Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cây đảng sâm codonopsis javanica blume

U U T HCM Ứ Ể BÁO CÁO NGHI M THU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO Y ĐẢNG SÂM Codonopsis javanica Blume ThS Nguyễn Thị Điệp ThS Huỳnh Thị Kim Th nh ph H h inh, h ng 01/2017 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO Y ĐẢNG SÂM Codonopsis javanica Blume ƠQ Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph H CHỦ NHI ĐỀ TÀI (Ký tên) h inh, h ng 01/2017 TÓM TẮT Đảng sâm (Codonopsis javanica lume) lồi dƣợc liệu q chứa nhiều hợp chất hóa học có giá trị có saponin Đây đƣợc coi nhân sâm ngƣời nghèo Trong nghiên cứu chúng tơi nghiên cứu quy trình nhân giống đảng sâm (Codonopsis javanica Blume) nhằm tạo nguồn giống chất lƣợng cao đồng thời bảo tồn nguồn gen loài dƣợc liệu quý Vật liệu ban đầu đƣợc sử dụng để nhân giống đốt thân đảng sâm năm tuổi, tỉ lệ mẫu phát sinh chồi 82%, chiều cao chồi đạt từ – cm sau 10 ngày nuôi cấy Khả tái sinh chồi đạt cao 20,78 chồi/mẫu mơi trƣờng khống ½ MS bổ sung 1,5 mg/l BA kết hợp với 0,2 mg/l NAA Sự tăng trƣởng chồi đảng sâm đƣợc khảo sát mơi trƣờng có thành phần khống khác (MS, ½ MS SH) Sau tuần, kết cho thấy chồi đảng sâm tăng trƣởng tốt môi trƣờng SH với chiều cao đạt 5,53 cm , số 3- cặp lá, tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt 100%, rễ dài phân nhánh Sự rễ tạo đảng sâm in vitro hồn chỉnh đạt tối ƣu mơi trƣờng SH có bổ sung 0,3 mg/l IBA, số rễ đạt đƣợc 32,67 rễ/ mẫu, chiều dài rễ 4,67 cm sau tuần nuôi cấy Nồng độ saccharose tốt cho trình tạo rễ củ đảng sâm 50 g/l Sau 30 ngày đảng sâm in vitro trồng vƣờn ƣơm cho tỷ lệ sống 100% Trang BM20-QT.QLKH Abstract Codonopsis javanica Blume is one of the traditional herbal medicines, containing various beneficial activities which support immunity and stress resistance This research was studied the process propagation Codonopsis javanica Blume to create high-quality seedling and genetic conservation of this herbal medicine An efficient regeneration system was developed using internode one year –old explants The best shoot regeneration response (82%) and number of shoot per internode (20.78) were achieved on the ½ MS medium supplemented with 1.5 mg/l BA and 0.2 mg/l NAA To induce the growth of shoot, the explants were cultured on varying mineral medium (MS, ½ MS and SH) After weeks, the best growth of shoot were obtained in SH medium, which gave the average shoot length of 5.53 cm with to pairs of new leaves The shoots were successfully (100%) rooted in SH medium supplemented with 0.3 mg/l IBA (32.67 roots/plant, 4.67 cm in length) within weeks Futher, high saccharose concentration (50 g/l) was benefitcial to tube roots In vitro plantlets acclimatized to soil cultivation with a survival rate of 100% Trang BM20-QT.QLKH MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Tóm tắt đề tài ii Abstract iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách bảng, đồ thị vii Danh sách hình viii T T ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU hƣơng - TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Sơ lƣợc đối tƣợng nghiên cứu 1.1.1 Nguồn gốc phân bố 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Thành phần hóa học tác dụng dƣợc lý 1.2 Tình hình sản xuất đảng sâm 1.3 Các nghiên cứu nƣớc hƣơng – VẬT LI U VÀ ƢƠ Á Ê ỨU 13 2.1 Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 13 2.1.1 Vật liệu 13 2.1.2 hƣơng pháp nghiên cứu 13 Trang BM20-QT.QLKH 2.1.