Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cúc gai dài silybum marianum l gaertn từ hạt giai đoạn 1

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CÚC GAI DÀI Silybum marianum (L.) Gaertn TỪ HẠT (GIAI ĐOẠN 1) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2018 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CÚC GAI DÀI Silybum marianum (L.) Gaertn TỪ HẠT (GIAI ĐOẠN 1) CƠ QUAN CHỦ TRÌ CHỦ NHIỆM NHIỆM VỤ ThS Nguyễn Ngọc Ánh CN Vũ Thị Thúy Hằng THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2018 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv TÓM TẮT v THÔNG TIN CHUNG vi PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1.Tổng quan Cúc gai dài 11 1.1.1 Hình thái - Phân bố 11 1.1.2 Sinh thái Cây Cúc gai dài 12 1.2 Biện pháp canh tác Cúc gai dài 15 1.3 Lịch sử giá trị sử dụng 17 1.4 Dược tính giá trị dược liệu Cúc gai dài 18 1.5 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Cúc gai dài 22 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nội dung nghiên cứu 26 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu 26 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cúc gai dài từ hạt 27 i 2.4.2 Khảo sát mơi trường thích hợp tạo chồi, cụm chồi Cúc gai dài in vitro 29 2.4.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cúc gai dài 33 2.5 Phương pháp phân tích số liệu 35 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cúc gai dài từ hạt 36 3.2 Khảo sát môi trường thích hợp tạo chồi, cụm chồi Cúc gai dài 38 3.2.1 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tạo chồi cụm chồi từ đoạn thân mang chồi ngủ Cúc gai dài in vitro 38 3.2.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng 2,4-D đến khả tạo sẹo từ Cúc gai dài in vitro 42 3.2.3 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng GA3 đến khả tái sinh chồi từ mô sẹo Cúc gai dài in vitro 44 3.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cúc gai dài in vitro 45 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 54 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Khảo sát điều kiện xử lí hạt để tăng khả nảy mầm hạt Cúc gai dài nuôi cấy in vitro 28 Bảng 2.2 Môi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng BA đến khả tạo chồi Cúc gai dài 30 Bảng 2.3 Mơi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng 2,4-D đến khả tạo sẹo từ Cúc gai dài 32 Bảng 2.4 Môi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ sẹo Cúc gai dài 33 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Cúc gai dài 35 Bảng 3.1 Khả nảy mầm hạt Cúc gai dài in vitro xử lý khử trùng hai chất khác phá vỡ miên trạng dung dịch KNO3 37 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA lên hình thành chồi Cúc gai dài 40 Bảng 3.3 Ảnh hưởng 2,4-D lên khả tạo sẹo từ Cúc gai dài 43 Bảng 3.4 Ảnh hưởng GA3 lên khả tái sinh chồi Sẹo Cúc gai dài 45 Bảng 3.5 Ảnh hưởng BA NAA đến khả nhân chồi Cúc gai dài 47 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Cúc gai dài 14 Hình 2.1 Cúc gai dài 20 ngày tuổi với đoạn thân non 31 Hình 2.2 Sẹo Cúc gai dài 33 Hình 2.3 Chồi Cúc gai dài làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân chồi 35 Hình 3.1 Cây Cúc gai dài tuần tuổi in vitro nảy mầm từ hạt 37 Hình 3.2 Khả tạo chồi từ đoạn thân Cúc gai dài mang chồi ngủ cấy mơi trường MS có bổ sung BA 39 Hình 3.3 Hình thái chồi Cúc gai dài 15 ngày sau cấy số mơi trường có bổ sung BA 42 Hình 3.4 Sẹo Cúc gai dài tạo thành môi trường MS có bổ sung 2,4-D 43 Hình 3.5 Chồi tái sinh từ sẹo Cúc gai dài 45 Hình 3.6 Chồi Cúc gai dài số môi trường nhân chồi 46 iv TÓM TẮT Nghiên cứu “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Cúc gai dài Silybum marianum (L.) Gaertn từ hạt” thực vòng hai năm Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Công nghệ cao (2018 – 2019) với kỹ thuật nuôi cấy mô môi trường bán rắn Mục tiêu nhằm xây dựng hồn chỉnh quy trình vi nhân giống để tạo sản phẩm giống đạt tiêu chuẩn đưa vườn ươm Trong phạm vi báo cáo này, nghiên cứu thực giai đoạn 1: giai đoạn từ hạt đến nhân chồi Cúc gai dài in vitro Nghiên cứu tiến hành thực nội dung thí nghiệm, sử dụng phương pháp khử trùng mẫu, phương pháp tái sinh chồi, phương pháp tạo sẹo, tái sinh chồi từ sẹo phương pháp nhân nhanh cụm chồi mơi trường MS có sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA, BA, 2,4-D GA3 Kết xây dựng thành