Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây dược liệu huyền sâm scrophularia ningpoensis hemsl và cát cánh platycodon grandiflorum

I MỞ ĐẦU 1.1 Thông tin chung dự án Họ tên: Phan Thị Hồng Thủy Năm sinh: 05/02/1987 Học vị: Thạc sỹ Nam/Nữ: Nữ Chuyên ngành:Công nghệ Sinh học Năm đạt học vị: 2014 Chức vụ (nếu có): Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103 ; Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: 201 Nguyễn Văn Khạ - Phú Hịa Đơng- Củ Chi - HCM Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 01212525584 E-mail: hongthuyitb@gmail.com Cán phối hợp TT Họ tên Chuyên Cơ quan Chữ ký xác (Học vị ngành Công tác nhận tham gia đề tài chức danh KH) ThS Nguyễn Sinh lý Trung tâm Ươm tạo Doanh Cửu Thành thực vật nghiệp Nông nghiệp Công Nhân nghệ cao TP.HCM 1.2 Tính cấp thiết dự án Hiện nay, phát triển Đông y Nam dược giúp góp phần chữa trị phần nhiều chứng bệnh người vấn đề nan giải Y học đại Những thuốc dân gian tận dụng triệt để nhằm giải nhu cầu điều trị bệnh cải thiện sức khỏe người Tuy nhiên để khai thác hết tiềm từ thuốc này, cần có chiến lược phù hợp nhằm nghiên cứu, phát triển, bảo tồn phát huy di sản thuốc dân gian Platycodon chi có lồi Cát cánh Thành phần hóa học chủ yếu ghi nhận có Saponin, Platycodin, Polygalacin, Methylplatyconate, Platiconic acid-A-Lactone, Platycodigenin (Ha YW cộng sự, 2006) có tác dụng dược lý ảnh hưởng hệ hơ hấp, nội tiết, chuyển hóa lipid, chống nấm, kháng viêm, an thần, giảm đau, giải nhiệt, chống loét dày, ức chế miễn dịch Cây Huyền sâm tên khoa học Scrophularia ningpoensis Hemsl Thành phần hóa học chủ yếu nghiên cứu Huyền sâm Asparagine, Oleic acid, Linoleic acid, Stearic acid, Harpagide, Harpagoside, Ningpoenin, Aucubin, 6-O-Methylcatalpol (Kitagawa I cộng sự, 1967) Cây Huyền sâm có tác dụng dược lý tác dụng kháng khuẩn (mạnh Pseudomonas aeruginosa); tác dụng hệ tim mạch, an thần Theo định 1976 quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030 Thủ tướng Chính phủ, Việt Nam có vùng trồng nguyên liệu nước để trồng 54 loài dược liệu, lựa chọn khai thác hợp lý 24 loài dược liệu tự nhiên [http://suckhoedoisong.vn] Hai thuốc Cát Cánh Huyền Sâm nằm danh mục 54 loài dược liệu Chính phủ Việt Nam lựa chọn để phát triển cho vùng chuyên canh dược Tuy nhiên với diện tích chun canh lớn, khó khăn cịn gặp phải số lượng giống chất lượng giống chưa đảm bảo, quy trình nhân trồng chưa hợp lý dẫn đến chất lượng đầu thuốc cịn hạn chế Do địi hỏi phải có quy trình nhân giống cung cấp giống đảm bảo đủ số lượng chất lượng thay cho phương pháp nhân giống truyền thống điều cần thiết Nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp giải vấn đề nhờ ứng dụng Công nghệ sinh học cho nhiều quy trình vi nhân giống loài thực vật quý giúp phát triển nguồn thực vật theo hướng bền vững Ở Việt Nam có vài cơng trình nghiên cứu hai thuốc này, nhiên chưa có cơng trình vi