Hoàn thiện quy trình nhân nuôi tảo haematococcus pluvialis giàu astaxanthin ở quy mô 20 lít nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất sinh khối

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CƠNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN NI TẢO Haematococcus pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN Ở QUY MƠ 20 LÍT NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ SẢN XUẤT SINH KHỐI KS Trương Thị Thúy Hằng ThS Nguyễn Thị Kim Liên Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2018 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP HCM TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đờng nghiệm thu) HỒN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN NI TẢO Haematococcus pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN Ở QUY MƠ 20 LÍT NHẰM NÂNG CAO HIỆU QUẢ SẢN XUẤT SINH KHỐI CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Thành phố Hờ Chí Minh, tháng 01/2018 TĨM T T tài Hồn thi n quy trình nhân ni t o Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin quy mơ 20 lít nh m nâng cao hi u qu s n xu t sinh kh i g m hai n i dung: (1) Nâng cao hi u qu s n xu t sinh kh i t o H pluvialis; (2) ch c ly trích t t o H pluvialis ng ch ph c quy trình ni t o Haematococcus pluvialis giàu K t qu astaxanthin quy mơ 20 lít: t o H pluvialis pha tro t nuôi c y t TB/ml, c nuôi sinh kh i theo quy trình hai u ki n t ng RM-4X ng v /s, th i gian chi u sáng 12 gi , s c khí 24/24 cm c i 4x106 TB/ml, sau 12 14 ngày t chi u sáng lên 120 mol/m2/s, nhi 12 gi ) v u 5x105 chi u sáng 90 ng CO2 18ppm), t o c chuy n sang pha 350C, th i gian chi u sáng t giá tr t sinh kh ii t 0,019 g/L/ngày Hàm M CL C Trang ph bìa i Tóm t t ii M cl c iii Danh sách ch vi t t t v Danh sách b ng vi Danh sách hình vii PH N M U TÀI - T NG QUAN TÀI LI U m sinh h c t o Haematococcus pluvialis 1.1.1 V trí phân lo i m hình thái 1.1.3 1.1.4 Các y u t ng c a H n t pluvialis 1.3 M t s k t qu nghiên c u v t o H pluvialis 1.3.1.Trên th gi i c 14 -N 2.1 Th U m nghiên c u 18 18 2.2 N i dung nghiên c u 18 18 b trí thí nghi m 18 2.4.1 Hồn thi n quy trình ni sinh kh i t o H pluvialis giàu astaxanthin 18 quy mơ 20 lít 2.4.2 ng c a H pluvialis 2.4.3 ng ch ph quy mô nuôi 20 lít 20 c ly trích t 21 t o H pluvialis 2.4.3.1 Thu nh n astaxanthin t sinh kh i t o H pluvialis iii 21 nh tính ch ph m astaxanthin b ng ch tiêu sinh hóa 22 (HPLC) 2.5 Các ch tiêu theo dõi thí nghi m 23 2.5 23 nh m 2.5.2 t bào t o ng s c t astaxanthin 2.5.3 n astaxanthinsau ly trích 2.5.4 23 nh tính astaxanthin 24 25 - K T QU VÀ TH O LU N a t o H 3.1 Hình thái t 23 25 pluvialis ng t o H pluvialis 3.2 quy mơ 20 lít 26 3.3 29 3.4 ng ch ph c ly trích t 30 t o H pluvialis - K T LU NGH 4.1 K t lu n 40 40 ngh 40 TÀI LI U THAM KH O 41 PH L C 46 iv DANH SÁCH CÁC CH CS VI T T T C ng s M t bào NTTS Nuôi tr ng th y s n SKK Sinh kh i khô v DANH SÁCH CÁC B NG TRANG 3.1 M t bào t o H pluvialis sau 18 ngày nuôi 3.2 ng c a t o H pluvialis 3.3 ng astaxanthin sau ly trích 3.4 ng astaxanthin tinh t 3.5 Chi phí cho 0,1 gram astaxanthin quy mơ 20 lít quy mơ 20 lít 26 29 30 34 vi 34 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 3.1 TRANG S i c a t o H i hình thái t pluvialis 3.2 S i t bào t o H pluvialis theo th i gian nuôi c y 3.3 S c a ch t chu n astaxanthin (Sigma) 3.4 S c a 10 m u phân tích 3.5 Hình nh minh h a quy trình tách chi t astaxanthin 25 29 31 33 vii 39 PH N M U Astaxanthin m t lo i carotenoid có tác d m t s b nh, t o màu