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân đảng sâm 13 2.1.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ BA NAA lên tăng trƣởng chồi đảng sâm in vitro 14 2.1.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng lên tăng trƣởng đảng sâm in vitro 15 2.1.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ NAA, IBA IAA riêng lẻ lên rễ đảng sâm in vitro 16 2.1.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ sucrose lên sinh trƣởng khả tạo rễ củ đảng sâm in vitro 17 2.2 hƣơng pháp xử lý số liệu 18 hƣơng - KẾT QU VÀ TH O LUẬN 19 3.1 nh hƣởng nồng độ BA NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân đảng sâm 19 3.2 nh hƣởng nồng độ BA NAA lên tăng trƣởng chồi đảng sâm in vitro 20 3.3 nh hƣởng thành phần khoáng lên tăng trƣởng đảng sâm in vitro 22 3.4 nh hƣởng nồng độ NAA, IBA IAA riêng lẻ lên rễ đảng sâm in vitro 24 3.5 nh hƣởng nồng độ saccharose lên sinh trƣởng khả tạo rễ củ đảng sâm in vitro 26 hƣơng - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 4.1 Kết luận 28 4.2 Đề nghị 28 Trang BM20-QT.QLKH TÀI LI U THAM KH O 29 PHỤ LỤC Trang BM20-QT.QLKH DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ tiếng Việt BA - Benzyl adenin Đ Đối chứng IBA Indole – butyric acid KIN Kinetin MS Môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) NAA Naphthalene acetic acid SH Mơi trƣờng SH (Schenk Hilderbrant) TN Thí nghiệm Trang BM20-QT.QLKH DANH SÁCH BẢNG, ĐỒ THỊ Số Tên bảng số liệu Trang 2.1 Bảng khảo sát nồng độ BA NAA lên phát sinh chồi từ đốt thân đảng sâm in vitro 14 2.2 Bảng khảo sát nồng độ BA NAA lên tăng sinh chồi đảng sâm in vitro 15 2.3 Bảng khảo sát thành phần khoáng lên tăng trƣởng đảng sâm in vitro 16 2.4 Bảng khảo sát nồng độ NAA, IBA IAA riêng lẻ lên rễ đảng sâm in vitro 16 2.5 Bảng khảo sát nồng độ sucrose lên sinh trƣởng, phát triển khả tạo rễ củ đảng sâm in vitro 17 3.1 nh hƣởng nồng độ BA NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân đảng sâm 20 3.2 nh hƣởng nồng độ BA NAA lên tăng trƣởng chồi đảng sâm in vitro 21 3.3 nh hƣởng thành phần khoáng lên tăng trƣởng đảng sâm in vitro 23 3.4 nh hƣởng NAA, IBA IAA riêng lẻ lên rễ đảng sâm in vitro 25 3.5 nh hƣởng nồng độ saccharose lên sinh trƣởng khả tạo rễ củ 26 Trang BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH Tên hình ảnh Số 1.1 1.2 Cây đảng sâm Codonopsis javanica Blume oa đảng sâm Codonopsis javanica Blume Trang 3.1 Chồi in vitro phát sinh từ mẫu thực sinh 20 3.2 Chồi tái sinh mơi trƣờng ½ MS có bổ sung 1,5 mg/l BA 0,2 mg/l NAA 20 3.3 Chồi đảng sâm ban đầu 22 3.4 Chồi đảng sâm tăng trƣởng môi trƣờng bổ sung BA NAA 22 3.5 ây đảng sâm tăng trƣởng môi trƣờng khống khác sau tuần ni cấy 24 3.6 nh hƣởng nồng độ NAA, IBA IAA riêng lẻ lên rễ đảng sâm in vitro 25 3.7 ình thái đảng sâm in vitro môi trƣờng SH bổ sung saccharose lần lƣợt 20, 30, 40, 50 60 g/l 27 3.8 Rễ củ hình thành mơi trƣờng SH với saccharose 50 g/l 27 3.9 ây đảng sâm vƣờn ƣơm sau 30 ngày trồng 27 Trang 10 BM20-QT.QLKH wild and indigenous plant (Amorphophallus commutatus),Journal 0f medicinal plants research, Vol 7(13), pp 744-748 [10] Bimal Kumar Ghimire, Chul Min Shin, Cheng Hao Li (2007), High frequency plant regeneration from leaf, petiole and internode explants of Codonopsis lanceolata Benth, Korean J Medical Crop sci., 15(2): 