cơng quy trình vi nhân giống Cúc gai dài từ hạt giai đoạn từ tạo mẫu in vitro đến nhân nhanh tạo cụm chồi, gieo hạt Cúc gai dài nảy mầm tạo in vitro sử dụng chất khử trùng Hydrogen peroxid 3%, phá vỡ miên trạng hạt cách ngâm dung dịch KNO3 5%, tỉ lệ mẫu nảy mầm tạo thành in vitro đạt kết cao 77,78%; đoạn thân mang chồi ngủ Cúc gai dài tái sinh tạo cụm chồi thích hợp mơi trường MS có bổ sung 2mg/L BA cho tỉ lệ bật chồi 97,78% với hệ số nhân 4,17; tạo sẹo Cúc gai dài từ mẫu in vitro 20 ngày tuổi cách nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung 2,5 mg/L 2,4-D tái sinh chồi cho mô sẹo môi trường MS bổ sung 0,1mg/L NAA + 2-3 mg/L GA3, chồi tạo thành tiến hành nhân nhanh cụm chồi môi trường MS bổ sung 2mg/L BA + 0,2 – 0,4 mg/L cho tỉ lệ tạo cụm chồi >90% với hệ số nhân 7,5 - 8,2 v THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Cúc gai dài Silybum marianum (L.) Gaertn từ hạt (giai đoạn 1) Chủ nhiệm Họ tên: Nguyễn Ngọc Ánh Năm sinh: 01/11/1986 Nam/Nữ: Nữ Học vị: Thạc sỹ Chuyên ngành: Sinh thái học Năm đạt học vị: 2015 Chức vụ (nếu có): Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103; Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: D47- Chung cư Khánh Hội 2-360ª Bến Vân Đồn, P1, Q4 Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 0938 522 236 E-mail: anhnn1986@gmail.com Chủ nhiệm Họ tên: Vũ Thị Thúy Hằng Năm sinh: 03/10/1994 Nam/Nữ: Nữ Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Sinh học Năm đạt học vị: 2016 Chức vụ (nếu có): Chun viên phịng HTCN TBTV Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103 ; Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: Ấp 2, xã Phạm Văn Cội, Củ Chi, Thành phố Hồ Chí Minh Email: vuthuyhang0310@gmail.com Cơ quan chủ trì Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Điện thoại: 08.62646103 Fax: 08.62646104 vi E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp HCM Văn phòng giao dịch: 499, Cách mạng Tháng 8, phường 13, quận 10, Tp HCM Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2018 đến tháng 11/2018 Nội dung Giai đoạn Nội dung 1: Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cúc gai dài từ hạt Nội dung 2: Khảo sát mơi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cúc gai dài in vitro Nội dung 3: Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cúc gai dài in vitro Sản phẩm Báo cáo phân tích có đầy đủ số liệu thu thập, phân tích, so sánh đánh giá Hoàn thành số phương pháp kỹ thuật thực nhân giống in vitro Cúc gai dài giai đoạn từ tạo mẫu đến nhân nhanh tạo chồi, cụm chồi, gồm bước sau: - Bước 1: (Khử trùng, gieo hạt) Hạt giống Cúc gai dài sau khử trùng sơ xà phòng rửa vòi nước sạch, khử trùng cồn 70o 30 giây, sau lắc 15 phút dung dịch Hydrogen peroxid 3% tween 80, rửa lại nước cất tiệt trùng 3-5 lần Mẫu sau khử trùng ngâm dung dịch KNO3 5% giờ, sau cấy mơi trường MS Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux - Bước 2: (Nuôi cấy tạo nguồn mẫu ban đầu) Cây Cúc gai dài in vitro nảy mầm từ hạt 20 ngày tuổi cắt thành đoạn thân mang chồi ngủ - cm non 1x1 cm, chồi đặt môi trường MS + mg/L BA, non đặt môi trường MS bổ sung 2,4-D 2,5 mg/L để tạo sẹo, sẹo tạo thành tiếp tục đặt vào mơi trường MS có bổ sung GA3 3mg/L để tái sinh vii chồi Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux - Bước 3: (Nhân nhanh, tạo cụm chồi) Chồi Cúc gai dài in vitro 30 ngày tuổi tuổi chuyển qua môi trường nhân nhanh, tạo cụm chồi MS + mg/L BA +0,2 - 0,4 mg/L NAA Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux Tiến độ thực nhiệm vụ STT Nội dung Kết Người thực Thời gian thực Nguyễn Ngọc 01/01/2018đến Ánh 28/3/2018 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cúc gai dài từ hạt Hồn thành 100% Khảo sát mơi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cúc gai dài in vitro Hoàn Nguyễn Ngọc thành Ánh Vũ Thị 100% Thúy Hằng Khảo sát mơi trường Hồn Nguyễn Ngọc nhân nhanh cụm chồi thành Ánh Phan Thị Cúc gai dài in vitro Hồng Thủy 100% viii 1/4/2018 đến 31/8/2018 01/9/2018 đến 15/12/2018 trường có bổ sung GA3 2-3 mg/L, kết phù hợp với nghiên cứu Yuwei cộng (2017) Bảng 3.4 Ảnh hưởng GA3 lên khả tái sinh chồi Sẹo Cúc gai dài Tỉ lệ mẫu Số chồi tái Thời gian STT tái sinh sinh/mẫu tái sinh chồi chồi 1 CT1 0a 0a 0a 2 CT2 35,56c 6,33d 55b 3 CT3 44,44c 5c 57,33b 4 CT4 13,33b 2,67b 65c ÐC 0a 0a 0a CV% 13,11 10,37 1,99 P