nhân giống công bố Trên sở nhu cầu sử dụng dược liệu nước; định hướng phát triển dược liệu quý theo hướng bền vững, xây dựng dự án “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro dược liệu Huyền Sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl.) Cát Cánh (Platycodon grandiflorum)” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Hồn thiện quy trình nhân giống in vitro Huyền Sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl.) Cát Cánh (Platycodon grandiflorum) 1.3 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi nội dung nghiên cứu dự án: nhân giống Huyền Sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl.) Cát Cánh (Platycodon grandiflorum) phương pháp nuôi cấy mô - Giới hạn nghiên cứu: thời gian thực dự án bị giới hạn nên việc nghiên cứu khảo sát điều kiện huấn luyện in vitro, điều kiện sinh trưởng hậu cấy mô chưa thực II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.Tổng quan Huyền sâm 2.1 Cây Huyền sâm Các chi Scrophularia bao gồm khoảng 312 loài thảo dược năm, hai năm lâu năm, phân bố toàn giới Nhiều loài chi sử dụng y học cổ truyền từ thời cổ đại Một số glycosid iridoid, propanoids phenyl, terpenoids, flavonoids phân lập từ loài Scrophularia (Bhandari cộng sự, 1997; Li cộng sự, 2000) Glycoside iridoid coi thành phần hoạt tính sinh học chính, với chất chống oxy hóa, chống viêm, kháng khuẩn, trị đái tháo đường, hoạt động bảo vệ thần kinh (Ahmed cộng sự, 2003; Kim cộng sự, 2003) Harpagoside, glycoside iridoid lớn hoạt tính sinh học, chứng minh có khả chống oxy hóa, kháng viêm bảo vệ thần kinh (Kim cộng sự, 2002; Ahmed cộng 2003) Cây Huyền sâm có tên khoa học Scrophularia ningpoensis Hemsl Thuộc họ Mõm sói (Scrophulariaceae) Có tài liệu cịn gọi Scrophularia buergeriana Mig (Đỗ Tất Lợi, 2011) Là loài thân thảo, sống nhiều năm, thân vuông cao độ 1,7-2,3m, màu tím xanh Lá mọc đối có cuống hình trứng dài, đầu nhọn vát, rìa có cưa, màu xanh nhạt Cây hoa mùa hè Hoa tự xếp thành hình chùy trịn, ống tràng hoa hình chén, cánh hình mơi, chia làm thùy, màu tím xám dài ngắn, thùy Quả bế đơi hình trứng Hạt nhỏ bé, nhiều hạt màu đen, rễ to mập cong, dài độ 10-20cm, rễ củ phình lớn, hai đầu củ thon, nói chung gốc có 4-5 củ mọc thành chùm, lúc tươi vỏ màu trắng vàng nhạt, sau chế biến vỏ màu nâu nhạt bên màu đen, mềm dẻo Huyền sâm xuất xứ số tỉnh Trung Quốc thường trồng vào đầu mùa hạ, đến mùa thu sang năm thu hoạch Huyền sâm di thực vào nước ta, trồng đồng hay miền núi cho xuất cao, chất lượng tốt Ở đồng gieo trồng tháng 10-11, miền núi tháng 2-3 Cây ưa đất pha cát nhiều chất mùn, màu mỡ, thoát nước tốt Có thể gieo thẳng trồng mầm non sau thu hoạch thông thường gieo thẳng Ngâm hạt với nước ấm, giờ, vớt để ráo, trộn với đất bột để gieo Gieo xong tưới nước phủ rơm rạ Vào vụ, đồng thu hoạch vào tháng 7-8, miền núi tháng 10-11, năm thứ sau trồng, lúc tàn lụi, thu lấy củ Nếu cần lấy đầu