Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây cam thảo bắc glycyrrhiza glabra l từ hạt

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CAM THẢO BẮC (Glycyrrhiza glabra L.) TỪ HẠT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY CAM THẢO BẮC (Glycyrrhiza glabra L.) TỪ HẠT CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CHỦ NHIỆM (Ký ghi rõ họ tên) Nguyễn Ngọc ánh Phan Thị Hồng Thủy THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv THÔNG TIN CHUNG PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan Cam thảo bắc 1.2 Thành phần hóa học Cam thảo bắc 1.3 Tác dụng dược lý Cam thảo bắc 1.4 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Cam thảo bắc 10 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nội dung nghiên cứu 13 2.1.1 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cam thảo bắc từ hạt 13 2.1.2 Khảo sát mơi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cam thảo bắc in vitro 14 2.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cam thảo bắc 15 2.2.4 Nghiên cứu tái sinh Cam thảo bắc in vitro từ chồi 16 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu nghiên cứu 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cam thảo bắc từ hạt 23 3.2 Khảo sát mơi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cam thảo bắc in vitro đoạn thân mang chồi ngủ cắt từ in vitro 24 3.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cam thảo bắc in vitro 27 3.3.1 Đánh giá ảnh hưởng kết hợp chất điều hòa tăng trưởng BA NAA đến khả nhân nhanh chồi Cam thảo bắc 27 i 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng kết hợp chất điều hòa tăng trưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi Cam thảo bắc 31 3.4 Nghiên cứu tái sinh Cam thảo bắc in vitro từ chồi 34 3.4.1 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ chồi Cam thảo bắc 34 3.4.2 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ chồi Cam thảo bắc 36 3.5 Chi phí sản xuất giống in vitro 37 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 4.1 Kết luận 39 4.2 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC v ii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Mơi trường thí nghiệm khử trùng hạt Cam thảo bắc dung dịch Javel 2,5 % 14 Bảng 2.2 Bố trí mơi trường thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng BA đến khả tạo chồi Cam thảo bắc 15 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Cam thảo bắc 16 Bảng 2.4 Bố trí mơi trường thí nghiệm ảnh hưởng NAA IBA đến tạo rễ chồi Cam thảo bắc 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng dung dịch Sodium hypochlorite (Javel) 2,5 % lên khả nảy mầm hạt Cam thảo bắc 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA lên hình thành chồi đoạn thân mang chồi ngủ Cam thảo bắc 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BA NAA lên khả nhân nhanh chồi Cam thảo bắc in vitro 29 Bảng 3.4 Hiệu nhân chồi bổ sung BA IBA vào môi trường MS 31 Bảng 3.5 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ chồi Cam thảo bắc 35 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ chồi Cam thảo bắc 36 Bảng 3.7 Chi phí sản xuất dự kiến cho 1000 Cam thảo bắc phương pháp nuôi cấy mô 37 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây, quả, hạt rễ lát mỏng Cam thảo bắc G glabra Hình 3.1 Cây Cam thảo bắc in vitro nảy mầm từ hạt 24 Hình 3.2 Đoạn thân mang chồi ngủ cấy 26 Hình 3.3 Chồi tái sinh mơi trường MS có bổ sung chất điều hịa tăng trưởng BA với nồng độ khác sau 40 ngày ni cấy 26 Hình 3.4 Tương tác nồng độ BA NAA ảnh hưởng đến khả nhân chồi 28 Hình 3.5 Chồi Cam thảo bắc mơi trường MS có bổ sung BA NAA 30 Hình 3.6 Tương tác nồng độ BA IBA ảnh hưởng đến khả nhân chồi 32 Hình 3.7 Chồi Cam thảo bắc mơi trường MS có bổ sung BA IBA 33 Hình 3.8 Cây Cam thảo bắc tái sinh mơi trường MS có bổ sung IBA 35 Hình 3.9 Cây Cam thảo bắc tái sinh môi trường MS + 0,3 mg/L NAA 37 iv THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro Cam thảo bắc Glycyrrhiza glabra L từ hạt Chủ nhiệm Họ tên: Nguyễn Ngọc Ánh Năm sinh: 01/11/1986 Nam/Nữ: Nữ Học vị: Thạc sỹ Chuyên ngành: Sinh thái học Năm đạt học vị: 2015 Chức vụ (nếu có): Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103; Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: D47- Chung cư Khánh Hội 2-360ª Bến Vân Đồn, P1, Q4 Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 0938 522 236 E-mail: anhnn1986@gmail.com Chủ nhiệm Họ tên: Phan Thị Hồng Thủy Năm sinh: 05/02/1987 Nam/Nữ: Nữ Học vị: Thạc sỹ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Năm đạt học vị: 2014 Chức vụ (nếu có): Tên quan cơng tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103; Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: 201 Nguyễn Văn Khạ - Phú Hịa Đơng- Củ Chi - HCM Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 0901305287 E-mail: hongthuyitb@gmail.com Cơ quan chủ trì Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nơng nghiệp Cơng nghệ cao Điện thoại: 08.62646103 Fax: 08.62646104 E-mail: info@abi.com.vn Website: www.abi.com.vn Địa chỉ: ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp HCM Văn phòng giao dịch: 499, Cách mạng Tháng 8, phường 13, quận 10, Tp HCM Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2017 đến tháng 11/2017 Kinh phí duyệt: 119.943.018 đồng Nội dung Nội dung 1: Nghiên cứu tạo mẫu in vitro Cam thảo bắc từ hạt Nội dung 2: Khảo sát môi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cam thảo bắc in vitro Nội dung 3: Khảo sát môi trường nhân nhanh cụm chồi Cam thảo bắc in vitro Nội dung 4: Nghiên cứu tái sinh Cam thảo bắc in vitro từ chồi Sản phẩm Báo cáo phân tích có đầy đủ số liệu thu thập, phân tích, so sánh đánh giá Quy trình nhân giống in vitro Cam thảo bắc từ hạt đến giai đoạn tạo thành in vitro với hệ số nhân giống cao Cây giống Cam thảo bắc in vitro: số lượng 200 cây, có – rễ, cao – cm Tiến độ thực nhiệm vụ STT Nội dung Kết Nghiên cứu tạo mẫu in Hoàn vitro Cam thảo bắc từ thành hạt 100% Người thực Thời gian thực Nguyễn Ngọc 01/01/2017 đến Ánh 28/2/2017 Khảo sát mơi trường thích hợp tạo chồi - cụm chồi Cam thảo bắc in vitro Nguyễn Ngọc thành Ánh Phan Thị 100% Hồng Thủy Khảo sát mơi trường nhân Hồn Nguyễn Ngọc nhanh cụm chồi Cam thảo thành Ánh Phan Thị bắc in vitro Hoàn 100% Hồng Thủy 1/3/2017 đến 31/5/2017 01/06/2017 đến 31/8/2017 Nghiên cứu tái sinh Hoàn Nguyễn Ngọc 01/09/2017 Cam thảo bắc in vitro từ thành Ánh Phan Thị đến Hồng Thủy 29/11/2017 chồi 100% PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Cam thảo bắc có nhiều cơng dụng, sử dụng nhiều thuốc làm nguyên liệu cho nhiều chế phẩm dược phẩm nên thị trường tiêu thụ rộng lớn, giá trị trường dao động khoảng 200.000 - 300.000 đồng/kg rễ khô (tỉ lệ tươi : khô 2,5:1), 9.500.000 đồng/kg hạt giống nơi cung cấp giống Là lồi thích nghi với khí hậu ôn hòa (18 – 20oC), không kén chọn đất trồng, Cam thảo bắc hứa hẹn nhiều tiềm để tham gia giải tốn cấu trồng nơng nghiệp vùng núi phía Bắc vùng trung du, cao nguyên phía Nam Việt Nam (hiện trồng thử nghiệm số tỉnh Lai Châu, Lào Cai, Sơn La…) Cam thảo bắc với phương pháp trồng hạt cho hiệu tương đối thấp: sau năm thu hoạch, chất lượng hạt giống thị trường khơng đồng đều, khó kiểm soát chất lượng con; hom giống thực nhiều thời gian, hom phải lấy từ mẹ – tuổi, lấy hom kết hợp với thu hoạch làm ảnh hưởng đến chất lượng rễ thu hoạch Do đó, biện pháp vi nhân giống với ưu nhân nhanh số lượng lớn, kiểm soát mẫu ban đầu, giống đồng đều, bệnh - lựa chọn thích hợp để xem xét nhân giống loài này, thay biện pháp nhân giống truyền thống nêu với kỳ vọng đem lại hiệu kinh tế Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng quy trình nhân nhanh hiệu Cam thảo bắc Glycyrrhiza glabra L in vitro đạt tiêu chuẩn từ hạt phục vụ sản xuất chuyển giao cơng nghệ mơi trường thích hợp để tái sinh Cam thảo bắc từ chồi môi trường CT3 (MS có bổ sung IBA với nồng độ 1,5 mg/L) Kết khác không nhiều sai lệch so với kết luận Patel cộng (2007) môi trường MS bổ sung 0,5 – mg/L IBA mơi trường thích hợp để rễ Cam thảo bắc phát triển khỏe, bình thường 3.4.2 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ chồi Cam thảo bắc Theo kết trình bày bảng 4.6, việc bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy nồng độ – 0,5 mg/ L không tạo nên khác biệt tỉ lệ mẫu tạo rễ, trung bình thời gian tạo rễ số rễ/cây con, nhiên có ảnh hưởng đến trung bình chiều dài rễ trung bình chiều cao Do chênh lệch nồng độ nghiệm thức nhỏ nên khác biệt nhóm nghiệm thức khơng rõ rệt Xem xét tất tiêu theo dõi, cho sử dụng NAA làm chất kích thích tạo rễ từ chồi Cam thảo bắc, nên sử dụng nồng độ 0,3 mg/ L, kết bổ sung cho nghiên cứu trước Mareshige Kohjyouma cộng (các tác giả cho tạo rễ cho chồi Cam thảo bắc thực mơi trường MS có bổ sung NAA 0,01 – 0,5 mg/L) Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ chồi Cam thảo bắc TB thời TB TB TB Số Nghiệm Nồng độ Tỉ lệ mẫu gian tạo Chiều Chiều rễ/cây thức NAA tạo rễ (%) rễ dài rễ cao (ngày) (cm) (cm) * ĐC 71,3 23bc 2,5a 3,5c 4,3bc CT1 0,1 77,5 21a 2,5a 1,3a 4,0ab CT2 0,2 80,0 21ab 2,7ab 1,5b 4,5c CT3 0,3 80,0 22abc 3,0b 1,6b 4,6c CT4 0,4 75,0 21ab 2,6a 1,4ab 4,3bc CT5 0,5 77,5 24c 2,8ab 1,5a 3,7a CV% 6,98 7,33 8,83 8,3 6,24 P >0,05 >0,05 >0,05