Nghiên cứu quy trình nhân sinh khối giống tảo haematococcus pluvialis giàu astaxanthin ở quy mô bình 20 lít

N QU N L KHU N NG NGHI P Ứ NG NGH O TP HCM Ể BÁO CÁO NGHI M THU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI TẢO Haematococcus pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN Ở QUY MƠ BÌNH 20 LÍT ThS.Nguyễn Thị Kim Liên KS Trương Thị Thúy Hằng Th nh ph H h Minh, h ng 01/2017 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN SINH KHỐI TẢO Haematococcus pluvialis GIÀU ASTAXANTHIN Ở QUY MƠ BÌNH 20 LÍT ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph H CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) h Minh, h ng 01/2017 TĨM TẮT Đề tài nghiên cứu quy trình nhân sinh khối tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin quy mơ bình 20 lít thực với hai nội dung chính: (1) Xây dựng quy trình ni cấy tảo H pluvialis giàu astaxanthin quy mơ 20 lít; (2) Nghiên cứu quy trình tách chiết astaxanthin từ tảo H pluvialis Kết ghi nhận, tảo H pluvialis nuôi theo quy trình ni cấy pha quy mơ 20 lít: với pha I sử dụng môi trường lỏng RM, mật độ tảo ban đầu 105 T /ml, ánh sáng đèn led màu trắng với cường độ chiếu sáng 90 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ, sục khí liên tục, cung cấp khí CO2 với hàm lượng 18 ppmcho tảo quang hợp; pha cường độ chiếu sáng 120 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 Kết MĐT tảo đạt cao 4,93x105 T /ml, hàm lượng sắc tố astaxanthin (carotenoid) đạt 3142,93 µg/L, q trình tích lũy astaxanthin làm hao hụt lượng lớn nitơ từ 112,42 mg/L xuống 60,23 mg/L, hàm lượng astaxanthin sau ly trích đạt từ 5144 - 7535,8 μg/L chiếm từ 2,34 - 2,61%/SKK MỤC LỤC Trang phụ bìa i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt v Danh sách hình vi PHẦN MỞ ĐẦU TH NG TIN ĐỀ TÀI ƯƠ - TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Đặc điểm sinh học tảo Haematococcus pluvialis 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng giá trị sử dụng 1.1.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng H pluvialis 1.3 Một số kết nghiên cứu tảo Haematococcus pluvialis 11 1.3.1.Trên giới 11 1.3.2 Trong nước 14 ƯƠ 2- NỘ D ƯƠ NGHIÊN CỨU 19 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Vật liệu nghi n cứu 19 2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 19 2.4.1 Nhân giống tảo H pluvialis phòng thí nghiệm 19 2.4.2 Sơ đồ quy trình ni tảo Haematococcus pluvialis pha 20 giàu astaxanthin quy mô 20 lít 2.4.3 Quy trình tách chiết asatxanthin từ tảo H pluvialis 22 2.5 Các tiêu theo dõi thí nghiệm 22 2.5.1 Phương pháp xác định mật độ tế bào tảo 22 2.5.2 Phương pháp định lượng hàm lượng sắc tố astaxanthin 23 2.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số 23 2.5.4 Phương pháp tách chiết astaxanthin 23 ƯƠ - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Hình thái tế bào giai đoạn đặc trưng tảo H pluvialis 25 3.2 Đánh giá sinh trưởng tảo H pluvialis quy mô 20 lít 26 3.3 Hàm lượng sắc tố astaxanthin (carotenoid) suốt q trình ni cấy 29 3.4 Mối tương quan yếu tố nitơ tích lũy astaxanthin suốt q trình ni cấy tảo H pluvialis 32 3.5 Quá trình chiết xuất astaxanthin 35 