chồi đầu củ để làm giống, cần kết hợp chọn lúc Hình 1: Cây Huyền Sâm (http://www.bachkhoatrithuc.vn) Phần dùng làm thuốc: Rễ gọi củ khơ, hình trụ, phình lớn, phía thn nhỏ lần, phía trước gốc có cổ hẹp lại, phía có nuốm phình lớn, rễ dài từ 12-15cm, rộng chừng 21mm, 25mm, mặt ngồi biểu màu nâu đất, có nếp nhăn sâu rõ ràng bì khổng dài ngang màu đất sét, nếp nhăn nằm ngang tương đối ít, có thấy sẹo nhánh rễ bị đứt ngang, chất cứng dẻo, khó bẻ gãy, mặt cắt ngang mềm màu đen nhiều thịt, đầu ướt keo khói đèn Thục địa, biểu dạng xơ, phía ngồi có lớp bần mỏng, phía có nhiều vân tỏa (bó libe gỗ) Bột màu đen, nhạt, vị mặn 2.1.2 Thành phần hóa học Huyền sâm Cây Huyền Sâm chứng minh chứa số thành phần hóa học quan trọng sau: L-Asparagine, Oleic acid, Linoleic acid, Stearic acid, Harpagide, Harpagoside, Ningpoenin (Kitagawa I cộng sự, 1967) Aucubin, 6-O-Methylcatalpol (Quian J cộng sự, 1992) 2.1.3 Tác dụng dược lý Huyền sâm Cây Huyền sâm chứng minh có số tác dụng dược lý (Giner R cộng sự, 1991): Tác dụng kháng khuẩn: In vitro, nước sắc Huyền sâm có tác dụng kháng khuẩn mạnh Pseudomonas aeruginosa Tác dụng hệ tim mạch: Nước sắc Huyền sâm có tác dụng tăng huyết áp, đặc biệt huyết áp cao thận Hiệu có lẽ tác dụng co mạch Nước sắc Huyền sâm có tác dụng an thần, chống co giật, giải nhiệt Cồn chiết xuất Huyền sâm có tác dụng làm tăng lưu lượng máu mạch vành, làm cho sức chịu đựng trạng thái thiếu Oxy tim tốt Ức chế nấm da Cồn chiết xuất Huyền sâm có tác dụng làm tăng lưu lượng máu mạch vành làm cho sức chịu đựng trạng thái thiếu oxy tim tốt 2.2.Tổng quan Cát cánh 2.2.1 Cây Cát cánh Cây Cát cánh có tên khoa học Platycodon grandiflorum (Jacq) ADC var glaucum Sieb et Zucc Thuộc họ Hoa Chuông (Campanulaceae) (Võ Văn Chi, 2012) Cây thảo sống lâu năm, thân cao 0,60-0,90m Rễ củ nạc, màu vàng nhạt Lá gần khơng có cuống Lá phía mọc đối mọc vịng 3-4 Phiến hình trứng, mép có cưa to Lá phía nhỏ, có mọc cách Hoa mọc đơn độc hay thành bơng thưa Dài màu lục, hình chng rộng, mép có thùy Tràng hình chng màu xanh tím hay trắng Quả hình trứng ngược Có hoa từ tháng 5-8 Quả tháng 7-9 Cát cánh mọc hoang trồng nhiều nơi Trung Quốc, nhập vào nước ta Củ to, dài màu trắng ngà Hình 2: Cây Cát cánh (http://suckhoedoisong.vn) Bộ phận dùng làm thuốc rễ củ Cát cánh Rễ Cát cánh khô hình gần hình thoi, cong, dài khoảng 6cm-19cm, đầu thơ khoảng 12-22mm, bên ngồi gần màu trắng, màu vàng nhạt, có vết nhăn dọc sâu cong thắt, phần lồi bóng mượt, phần phình to, đầu trước cuống nhỏ dài, dài 32mm, có đốt vết mầm khơng hồn chỉnh, thùy phân nhánh đỉnh, có vết thân, dễ bẻ gẫy, mặt cắt gần màu trắng màu vàng trắng 2.2.2.Thành phần hóa học Cát cánh Cây Cát cánh chứng minh có chứa thành phần hóa học quan trọng sau (Ha YW cộng sự, 2006): Platycodin A, C, D Deapioplatycodin D, D3, 2”-O-Acetylplatycodin D2, 3”-O-Acetylplatycodin D2, Polygalacin D, D2, 2”-O-Acetylpolygalacin