sơ đồ thí nghiệm 23 3.1 Tỷ lệ cà chua bị bệnh sau 21 ngày gieo trồng 25 3.2 Tỷ lệ cà chua bị bệnh sau 21 ngày gieo trồng 27 3.3 Một số tiêu kim loại nặng rỉ đƣờng 28 3.4 Ảnh hƣởng hàm lƣợng oxy hòa tan (DO) đến mật độ tế bào vi khuẩn P putida ĐL7 hệ thống bioreactor 30 3.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống ban đầu (%) đến mật độ tế bào vi khuẩn P putida ĐL7 hệ thống bioreactor 32 3.6 Một số tính chất than bùn 35 3.7 Một số tính chất phân trùn quế 35 3.8 Hoạt tính đối kháng chủng vi khuẩn P putida ĐL7 với vi khuẩn R solanacearum chất độn sau tháng bảo quản 36 3.9 Mật độ tế bào vi khuẩn chất độn sau tháng bảo quản 36 3.10 Hoạt tính đối kháng mật độ tế bào vi khuẩn chất độn sau tháng bảo quản 38 3.11 Một số đặc tính đất trồng 39 3.12 Tỷ lệ bị bệnh (%) sau 35 ngày nhiễm bệnh 40 3.13 Hiệu lực phòng ngừa bệnh héo xanh chế phẩm sinh học từ vi khuẩn P putida Trang vi BM20-QT.QLKH ĐL7 cà chua 41 3.14 So sánh kết nghiên cứu 2018 nghiên cứu năm 2014 45 Trang vii BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH Hình Tựa hình 3.1 Triệu chứng bệnh héo xanh cà chua Trang 26 3.2 Ảnh hƣởng hàm lƣợng oxy hòa tan (DO) đến mật độ tế bào vi khuẩn P putida ĐL7 hệ thống bioreactor 31 3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống ban đầu (%) đến mật độ tế bào vi khuẩn P putida ĐL7 hệ thống bioreactor 33 3.4 Lên men vi khuẩn P putida ĐL7 hệ thống bioreactor 34 3.5 Hoạt tính đối kháng R solanacearum vi khuẩn P putida ĐL7 38 3.6 Cây cà chua sau gần 30 ngày trồng 42 3.7 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ P putida ĐL7 có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum 43 Trang viii BM20-QT.QLKH A Source Model Error Corrected Total Source NT Source Model Error Corrected Total Source NT Source Model Error Corrected Total Source NT 13.39333 NT1 Mat te bao vi khuan sau thang bao quan The ANOVA Procedure Sum of DF Squares Mean Square F Value Pr > F 1.09226667 1.09226667 819.20 F 1.09226667 1.09226667 819.20 F F F F F Model 0.00015000 0.00015000 0.04 0.8556 Error 0.01593333 0.00398333 Corrected Total 0.01608333 R-Square Coeff Var Root MSE HTVK Mean 0.009326 0.776465 0.063114 8.128333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.00015000 0.00015000 0.04 0.8556 t Tests (LSD) for HTVK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.003983 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.1431 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NT A 8.13333 NT1 A A 8.12333 NT2 Hoat tinh vi khuan sau thang bao quan The ANOVA Procedure Dependent Variable: HTVK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.00006667 0.00006667 0.00 0.9504 Error 0.06086667 0.01521667 Corrected Total 0.06093333 R-Square Coeff Var Root MSE HTVK Mean 0.001094 1.522285 0.123356 8.103333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.00006667 0.00006667 0.00 0.9504 t Tests (LSD) for HTVK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.015217 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.2796 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NT A 8.1067 NT1 A A 8.1000 NT2 Hoat tinh vi khuan sau thang bao quan The ANOVA Procedure Dependent Variable: HTVK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.00001667 0.00001667 0.00 0.9781 Error 0.07846667 0.01961667 Corrected Total 0.07848333 R-Square Coeff Var Root MSE HTVK Mean 0.000212 1.731624 0.140060 8.088333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.00001667 0.00001667 0.00 0.9781 t Tests (LSD) for HTVK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.019617 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.3175 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NT A 8.0900 NT2 A A 8.0867 NT1 Hoat tinh vi khuan sau thang bao quan The ANOVA Procedure Dependent Variable: HTVK Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.00041667 0.00041667 0.02 0.8893 Error 0.07586667 0.01896667 Corrected Total 0.07628333 R-Square Coeff Var Root MSE HTVK Mean 0.005462 1.706914 0.137720 8.068333 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0.00041667 0.00041667 0.02 0.8893 t Tests (LSD) for HTVK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.018967 Critical Value of t 2.77645 Least Significant Difference 0.3122 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NT A 8.0767 NT2 A A 8.0600 NT1 2.3.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá thời gian bảo quản chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum Mat te bao vi khuan sau thang bao quan The ANOVA Procedure Dependent Variable: MDTB Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 68.92609524 11.48768254 14190.7 F NT 68.92609524 11.48768254 14190.7 F 0.9937 Pr > F NT 0.00732381 0.00122063 0.11 0.9937 t Tests (LSD) for HTVK NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 14 Error Mean Square 0.011086 Critical Value of t 2.14479 Least Significant Difference 0.1844 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NT A 8.11333 A A 8.10000 A A 8.10000 A A 8.08000 3 A A 8.07333 A A 8.07000 A A 8.05667 2.4.4 Nội dung 4: Xác định hiệu lực liều lƣợng chế phẩm sinh học từ vi khuẩn Pseudomonas sp có khả đối kháng với vi khuẩn R solanacearum điều iện nhà màng Source Model Error Corrected Total Source K N D N*D Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 24.63994028 0.50285592 1068.25 F 0.00248472 0.00124236 2.64 0.0767 14.25555556 2.03650794 4326.28