ƯƠ - KẾT LUẬ ĐỀ NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Đề nghị 45 TÀI LI U THAM KH O 46 PHỤ LỤC 51 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ế Ắ Ậ Ữ CS Cộng MĐT Mật độ tế bào NTTS Nuôi trồng thủy sản SKK Sinh khối khô MĐT Mật độ tế bào Ế DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Ì Ả TRANG 1.1 Sự thay đổi hình thái vịng đời H pluvialis 2.1 Kích thước tảo H pluvialis 19 2.2 3.1 Tảo H pluvialisquy mơ 15 lít bình thủy tinh (A) 20 lít khay nhựa (B) sau 12 ngày ni 21 Sự thay đổi hình thái tế bào vịng đời tảo H pluvialis (Nguyễn Thị Kim Liên, 2015) 25 3.2 Sinh trưởng tảo H pluvialis sau 18 ngày ni quy mơ 20 lít 27 3.3 Mật độ tế bào tảo H pluvialis theo thời gian nuôi cấy 29 3.4 Hàm lượng sắc tố astaxanthin nuôi cấy theo quy trình pha 30 3.5 Sự thay đổi hàm lượng nitơ theo thời gian nuôi cấy 33 3.6 Quy trình tách chiết astaxanthin 38 PHẦN MỞ ĐẦU Các loại động vật thuỷ sản, sau thời gian nuôi điều kiện nhân tạo, màu sắc cá nhạt rực rỡ Theo Lovell (1998), sắc tố quan trọng thịt cá hồi da loại cá khác cá cảnh, tơm, Carotenoid sắc tố có tự nhiên hay tổng hợp tạo màu vàng đỏ cam da, thịt, trứng vỏ lồi tơm Đối với động vật thủy sản khơng thể tự sản xuất sắc tố này, chúng phải bổ sung phần thức ăn để đạt màu sắc giống màu sắc cá tự nhiên (Lovatelli cs, 2009), nhằm đáp ứng yêu cầu người tiêu dùng nghệ nhân ngành cá cảnh Vì vậy, giải pháp để cải thiện trì màu sắc cá cảnh bổ sung carotenoid vào thức ăn chúng Nghiên cứu khía cạnh bổ sung astaxanthin vào thức ăn nhằm cải thiện màu sắc tr n động vật thủy sản thành công từ lâu Tuy nhi n, astaxanthin sử dụng có nhiều nguồn gốc khác nhau: từ nấm, vi khuẩn, từ tảo hay đường tổng hợp hóa học Hiện astaxanthin tổng hợp hóa học thường sử dụng phổ biến mà theo Gupta cs (2006), việc sử dụng sắc tố tổng hợp gây ảnh hưởng suy thối mơi trường Trong đó, vi tảo lục Haematococcus pluvialis có khả tích lũy astaxanthin lên tới 4% sinh khối khô (Yuan cs, 2000) sản phẩm thân thiện với mơi trường Vì sử dụng astaxanthin chiết xuất từ tảo Haematococcus pluvialis để làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho thủy sản điều thực Trên giới có nhiều cơng trình nghiên cứu lĩnh vực kết ngày hoàn thiện Ở Việt Nam, tảo Haematococcus pluvialis bắt đầu quan tâm nghiên cứu kết nghiên cứu dừng lại nội dung tìm hiểu điều kiện nuôi cấy, ảnh hưởng ánh sáng, nồng độ muối nitrate, HCO3, … l n q trình tích lũy astaxanthin Việc nghiên cứu quy trình nhân ni sinh khối tảo giàu astaxanthin hạn chế Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn kế thừa kết nghiên cứu đề tài “Khảo sát chế độ ánh sáng thích hợp cho tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện phịng thí nghiệm” đề tài “Khảo sát ảnh hưởng nitơ đến sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện bình ni” chúng tơi thực đề tài “Nghi n cứu quy trình nhân sinh khối tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin quy mơ 20 lít” ĐỀ TÀI T n đề tài/dự án: “Nghiên cứu quy trình nhân sinh khối tảo Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin quy mơ bình 20 lít” Chủ nhiệm đề tài/dự án: Ths Nguyễn Thị Kim Liên & Ks Trương