D, D2, 3”-O-Acetylpolygalacin D, D2, Methylplatyconate-A, Methyl 2-O- Methylplatyconate-A, Platiconic acid-ALactone Polygalin acid, Platycodigenin, a-Spinasterol, a-Spinasteryl, b-D-Glucoside, Stigmasterol, Betulin, Platycodonin, Platycogenic acid, A, B, C, Glucose 2.2.3 Tác dụng dược lý Cát cánh Cây Cát cánh chứa số tác dụng dược lý (Takagi K cộng sự, 1972) sau: Ảnh hưởng hệ hơ hấp: Cho chó mèo gây mê uống nước sắc Cát cánh, thấy niêm mạc phế quản tăng tiết dịch rõ, chứng minh Cát cánh có tác dụng long đờm mạnh Tác dụng nội tiết: Nước sắc Cát cánh làm giảm đường huyết thỏ,đặc biệt trường hợp gây tiểu đường nhân tạo, thuốc có tác dụng rõ Tác dụng chuyển hóa Lipid: Trên thí nghiệm, cho chuột uống nước sắc Cát cánh, thấy có tác dụng chuyển hóa cholesterol, giảm cholesterol gan Tác dụng chống nấm: Trong thí nghiệm, nước sắc cát cánh có tác dụng ức chế nhiều loại nấm da thông thường Tác dụng huyết học: Saponin Cát cánh có tác dụng tán huyết mạnh gấp lần so với Saponin Viễn chí, dùng đường uống, thuốc bị dịch vị thủy phân nên khơng cịn tác dụng tán huyết Do khơng dùng để chích Saponin Cát cánh có tác dụng kháng viêm, an thần, giảm đau, giải nhiệt, chống loét dầy, ức chế miễn dịch 2.3 Tình hình nghiên cứu vi nhân giống Huyền sâm Cát cánh Hiện chưa có cơng bố vi nhân giống hai Huyền sâm Cát cánh nước, biện pháp nhân giống phương pháp truyền thống gieo hạt giâm chồi non Một số nghiên cứu tập trung chủ yếu dược tính tác dụng hai thuốc đối tượng thí nghiệm Trên giới, đặc biệt Trung Quốc Hàn Quốc, có nhiều nghiên cứu chuyên sâu hai thuốc Huyền sâm Cát cánh Các quy trình vi nhân giống hai này, hay khác họ, chi công bố rộng rãi 2.3.1 Cây Cát cánh Tác giả Yonemitsu cộng nghiên cứu vi nhân giống Cát cánh với mẫu ban đầu chồi nách nuôi cấy môi trường Murashige - Skoog ( MS ) bổ sung thêm 0,3 mg / l - benzylaminopurine ( BAP ) 0,1 mg / l alpha - naphthaleneacetic acid ( NAA ) Tỷ lệ chồi hình thành chồi 50 % số lượng trung bình chồi chồi 4,2 Môi trường cho hệ số nhân chồi tốt mơi trường MS có bổ sung 0,3 mg / l BAP 0,03 mg / l NAA Tỉ lệ hình thành rễ 100% mẫu cấy nuôi cấy mơi trường MS có bổ sung 0,03 mg / l NAA Các chuyển giao huấn luyện chuyển giao cho khu canh tác dược liệu Để nghiên cứu điều kiện nuôi cấy tối ưu cho mẫu chồi gốc thân cát cánh, tác giả Wang Guimei cộng sử dụng mơi trường mơi trường MS có bổ sung -BA NAA nồng độ khác để tạo Cát cánh hồn chỉnh Mơi trường tái sinh thích hợp tác giả cơng bố mơi trường MS có chứa 1.0mg / L 6- BA 0,5 mg / L NAA với mẫu cấy mơ sẹo từ gốc thân Cát cánh Với mục đích nhân chồi, môi trường MS bổ sung với 0,5 mg / L -BA 0.1mg / L NAA môi trường cho tỉ lệ nhân chồi cao Môi trường tạo rễ tốt MS bổ sung 0,5mg /l NAA Với mục đích thiết lập điều kiện tái sinh Cát cánh quản lý điều kiện việc nhân giống in vitro, tác giả Eun-Heui Han cộng nghiên cứu vi nhân giống Nhóm tác giả cơng bố mơi trường