s c h p d n nghi p, th c ph m, y h ng, kháng c ng d i r ng rãi nông c bi t k thu t ni cá h 2015, 2016 nhóm cán b nghiên c u c n hành nuôi sinh kh i t o ly trích astaxanthin t t o Haematococcus pluvialis (H pluvialis) s k t qu : t o H pluvialis v i pha I s d c ni theo quy trình ni c y pha ng l ng RM, m ng v chi 12 gi K t qu t 4,93x105 t t 5144 m tách chi th ng astaxanthin sau ly c th ch ng astaxanthin sau tinh t Do v y, nh m c quy trình ni t o Haematococcus pluvialis c ch /s, th i gian chi u sáng m t 2,34 - 2,61%/SKK Song k t qu cho th y it nh /s, th i gian chi u sáng ng 18ppm cho t o quang h p; pha t quy mơ 20 lít u 0,5x105 TB/ml, ánh t chi 12 gi , s c khí liên t c, cung c p khí CO2 v cm t ng c t sinh kh ng xu tài n quy trình nhân ni t o Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin quy mơ 20 lít nh m nâng cao hi u qu s n xu t sinh kh TÀI Hồn thi n quy trình nhân ni t o Haematococcus pluvialis tài/d giàu astaxanthin quy mơ 20 lít nh m nâng cao hi u qu s n xu t sinh kh i Ch nhi tài/d án: Ks Thúy H ng & Ths Nguy n Th Kim Liên trì: Trung tâm Nghiên c u Phát tri n Nơng nghi p Cơng Ngh Cao, thành ph H Chí Minh Th i gian th c hi n: t tháng 3/2017 c t: 178.149.000 n tháng 12/2017 ng M c tiêu: Nâng cao hi u qu s n xu t sinh kh i t o H pluvialis ph S n ph m c c ly trích t t o H pluvialis tài /d án: - Báo cáo khoa h c quy trình ni t o giàu astaxanthin - 200 gram sinh kh i t o ng ch D a vào b t tinh t t n r t nhi nh c ký l ng hi u su t cao (HPLC) ch nh tính astaxanthin ch áp d ng vào vi c s n xu t t o s n ph m astaxanthin Vì v nh m làm gi m giá thành s n ph c nuôi tr ng th y s n, ng th ngh s d ng tr c ti p sinh kh i t o d u qu s d ng ki n tr n tr c ti p vào th QUY TRÌNH NI SINH KH I T O Haematococcus pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN QUY MƠ BÌNH 20 LÍT quy trình ni c y: Ni tr ng H pluvialis ng nghi m (1) Nuôi tr ng H pluvialis bình erlen 500 ml (2) (a) Ni tr ng H pluvialis bình erlen 2000 ml (3) Ni tr ng H pluvialis bình th y tinh 15 lít (4) Ni tr ng H pluvialis bình nh a 20 lít (5) G (b) (6) Ly trích astaxanthin (a) nh tính n nhân gi ng nuôi sinh kh i t o H pluvialis (1) C y chuy n m u t o gi ng t ng nghi m vào bình erlen 500 ml Sinh kh i t o gi gi ng ng nghi c c y chuy n sang c ng l ng RM-4X, s d 35 bình tr ng v chi liên t c, s d u ch /s, th i gian chi u sáng 12 gi , s c khí ng CO2 v u 5x105 TB/ml T quang h ng 18ppm cho t o c ti p t c ni phịng thí trì 25 - 270C nghi m v i nhi (2) C y chuy n t o t bình erlen 500 ml sang bình erlen 2000 ml Sau - ngày ni c y c bình erlen 500 ml, sinh kh i t chuy n b ng cách pha loãng m u theo t l d cc y ng l ng RM-4X, s ng v chi /s, th i gian chi u sáng 12 gi , s c khí liên t c, cung c p khí CO2 cho t o quang h p chuy n t t 5x105 TB/ml T c ti p t c ni phịng thí nghi m v i nhi trì 25-270C (3)(4) n s n xu t sinh kh i t o bình 20 lít Sau - ngày ni c y c bình erlen 2000 ml, sinh kh i t chuy n vào pha ni bình nh a th lít v n lên thành 20 u ki n thu n l i cho vi c nhân sinh kh i t u ki n nuôi c y t c tm t bào c i ng l ng RM-4X, s d led màu tr ng v chi s c khí liên t c, cung c p khí CO2 v ng 18ppm cho t o quang h p t 5x105 TB/ml T v i nhi trì 25 - 270C (b) n /s, th i gian chi u sáng 12 gi , c ti p t c ni phịng thí nghi m n s c t astaxanthin (5) T i c ni ,t bình nh a 20 lít sau 12 c chuy n sang pha b chi sáng lên 120 mol/m2/s, v i nhi 14 ngày t u ch nh b ngu n h th ng ki m soát nh chi u 350C th i gian chi u sáng 12 gi thích t bào t o chuy n t c c kích ng (màu xanh) sang d ng nang bào hoàn ch ng astaxanthin (6) - Thu nh n astaxanthin b t b t th y tinh acetone (Sarada, 2006) 36 H pluvialis ô C Haematococcus pluvialis â òng/phút 10 phút, thu ình lóng, thê í êm 5ml NaCl bão hịa ơng tách pha Thu pha diethyl ethe ía trê dung mơ ía - ịn só Q trình thí ù ình hú ân khơ C (6) - nh tính ch ph m astaxanthin b ng ch tiêu sinh hóa (HPLC) Chi t xu c phân tích b 10A) phân tích b ng cách s d ng c t C18 (c a cơng ty Supelco, 25 cm × 4,6 mm) c s d ng v i t 1,25 ml/phút bao g m (A) acetone (B) methanol : H2O (9: v/v) Vi c b ng m t gradient gi y n 20 % 25 phút, n 80 % phút Các carotenoid este nh b ng cách s d ng m t m h p th nh c tích h p ng astaxanthin cs d sánh v i k t qu c (Sarada R ctv, 2006) 37 so Hình nh minh h a quy trình tách chi t astaxanthin: Sinh kh i t o ch a astaxanthin Lo i Chlorophyll C n t o sau chi t 38 B sung dung môi tách chi t S tách pha Lo i b D ch chi t ch a s c t astaxanthin 39 c Astaxanthin sau ly trích Hình 3.5 Hình nh minh h a quy trình tách chi t astaxanthin K T LU NGH 4.1 K t lu n T o H pluvialis nuôi c y t c nuôi sinh kh i theo quy trình hai pha t u 5x105 TB/ml, ng RM- u ki n t 4X, ánh ng v sáng 12 gi , s c khí 24/24 4x106 TB/ml, sau 12 astaxanthin /s, th i gian chi u ng CO2 18ppm), t o 14 ngày t sáng lên 120 mol/m2/s, nhi chi cm c chuy n sang pha ( c i chi u 350C, th i gian chi u sáng 12 gi ) v ng t giá tr t sinh kh i t 0,019 g/L/ngày 27,8 ppm ngh t o s n ph m astaxanthin tinh t t n chi phí r t cao Vì v y c nuôi tr ng th y s ngh s d ng tr c ti p sinh kh i t o c có ch a s c t astaxanthin t s n ph m c nh m làm gi m giá thành s n ph m, ti t ki 40 ph i tr n tr c ti p u qu s d ng TÀI LI U THAM KH O Tài li u ti ng vi t [1] Tâm, Nguy n Th Thu Th ng Di m H ng, i c a vi t o Haematococcus pluvialis 2011 Nghiên c u ki n phịng thí nghi m T p chí sinh h c 34 (1) [2] ng Di m H c Hoàng, Nguy n Th Th y, Hoàng Th Lan Anh, 2010 L a ch nuôi tr ng vi t o l c Haematococcus pluvialis ng t giàu astaxanthin T p chí sinh h c 32 (2) 43 53 [3] ng Di m H Ng Tâm, Nguy n Th Thu Th y,Nguy n C m Hà, Lê Th c Hoàng, Hoàng Lan Anh, [4] Lê Thanh Hùng, 2008 Th ng thu s n Nhà xu t b n Nông Nghi p TP HCM, 299 trang [5] Lê Thái Na, 2015 Kh o sát astaxanthin c ng c vi t o Haematococcus pluvialis ns u ki n bình ni tài nghiên ng xuyên Trung tâm Nghiên c u Phát tri n Nông nghi p công ngh cao [6] Nguy ng Võ Th D Qu nh, 2013 Phá v t bào Spirulina platensis b ng máy nghi thu nh n ch t có ho t tính sinh h c T p chí Khoa h c Cơng ngh 6(67) 41 [7] Nguy n Th Kim Liên, 2015 Kh o sát ch vi t o Haematococcus pluvialis astaxanthin tài nghiên c ánh sáng thích h y u ki n phịng thí nghi m ng xun Trung tâm Nghiên c u Phát tri n Nông nghi p công ngh cao [8] Nguy n Th Thu Th y, 2012 T u ki n ni lồi vi t o l c Haematococcus pluvialis h th ng photobioreactor kín lít Lu quy mơ dung tích 20 i h c Thái Nguyên [9] i Nghi p, 2017 Nghiên c u quy trình s n xu t astaxanthin -glucan b sung vào th tài S Khoa h c Công Ngh thành ph H Chí Minh [10] Ngơ Th Hồi Thu, 2012 ng k t h p c a n ng c a vi t o Haematococcus pluvialis T p chí sinh h c 34 chi (4) 493 499 [11] Lê Th inh Th Ng c Mai, Hoàng Th Lan Anh, Ngơ Th Hồi Thu, Nguy n C ng Di m H ng, 2013 ng c a n ng c a vi t o l c Haematococcus pluvialis u ki n phịng thí nghi m T p chí sinh h c 35 (2): 219-226 [12] Ng c Mai, Ngô Th Hoài Thu, Hoàng Th mu ng c a n a vi t o Haematococcus ng kh pluvialis 213 ng Di m H ng, 2012 Nghiên c u u cho qui trình ni c y pha T p chí sinh h