Thị Thúy Hằng quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công Nghệ Cao, thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2016 đến tháng 12/2016 Kinh phí duyệt: 148,544,500 đồng Mục tiêu: Xây dựng quy trình sản xuất tảo Haematococcus pluvialis giàu hàm lượng astaxanthin Sản phẩm đề tài /dự án: Báo cáo khoa học quy trình ni tảo giàu astaxanthin Sau - ngày ni cấy cấp độ bình erlen 500 ml, sinh khối tảo cấy chuyển cách pha loãng mẫu theo tỉ lệ 50: 50 tr n môi trường lỏng RM, sử dụng ánh sáng đèn led màu trắng với cường độ chiếu sáng 90 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ, sục khí liên tục, cung cấp khí CO2 cho tảo quang hợp chuyển từ bình erlen 500 ml sang bình erlen 2000 ml cho MĐT ban đầu đạt khoảng 105 TB/ml Tảo tiếp tục ni phịng thí nghiệm với nhiệt độ trì 250C (3)(4) iai đoạn sản xuất sinh khối tảo bình 20 lít Sau - ngày ni cấy cấp độ bình erlen 2000 ml, sinh khối tảo chuyển vào nuôi pha bình thủy tinh 15 lít sau nâng dần lên thành 20 lít với điều kiện thuận lợi cho việc nhân sinh khối tảo đạt mật độ tế bào cực đại Điều kiện nuôi cấy pha môi trường lỏng RM, sử dụng ánh sáng đèn led màu trắng với cường độ chiếu sáng 90 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ, sục khí liên tục, cung cấp khí CO2 với hàm lượng 18ppm cho tảo quang hợp MĐT ban đầu đạt khoảng 105 TB/ml Tảo tiếp tục ni phịng thí nghiệm với nhiệt độ trì 250C (b) iai đoạn tích ũy thu nhận sắc tố astaxanthin (5) iai đoạn gây stress để tích ũy astaxanthin Tảo ni bình nhựa 20 lít sau 12 – 14 ngày tảo đạt MĐT cực đại Sau đó, tảo chuyển sang pha cách điều chỉnh nguồn hệ thống đèn led dùng máy đo cường độ chiếu sáng để kiểm soát nhằm tăng cường độ chiếu sáng lên 120 μmol/m2/s, với nhiệt độ 350C thời gian chiếu sáng 12 để kích thích tế bào tảo chuyển từ giai đoạn sinh dưỡng (màu xanh) sang dạng nang bào hoàn chỉnh (màu xanh đen đến màu nâu đỏ) tích lũy lượng astaxanthin (6) Sử dụng D S để thu nhận astaxanthin từ H pluvialis (Huang cs., 2012) Loại bỏ chlorophyll: Các tế bào nang H pluvialis xử lí với 5% KOH 30 % methanol (v/v) 70 ° phút Sau ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ 4°C, phần tủa rửa với ml nước cất bổ sung vài giọt acid acetic để đưa pH trung tính (Huang ctv, 2012) 40 Tách chiết astxanthin DMSO acetone: Phần sinh khối khô sau loại chlorophyll ủ 10 ml DMSO 550C Ly tâm 5000 vòng/phút phút, thu dịch chứa DMSO Thực phá thành tế bào lần với DMSO Thêm vào phần tủa ml acetone, vortex kĩ sau ly tâm 5000 vịng/phút phút, thu dịch (chiết 2-3 lần đến phần cặn hết sắc tố) Gom chung tất dịch chiết DMSO acetone vào bình lắng Thêm petrolium ether (tỉ lệ petrolium ether : dịch chiết 1:2) 10 ml nước cất, thêm ml NaCl bão hòa sắc tố không tách pha Thu pha petrolium ether có chứa sắc tố phía Th m nước vào dịch chiết sắc tố (tỉ lệ 1:1) bỏ pha nước (chứa acetone, DMSO), thu dịch chiết sắc tố pha petrolium ether phía Lặp lại bước 3-5 lần để loại hoàn toàn DMSO acetone Thêm Na2SO4 khan để loại nước, thu dịch sắc tố pha petrolium ether Th m petrolium ether để tất đạt thể tích định Đo độ hấp thu dịch chiết bước sóng 468 nm (Buzzini ctv, 2007) Cuối