73-81 [11] Ji Ah Kim, Eung Jun Park and Yong Eui Choi (2012), Induction and Proliferation of Adventitious Roots in Codonopsis spp., Korean J Medicinal Crop Sci., 20(6) : 493 – 499 [12] Phan Xuan Huyen and Dieu-Hien Truong (2015), effect of culture media on in vitro germination rate and shoot-forming potential Codonopsis javanica (Blume) Hook f & Thomson artificial seeds, African joural of agricultural research, vol 10 (52), pp 4755-4761 [13] Y.H.Zhang, S.F.Gao (2011), Direct multiple shoot induction and plant regeneration from dormant buds of Codonopsis pilosula (Franch.) nannf., African Journal of Biotechnology, Vol 10(51), pp 10509-105015 Trang web [14] http://agarwood.org.vn [15] http://www.baodanang.vn/channel/5433/201503/phuong-hay-thuoc-quy-can-daymanh-trong-va-su-dung-dang-sam-viet-nam-2401315/ [16] http://ckq.edu.vn/uploads/quan-ly-khoa-hoc-dbcl/2014 [17] http://skhcn.kontum.gov.vn Trang 33 BM20-QT.QLKH PHỤ LỤC Phụ lục 1: ui trình đề nghị nhân giống in vitro đảng sâm Codonopsis Javanica Blume Cây thực sinh vƣờn ƣơm (Cây khỏe phát triển bình thƣờng) Đốt thân Khử trùng – 10 tháng (Javel 7% phút) Chồi in vitro (1/2 MS) Môi trƣờng tái sinh chồi từ đốt thân (1/2 MS + 1,5 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA) Môi trƣờng tăng trƣởng (SH) BM20-QT.QLKH Môi trƣờng rễ (SH + 0,3 mg/l IBA + 50 g/l saccharose) Chọn mẫu: Chọn đoạn chồi đảng sâm trồng vƣờn ƣơm có chiều dài 15 – 20 cm, – cặp đƣợc dùng để nhân chồi in vitro Tái sinh chồi in vitro từ chồi ngủ: Sử dụng đốt thân từ đoạn chồi vừa chọn vƣờn ƣơm tiến hành khử trùng chế độ javel 7% với thời gian phút (theo phụ lục 2) Sau khử trùng đốt thân đƣợc ni cấy mơi trƣờng ½ MS, sau 10 ngày nuôi cấy chồi ngủ từ đốt thân tái sinh thành chồi in vitro có chiều cao – cm Tái sinh chồi in vitro: Sử dụng đốt thân từ chồi in vitro nuôi cấy mơi trƣờng khống ½ MS có bổ sung 1,5 mg/l, 0,2 mg/l, agar g/l đƣờng saccharose 30 g/l Sau tuần nuôi cấy thu đƣợc cụm chồi in vitro ăng trƣởng đảng sâm in vitro: Các chồi in vitro đƣợc tăng trƣởng môi trƣờng khống SH có bổ sung agar g/l saccharose 30 g/l Sau tuần nuôi cấy thu đƣợc chồi cao 4,5 – 6,5 cm, có khoảng – cạp có hình thành sơ khởi rễ (5 – rễ) Tạo rễ in vitro: Chồi in vitro đƣợc chuyển sang môi trƣờng tạo rễ với mơi trƣờng khống SH có bổ sung IBA 0,3 mg/l, agar g/l saccharose 30 g/l Sau tuần nuôi cấy chồi phát sinh rễ tạo rễ nhánh, phát triển khỏe mạnh BM20-QT.QLKH Phụ lục 2: Sơ đồ khử trùng đốt thân đảng sâm BM20-QT.QLKH Phụ lục 3: Kết phân tích saponin tồn phần củ đảng sâm năm tuổi BM20-QT.QLKH BM20-QT.QLKH Phụ lục 4: nh hƣởng nồng độ BA NAA lên tái sinh chồi từ đốt thân đảng sâm Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 4.11 1.269 423 3.14 5.09 6.11 1.537 512 4.93 7.29 8.56 1.667 556 7.27 9.84 11 9.78 1.716 572 8.46 11.10 12 9.33 1.581 527 8.12 10.55 12 5.33 1.414 471 4.25 6.42 6.33 1.581 527 5.12 7.55 9 20.78 7.328 2.443 15.15 26.41 12 32 9 12.78 1.641 547 11.52 14.04 10 15 10 5.11 1.900 633 3.65 6.57 11 8.11 2.088 696 6.51 9.72 12 12 11.78 3.308 1.103 9.23 14.32 18 13 13.56 4.720 1.573 9.93 17.18 20 117 9.36 5.218 482 8.40 10.31 32 Total Homogeneous Subsets BM20-QT.QLKH Subset for alpha = 0.05 TSC a Duncan N 4.11 10 5.11 5.11 5.33 5.33 6.11 6.11 6.11 6.33 6.33 6.33 6.33 11 8.11 8.11 8.11 8.11 8.56 8.56 8.56 9.33 9.33 9.33 9.78 9.78 12 9 12.78 13 13.56 Sig 11.78 11.78 20.78 162 057 114 051 284 