c 34 (2): 223 [13] ng quy trình ng carotenoid m t s ch ph ng Y H c TP H Chí Minh , 2014, 18 (2): 182 187 Tài li u ti ng anh [14] Aflalo, Y Meshulam, A Zarka, and S Boussiba, 2007 On the relative efficiency of two- vs one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematococcus pluvialis Biotechnology and Bioengineering, 98(1): 300 305 [15] Bon J.A., Leathers T.D and Jayaswal R.K.,1997 Isolation of astaxanthin overproducing mutants of Phaffiarhodozyma Biotechnol Lett., 19: 109-112 42 [16] Boussiba S and Vonshak A., 1991 Plant cell physiol 32, 1077 1082 [17] Bubrick P., 1991 Bioresource technology, 38: 327 329 [18] Ciapara I.H., Elix-Valenzuela L.F and Goycoolea F.M., 2006 Astaxanthin: A Review of its Chemistry and Applications Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Mexico, 46:185-196 [19] Cheng-Wu Z., Jin Y., Ming W., Tao L., Ai-Fen L., 2011 Effects of NitrateNitrogen Stress on Pigment Content and Antioxidant Systems in Haematococcus pluvialis Plant Physiology Journal 47(2): 147-152 [20] Choi H.D., Kim J.H., Chang M.J., Kyu-Youn Y and Shin W.G., 2011.Effects of astaxanthin on oxidative stress in overweight and obese adults Phytother Research 25: 1813-1818 [21] Del Rio E, Acien FG, Garcia-Malea MC, Rivas, Molina-Grima E and Guerrero MG (2005) Efficient one-step production of astaxanthin by the microalga Haematococcus pluvialis in continuous culture Biotechnol Bioeng., 91(7): 808-815 [22] Dominguez-Bocanegra A.R., Guerrero L I., Martinez J F and Tomasini C F., 2004 Influence of environmental and nutiritionalfactors in the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis Bioresour.Technol 92: 209-214 [23] Droop M.R., 1994 Condition governing Haematococcus formation and loss of alga Haematococcus pluvialis Flotow Arch Microbiol 20: 391 397 [24] Droop M.R., 1995 Carotenogenesis in Haematococcus pluvialis Nature, 175 42 [25] Esra Imamoglu., Meltem Conk Dalay and Fazilet Vardar Sukan., 2009 Influences of different stress media and high light intensities on accumulation of astaxanthin in the green alga Haematococcus pluvialis New Biotechnology , 26-34 [26] Fábregas J., Domínguez A., Álvarez D G., Lamela T., Otero A (1988) Induction of astaxanthin accumulation by nitrogen and magnesium deficiencies in Haematococcus pluvialis Biotechnology Letters 20(6): 623-626 [27] Fábregas J., Otero A., Maseda A and Domínguez A., 2001 Two-stage for production of Astaxanthin from Haematococus pluvialis Journal of Biotechnology 89: 65-71 [28] Garcia Malea and et al., 2006 Enzyme and microbial technology, 38: 981 989 43 [29] Hagen C and et al., 1993 J Photochem photobiol biol, 20: 153 160 [30] Harker M and et al., 1996 Fermentation andbioengineering, 82 (2): 113 118 [31] Hata N., Ogbonna J.C., Hasegawa Y.,Taroda H and Tanaka H., 2001 Productionof astaxanthin by Haematococcus pluvialisin a sequential heterotrophicphotoautotrophicculture J Appl Phycol.,13: 395-402 [32] Issarapayup K, Powtongsook S and Pavasant P, 2011 Economicalreview of Haematococcus pluvialis culture in flat panelairlift photobioreactors Aquacult Eng., 44: 65-71 [33] Jeffrey S.W and et al., 1997 Phytoplankton pigments in oceanography: Guidelines to modern methods Unesco, paris: 37 84 [34] Junfeng Wang & Danxiang Han & Milton R Sommerfeld & Congming Lu & Qiang Hu., 2013 Effect of initial biomass density on growth and astaxanthin production of Haematococcus pluvialis in an outdoor photobioreactor Journal of Applide Phycogyl 25:253 260 [35] Kaewpintong K., 2004 Cultivation of Haematococcus pluvialis in airlift bioreactor Master thesis of Chulalongkorn University: 113pp [36] Kang C D (2007) Phytoplankton Pigments in Oceanography: Guidelines to Modern Methods UNESCO, Paris: 37:84 [37] Keong W.Ng., 2002 Palm Oil: Alternative Lipid Source in Aquaculture Feeds School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia [38] Kobayashi M, Kakizono T, Nishio N, Nagai S., 1992 Effects of Light Intensity, Light Quality, and Illumination Cycle on Astaxanthin Formation in a Green Alga, Haematococcus pluvialis Journal Of Fermentation And Bioengineering 74 (1): 61-63 [39] Kobayshi M., 1997 Morphological changes in the life cycle of the green alga Haematococcus pluvialis Journalo Fermentatioann Bioengineering 84:94-97 [40] Lee YK and Ding SY, 1995 Effect of dissolved oxygen partial pressure on the accumulation of astaxanthin in chemostat cultures of Haematococcus lacustris (Chlorophyta) J Phycol., 31: 922-924 [41] Lee Y.K and Soh C.W., 1991 Phycol, 27: 575 577 44 [42] Lorenz R.T and Cysewski G R., 2000 Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source ofastaxanthin TibTech., 18: 160-167 [43] Lorenz R.T and Cysewski G.R., 2000 Trends biotechmol, 18: 160 167 [44] Lorenz R.T and Cysewski G.R., 2000 Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin TIBTECH APRIL 2000 (Vol 18) Elsevier Science Ltd [45] Lovatelli Alessandro and ChenJiaxin., 2009 Use of environmental friendly feed additives and probiotics in Chinese aquaculture Yellow Sea Fisheries Research Institute, China [46] Makio Kobayashi., 1997 Morphological Changes in the Life Cycle of the Green Alga Haematococcus pluvialis Journalo F Fermentatioann D Bioengineering 84:94-97 [47] Miki W., 1991 Biological functions andactivities of animal carotenoids Pure Appl.Chem., 63: 141-146 [48] Olaizola M., 2000 Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreactors J Appl Phycol., 12: 499-506 [49] Oncel SS, Imamoglu E, Gunerken E and Sukan FV, 2011 Comparison of different cultivation modes and light intensities using mono-cultures and co-cultures of Haematococcus pluvialis and Chlorella zofingiensis J Chem Technol Biotechnol., 86: 414-420 [50] Proctor VW, 1957 Some Controlling Factors in the Distribution of Haematococcus pluvialis Ecology, 38(3): 457-462 [51] Ranjbar R., Inoue R., Shiraishi H., Katsuda T and Katoh S., 2008 High efficiency production of astaxanthin by autotrophic cultivation of Haematococcus pluvialis in abubble column photobioreactor Biochemical Engineering Journal, 39: 575-580 [52] Sarada R., Vidhyavathi, R., Usha, D and Ravishankar, G.A (2006), "An Efficient Method for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis", J Agric Food Chem 45 [53] Yuan J P and Chen F., 2001 Indirect photometric ion chromatographic analysisof anions in Haematococcus pluvialis culture media Biotechol Lett., 23: 757-760 PH L C PH L C - -4X NaNO3 1200 K2HPO4 80 KH2PO4 20 MgSO4.7H2O 10 CaCl2.2H2O 58,5 EDTA 7,5 NaCl 20 H3BO3 0,3 MnSO4.H2O 1,5 ZnSO4.7H2O 0,1 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.3 CuSO4.5H2O 0,08 Co(NO3)2.6H2O 0,26 46 FeCl3.6H2O 17 Hình nh minh h a quy trình nuôi sinh kh i t o H.pluvialis : T o H pluvialis quy mô 1000ml sau ngày nuôi T o H pluvialis quy mô 2000ml sau 10 ngày nuôi 47 T o H pluvialis quy mơ 10lít sau ngày ni T o H pluvialis quy mơ 20lít sau 14 ngày nuôi 48 T o H pluvialis sau ngày gây s Sinh kh i t thành bình nuôi c ch a s c t astaxanthin 49