cùng, dịch chiết sấy khô bình hút ẩm chân khơng mẫu astaxanthin bảo quản tủ lạnh 0C 41 Hình ảnh minh họa sơ đồ nuôi cấy: Giống tảo nuôi ống nghiệm Tảo H pluvialis quy mô 500 ml sau ngày nuôi Tảo H pluvialisquy mô 2000 ml sau 12 ngày ni 42 Tảo H pluvialis quy mơ 20 lít sau 12 ngày nuôi Tảo H pluvialis quy mô 20 lít sau 18 ngày ni Tảo H pluvialis giàu astaxanthin 43 Astaxanthin sau ly trích Astaxanthin dạng bột (rắn) sấy bình hút ẩm chân khơng Quy trình ni tảo pha cho thấy mật độ đạt chưa cao nâng thể tích ni lên 20 lít mật độ tảo trì mức 105 TB/ml so với thể tích ni nhỏ hàm lượng astaxanthin thu chưa đánh giá độ tinh khiết nên đòi hỏi cần tiếp tục nghiên cứu nhằm nâng cao mật độ sinh khối tảo dồng thời đánh giá chất lượng chế phẩm astaxanthin 44 ƯƠ KẾT LUẬ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Đã xây dựng quy trình ni sinh khối tảo H pluvialis quy mơ 20 lít theo quy trình ni tảo pha: pha I sử dụng môi trường lỏng RM, mật độ tảo ban đầu 105 T /ml, ánh sáng đèn led màu trắng với cường độ chiếu sáng 90 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 giờ, sục khí liên tục, cung cấp khí CO2 với hàm lượng 18ppm cho tảo quang hợp; pha cường độ chiếu sáng 120 μmol/m2/s, thời gian chiếu sáng 12 Kết MĐT tảo đạt cao 4,93x105 T /ml, hàm lượng sắc tố astaxanthin (carotenoid) đạt 3142,93 µg/L, q trình tích lũy astaxanthin làm hao hụt lượng lớn nitơ từ 112,42 mg/L xuống 60,23 mg/L, hàm lượng astaxanthin sau ly trích đạt từ 5144 - 7535,8 μg/L chiếm từ 2,34 - 2,61%/SKK 4.2 Đề nghị Hoàn thiện quy trình nhân ni tảo H pluvialis giàu astaxanthin quy mơ 20 lít nhằm nâng cao suất sinh khối tảo H pluvialis đánh giá chất lượng chế phẩm astaxanthin phương pháp sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) 45 TÀI LI U THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Đinh Đức Hoàng, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Thủy, Đặng Diễm Hồng, 2011 Nghiên cứu vòng đời vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện phòng thí nghiệm Tạp chí sinh học 34 (1) [2] Đặng Diễm Hồng, Đinh Đức Hoàng, Nguyễn Thị Thủy, Hoàng Thị Lan Anh, 2010 Lựa chọn môi trường tối ưu để nuôi trồng vi tảo lục Haematococcus pluvialis giàu astaxanthin Tạp chí sinh học 32 (2) 43 – 53 [3] Đặng Diễm Hồng, Đinh Thị Ngọc Mai, ùi Đình Lãm, Lưu Thị Tâm, Nguyễn Thị Thu Thủy,Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Đinh Đức Hồng, Hồng Lan Anh, Ngơ Thị Hồi Thu, 2012 nh hưởng kết hợp nồng đô nitrate chế độ chiếu sáng l n sinh trưởng vi tảo Haematococcus pluvialis Tạp chí sinh học 34 (4) 493 – 499 [4] Lê Thanh Hùng, 2008 Thức ăn dinh dưỡng thuỷ sản Nhà xuất Nông Nghiệp TP HCM, 299 trang [5] Lê Thái Na, 2015 Khảo sát ảnh hưởng nitơ đến sinh trưởng tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện bình ni Đề tài nghiên cứu thường xun Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao [6] Nguyễn Đức Lượng Võ Thị Dạ Quỳnh, 2013 Phá vỡ tế bào Spirulina platensis máy nghiền bi để thu nhận chất có hoạt tính sinh học Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 6(67) [7] Nguyễn Thị Kim Liên, 2015 Khảo sát chế độ ánh sáng thích hợp cho tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện phịng thí nghiệm Đề tài nghiên cứu thường xuyên Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp công nghệ cao [8] Nguyễn Thị Thu Thủy, 2012 Tối ưu điều kiện ni lồi vi tảo lục Haematococcus pluvialis hệ thống photobioreactor kín quy mơ dung tích 20 lít Luận văn thạc sĩ trường Đại học Thái Nguyên [9] Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Đinh Thị Ngọc Mai, Hồng Thị Lan Anh, Ngơ Thị Hoài Thu, Nguyễn Cẩm Hà, Đặng Diễm Hồng, 2013 46 nh hưởng nồng độ nitrate l n isnh trưởng vi tảo lục Haematococcus pluvialis Flotow điều kiện phịng thí nghiệm Tạp chí sinh học 35 (2): 219-226 [10] Lưu Thị Tâm, Đinh Đức Hoàng, Đinh Thị Ngọc Mai, Ngơ Thị Hồi Thu, Hồng Thị Lan nh, Đặng Diễm Hồng, 2012 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối l n sinh trưởng khả tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis làm sở bước đầu cho qui trình ni cấy pha Tạp chí sinh học 34 (2): 213 – 223 Tài liệu tiếng anh [11] Aflalo, Y Meshulam, A Zarka, and S Boussiba, 2007 On the relative efficiency of two- vs one-stage production of astaxanthin by the green alga Haematococcus pluvialis Biotechnology and Bioengineering, 98(1): 300–305 [12] Bon J.A., Leathers T.D and Jayaswal R.K.,1997 Isolation of astaxanthin overproducing mutants of Phaffiarhodozyma Biotechnol Lett., 19: 109-112 [13] Boussiba S and Vonshak A., 1991 Plant cell physiol 32, 1077 – 1082 [14] Bubrick P., 1991 Bioresource technology, 38: 327 – 329 [15] Ciapara I.H., Elix-Valenzuela L.F and Goycoolea F.M., 2006 Astaxanthin: A Review of its Chemistry and Applications Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Mexico, 46:185-196 [16] Cheng-Wu Z., Jin Y., Ming W., Tao L., Ai-Fen L., 2011 Effects of NitrateNitrogen Stress on Pigment Content and Antioxidant Systems in Haematococcus pluvialis Plant Physiology Journal 47(2): 147-152 [17] Choi H.D., Kim J.H., Chang M.J., Kyu-Youn Y and Shin W.G., 2011.Effects of astaxanthin on oxidative stress in overweight and obese adults Phytother Research 25: 1813-1818 [18] Dominguez-Bocanegra A.R., Guerrero L I.,Martinez J F and Tomasini C F., 2004 Influence of environmental and nutiritionalfactors in the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis Bioresour.Technol 92: 209-214 [19] Droop M.R., 1994 Condition governing Haematococcus formation and loss of alga Haematococcus pluvialis Flotow Arch Microbiol 20: 391 – 397 [20] Droop M.R., 1995 Carotenogenesis in Haematococcus pluvialis Nature, 175 – 42 47 [21] Esra Imamoglu., Meltem Conk Dalay and Fazilet Vardar Sukan., 2009.Influences of different stress media and high light intensities on accumulation of astaxanthin in the green alga Haematococcus pluvialis New Biotechnology , 26-34 [22] Fábregas J., Domínguez A., Álvarez D G., Lamela T., Otero A (1988) Induction of astaxanthin accumulation by nitrogen and magnesium deficiencies in Haematococcus pluvialis Biotechnology Letters 20(6): 623-626 [23] Fábregas J., Otero A., Maseda A and Domínguez A., 2001 Two-stage for production of Astaxanthin from Haematococus pluvialis Journal of Biotechnology 89: 65-71 [24] Garcia Malea and et al., 2006 Enzyme and microbial technology, 38: 981 – 989 [25] Hagen C and et al., 1993 J Photochem photobiol biol, 20: 153 – 160 [26] Harker M and et al., 1996 Fermentation andbioengineering, 82 (2): 113 – 118 [27] Hata N., Ogbonna J.C., Hasegawa Y.,Taroda H and Tanaka H., 2001 Productionof astaxanthin by Haematococcus pluvialisin a sequential heterotrophicphotoautotrophicculture J Appl Phycol.,13: 395-402 [28] Issarapayup K, Powtongsook S and Pavasant P, 2011 Economicalreview of Haematococcus pluvialis culture in flat panelairlift photobioreactors Aquacult Eng., 44: 65-71 [29] Jeffrey S.W and et al., 1997 Phytoplankton pigments in oceanography: Guidelines to modern methods Unesco, paris: 37 – 84 [30] Junfeng Wang & Danxiang Han & Milton R Sommerfeld & Congming Lu & Qiang Hu., 2013 Effect of initial biomass density on growth and astaxanthin production of Haematococcus pluvialis in an outdoor photobioreactor Journal of Applide Phycogyl 25:253–260 [31] Kaewpintong K., 2004 Cultivation of Haematococcus pluvialis in airlift bioreactor Master thesis of Chulalongkorn University: 113pp [32] Kang C D (2007) Phytoplankton Pigments in Oceanography: Guidelines to Modern Methods UNESCO, Paris: 37:84 [33] Keong W.Ng., 2002 Palm Oil: Alternative Lipid Source in Aquaculture Feeds School of Biological Sciences, Universiti Sains Malaysia 48 [34] Kobayashi M, Kakizono T, Nishio N, Nagai S (1992) Effects of Light Intensity, Light Quality, and Illumination Cycle on Astaxanthin Formation in a Green Alga, Haematococcus pluvialis Journal Of Fermentation And Bioengineering 74 (1): 61-63 [35] Kobayshi M., 1997.Morphological changes in the life cycle of the green alga Haematococcus pluvialis Journalo Fermentatioann Bioengineering 84:94-97 [36] Lee YK and Ding SY, 1995 Effect of dissolved oxygen partial pressure on the accumulation of astaxanthin in chemostat cultures of Haematococcus lacustris (Chlorophyta) J Phycol., 31: 922-924 [37] Lee Y.K and Soh C.W., 1991 Phycol, 27: 575 – 577 [38] Lorenz R.T and Cysewski G R., 2000 Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source ofastaxanthin TibTech., 18: 160-167 [39] Lorenz R.T and Cysewski G.R., 2000 Trends biotechmol, 18: 160 – 167 [40] Lorenz R.T and Cysewski G.R., 2000 Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin TIBTECH APRIL 2000 (Vol 18) Elsevier Science Ltd [41] Lovatelli Alessandro and ChenJiaxin., 2009 Use of environmental friendly feed additives and probiotics in Chinese aquaculture Yellow Sea Fisheries Research Institute, China [42] Makio Kobayashi., 1997.Morphological Changes in the Life Cycle of the Green Alga Haematococcus pluvialis Journalo F Fermentatioann D Bioengineering 84:94-97 [43] Miki W., 1991 Biological functions andactivities of animal carotenoids Pure Appl.Chem., 63: 141-146 [44] Olaizola M., 2000 Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreactors J Appl Phycol., 12: 499-506 [45] Oncel SS, Imamoglu E, Gunerken E and Sukan FV, 2011 Comparison of different cultivation modes and light intensities using mono-cultures and co- 49 cultures of Haematococcus pluvialis