cảm ứng sẹo tốt môi trường MS bổ sung 0,5 mg / l NAA 1,0 mg / l BA Chất điều hòa NAA đánh giá tốt IBA cho cảm ứng gốc phải 16,9 ngày cảm ứng rễ bán rắn MS có chứa 0,5 mg / l NAA tỷ lệ phát sinh rễ cuối lên đến 75% Nhóm tác giả sử dụng loại đất khác để trồng Cát cánh, số loại đất khác mua từ thị trường nội địa “Tosil" xác định tốt cho thích nghi phát triển Cát cánh 2.3.2 Cây Huyền sâm Những nghiên cứu họ Mõm sói tác giả giới công bố: Trên họ Mõm sói Scrophularia yoshimurae, tác giả Yamazaki Lin cộng công bố với mẫu chồi cây, tỉ lệ nhân chồi trung bình 7,5 chồi mơi trường MS có bổ sung 1-2 mg / BA 0,2 mg / NAA sau tháng nuôi cấy Môi trường MS bổ sung 0-0,5 mg / NAA IBA cho tỉ lệ phát sinh rễ cao Tỷ lệ sống sót 80% đem trồng giá thể chứa hỗn hợp chất khoáng: than bùn rêu: đất = 2: 1: Nhóm tác giả nghiên cứu thành phần chất Harpagoside khẳng định hợp chất phát từ mô khác lồi khác họ Mõm sói HPLC Kết cho thấy thân lồi hoang dã có chứa harpagoside cao nhất, gốc rễ loài hoang dã non, thấp lồi ni trồng nhân tạo Đối với chi Huyền sâm, nhóm tác giả cơng bố hợp harpagoside cao so với loài khác trồng nhân tạo, thuộc chi coi thảo dược có chất lượng tốt Trung Quốc Đài Loan Đối với Scrophularia kakudensis, tác giả Abinaya Manivannan có nghiên cứu vi nhân giống Cảm ứng chồi cho kết cao môi trường MS chứa 2,0 mg /l-1 6-benzyladenine (BA) 0,5 mg/L -1 indole axit -3-acetic (IAA) Số lượng tối đa rễ (16.5) ghi nhận môi trường MS có bổ sung 0,5 mg /l IAA Tỷ lệ sống sót thành cơng (95%) nhà kính Trên Scrophularia takesimensis, nhóm tác giả Iyyakkanu sivanesani cộng lấy mẫu chồi thân từ trưởng thành cảm ứng tạo chồi môi trường MS bổ sung nồng độ khác isopentyl adenine (2-iP), 6-benzyl adenin (BA) thidiazuron (TDZ) Trong ba cytokinin, BA cytokinin hiệu cho nhiều cảm ứng tạo chồi tốt Bổ sung auxin vào môi trường tái sinh chồi tăng cường đáng kể tỷ lệ cảm ứng tạo chồi nhân chồi Tỷ lệ phần trăm lớn 10 - Bước (Nuôi cấy tạo nguồn mẫu ban đầu): Mẫu sau khử trùng cắt thành đoạn nhỏ chứa mắt ngủ đặt môi trường MS + 0,5 mg/L BA+0,1 mg/L NAA Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux - Bước (Nhân nhanh cụm chồi): Chồi Cát cánh in vitro chuyển qua môi trường nhân nhanh chồi MS + 0,3 mg/L BA +0,3 mg/L NAA Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux - Bước (Ra rễ tạo hoàn chỉnh): Chồi Cát cánh chuyển vào mơi trường kích thích tạo rễ MS + 0,5 mg/L NAA Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux Kết xử lý thí nghiệm vơ mẫu Huyền sâm Ti le nhiem YEU TO 09:40 Thursday, December 23, 2016 The GLM Procedure Dependent Variable: TL Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 14 57827.24578 4130.51756 742.84 F 4625.29244 2312.64622 415.91 F Model 14 53167.56944 3797.68353 F A F Model 16839.58333 5613.19444 336.79 F T 16839.58333 5613.19444 336.79 F Model 16210.00000 4052.50000 162.10 F T 16210.00000 4052.50000 162.10