101 235 1.000 Phụ lục 5: nh hƣởng nồng độ BA NAA lên tăng trƣởng chồi đảng sâm in vitro Descriptives N Mean BM20-QT.QLKH Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound 4.800 8888 2963 4.117 5.483 3.1 6.1 3.844 3468 1156 3.578 4.111 3.3 4.5 4.289 3822 1274 3.995 4.583 3.8 5.0 3.944 3127 1042 3.704 4.185 3.5 4.5 3.889 3655 1218 3.608 4.170 3.3 4.5 3.533 3317 1106 3.278 3.788 3.0 4.0 3.022 2438 0813 2.835 3.210 2.7 3.4 2.622 3528 1176 2.351 2.893 2.0 3.0 9 2.311 4076 1359 1.998 2.624 1.8 3.1 10 3.989 5061 1687 3.600 4.378 3.1 4.7 11 3.044 2068 0689 2.885 3.203 2.8 3.4 12 3.200 4359 1453 2.865 3.535 2.7 4.2 13 3.089 2028 0676 2.933 3.245 2.8 3.5 117 3.506 7840 0725 3.362 3.650 1.8 6.1 Total Homogeneous Subsets Subset for alpha = 0.05 TTCAY a Duncan N 9 2.311 2.622 BM20-QT.QLKH 3.022 11 3.044 13 3.089 12 3.200 9 3.844 3.844 3.889 3.889 3.889 3.944 3.944 3.944 10 3.989 3.989 9 Sig 3.533 3.533 4.289 4.800 118 Phụ lục 6: 3.200 419 094 058 512 066 1.000 nh hƣởng thành phần khoáng lên tăng trƣởng đảng sâm in vitro Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 3.467 1.1673 3891 2.569 4.364 2.1 5.2 4.678 7678 2559 4.088 5.268 3.8 6.0 5.533 1.3856 4619 4.468 6.598 4.0 8.1 27 4.559 1.3921 2679 4.009 5.110 2.1 8.1 Total Homogeneous Subsets BM20-QT.QLKH KCCCAY Subset for alpha = 0.05 MTKH a Duncan N 9 4.678 5.533 Sig Phụ lục 7: 3.467 1.000 123 nh hƣởng nồng độ NAA, IBA IAA riêng lẻ lên rễ đảng sâm in vitro Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum SLRE 7.00 1.000 577 4.52 9.48 32.67 6.429 3.712 16.70 48.64 28 40 3 17.67 2.517 1.453 11.42 23.92 15 20 14.00 1.732 1.000 9.70 18.30 12 15 12.33 2.517 1.453 6.08 18.58 10 15 7.33 2.517 1.453 1.08 13.58 10 7.33 2.082 1.202 2.16 12.50 BM20-QT.QLKH 6.00 1.000 577 3.52 8.48 5.33 1.528 882 1.54 9.13 10 5.00 2.000 1.155 03 9.97 11 5.33 1.528 882 1.54 9.13 12 7.33 2.517 1.453 1.08 13.58 10 13 8.00 1.000 577 5.52 10.48 39 10.41 7.786 1.247 7.89 12.93 40 2.000 5000 2887 758 3.242 1.5 2.5 4.667 7638 4410 2.769 6.564 4.0 5.5 3 2.200 2646 1528 1.543 2.857 2.0 2.5 1.400 1732 1000 970 1.830 1.2 1.5 1.233 2517 1453 608 1.858 1.0 1.5 2.500 5000 2887 1.258 3.742 2.0 3.0 2.333 2887 1667 1.616 3.050 2.0 2.5 733 2517 1453 108 1.358 1.0 500 2000 1155 003 997 10 567 1155 0667 280 854 11 733 2517 1453 108 1.358 1.0 12 767 2082 1202 250 1.284 1.0 13 800 3000 1732 055 1.545 1.1 39 1.572 1.1803 1890 1.189 1.954 5.5 Total CDR E Total Homogeneous Subsets SLRE BM20-QT.QLKH Subset for alpha = 0.05 RE a Duncan N 10 5.00 5.33 11 5.33 6.00 7.00 7.33 7.33 12 7.33 13 8.00 12.33 14.00 3 14.00 17.67 32.67 Sig .229 434 092 1.000 CDRE Subset for alpha = 0.05 RE a Duncan BM20-QT.QLKH N 500 10 567 567 733 733 733 11 733 733 733 12 767 767 767 13 800 800 800 1.233 1.233 3 2.000 3 2.200 2.333 2.500 1.400 4.667 Sig Phụ lục 8: 372 051 051 126 1.000 nh hƣởng nồng độ saccharose lên sinh trƣởng khả tạo rễ củ đảng sâm in vitro Descriptives CCAO 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 4.500 5000 2887 3.258 5.742 4.0 5.0 6.500 5000 2887 5.258 7.742 6.0 7.0 3 12.000 1.0000 5774 9.516 14.484 11.0 13.0 BM20-QT.QLKH 8.333 1.5275 8819 4.539 12.128 7.0 10.0 11.833 7638 4410 9.936 13.731 11.0 12.5 15 8.633 3.1479 8128 6.890 10.377 4.0 13.0 Total Homogeneous Subsets CCAO Subset for alpha = 0.05 SAC a Duncan N 3 11.833 3 12.000 Sig BM20-QT.QLKH 4.500 6.500 8.333 1.000 1.000 1.000 832