and Chlorella zofingiensis J Chem Technol Biotechnol., 86: 414-420 [46] Proctor VW, 1957 Some Controlling Factors in the Distribution of Haematococcus pluvialis Ecology, 38(3): 457-462 [47] Ranjbar R., Inoue R., Shiraishi H., Katsuda T and Katoh S., 2008 High efficiency production of astaxanthin by autotrophic cultivation of Haematococcus pluvialis in abubble column photobioreactor Biochemical Engineering Journal, 39: 575-580 [48] Renstrom B and et al., 1981 Optical purity of astaxanthin from Haematococcus pluvialis Phytochemistry 20 (11): 2561 – 2564 [49] Riley L.W and et al., 1983 Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype N Engl J Med; 308: 681 – [50] Sarada, R., Vidhyavathi, R., Usha, D and Ravishankar, G.A (2006), "An Efficient Method for Extraction of Astaxanthin from Green Alga Haematococcus pluvialis", J Agric Food Chem, 54(20), pp 7585−7588 [51] SmithG.M., 1950 Freshwater algae (n p) Mcgraw hill book, pp 109 - 111 [52] Sperry., 1970 Psychlogical review, volume 77, issue 6, November 1970: 585 - 590 [53] Suh I.S., Joo H.N., Lee C.G., 2006 Anovel double-layered photobioreactor forsimultaneous Haematococcus pluvialis cellgrowth and astaxanthin accumulation.Journal of Biotechnology, 125: 540-546 [54] Tjahjono A.E and et al., 1994 Fermentation and bioengineering, 77 (4): 352 – 357 [55] Yuan J P and Chen F., 2000 Purification oftrans-astaxanthin from a highyieldingastaxanthin ester-producing strain of themicroalga Haematococcus pluvialis FoodChem, 68: 443-448 [56] Yuan J P and Chen F., 2001 Indirect photometric ion chromatographic analysisof anions in Haematococcus pluvialis culture media Biotechol Lett., 23: 757-760 50 PHỤ LỤC PHỤ LỤC - hành phần dinh dưỡng môi trường Thành phần môi trường Khối lượng (mg/L) NaNO3 300 K2HPO4 80 KH2PO4 20 MgSO4.7H2O 10 CaCl2.2H2O 58,5 EDTA 7,5 NaCl 20 H3BO3 0,3 MnSO4.H2O 1,5 ZnSO4.7H2O 0,1 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.3 CuSO4.5H2O 0,08 Co(NO3)2.6H2O 0,26 FeCl3.6H2O 17 51 PHỤ LỤC - Mật độ trung bình tảo H pluvialis lơ ni cấy (x105) Ngày lô lô lô lô 0,57 0,63 0,70 0,63 1,17 1,23 1,37 1,27 1,50 1,63 1,83 1,60 2,17 2,17 2,50 2,30 2,53 2,73 2,97 2,60 10 3,30 3,37 3,47 3,30 12 3,67 3,90 4,10 3,80 14 4,90 4,93 4,93 4,80 16 4,63 4,60 4,53 4,43 18 4,23 4,27 4,20 4,10 52 PHỤ LỤC – àm ượng sắc tố carotenoid (astaxanthin) trung bình lơ ni cấy HÀM LƯỢNG SẮ TỐ Ngày lô lô lô lô 30,40 22,93 25,60 23,47 45,87 44,27 43,73 53,33 76,27 74,13 76,27 73,60 86,40 128,00 92,80 98,20 150,40 160,53 168,00 175,27 10 203,20 208,00 185,60 185,07 12 242,13 274,40 301,33 224,00 14 329,60 428,00 453,33 399,20 1176,00 966,13 981,33 911,33 1369,60 1514,67 1029,87 1150,27 2437,33 2544,00 2668,27 2494,93 3142,93 3049,60 3079,20 3047,47 PHỤ LỤC – àm ượng nit trung bình lơ ni cấy Hàm lượng nitơ (mg/L) Ngày lô lô lô lô 111,07 112,14 111,07 112,42 95,71 91,38 90,73 91,07 89,70 94,38 91,07 94,23 86,39 87,61 88,03 86,08 84,06 86,06 86,39 85,96 10 77,08 81,52 70,05 77,06 12 71,07 70,72 77,05 70,05 14 67,88 70,72 70,85 72,54 53 65,57 66,09 67,05 68,12 63,38 64,05 64,71 65,56 62,90 63,02 63,05 63,45 63,05 63,38 63,05 60,23 54