Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoài sơn dioscorea persimilis prain et burkill

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (GIAI ĐOẠN 1) NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY THUỐC Q HỒI SƠN (Dioscorea persimilis Prain et Burkill) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (GIAI ĐOẠN 1) NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY THUỐC QUÝ HOÀI SƠN (Dioscorea persimilis Prain et Burkill) CHỦ NHIỆM CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) Nguyễn Văn Tồn Vũ Thị Thúy Hằng THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi THÔNG TIN CHUNG PHẦN MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu Hoài Sơn 1.2 Phân bố 1.3 Dược tính .8 1.4 Tình hình nghiên cứu nhân giống in vitro Hoài Sơn .8 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước nhân giống in vitro Hoài Sơn 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước nhân giống in vitro Hoài Sơn Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Nội dung nghiên cứu 13 2.1.1 Nội dung 1: Khử trùng tạo nguồn mẫu ban đầu Hoài Sơn từ đoạn thân mang chồi ngủ 13 2.1.2 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP, Kinetin) đến khả tạo chồi từ chồi ngủ Hoài Sơn 14 2.1.3 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP kết hợp NAA, Kinetine kết hợp với NAA) đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hai mơi trường nuôi cấy: bán rắn lỏng lắc 16 2.1.4 Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến tái sinh chồi từ chồi in vitro Hoài Sơn 21 i 2.1.5 Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhóm auxin (NAA, IBA) đến khả rễ chồi in vitro Hoài Sơn 23 2.1.6 Nội dung 6: Xác định mơi trường khống dinh dưỡng phù hợp cho sinh trưởng Hoài Sơn in vitro hoàn chỉnh 24 2.1.7 Nội dung 7: Nghiên cứu số loại giá thể ảnh hưởng đến phát triển Hồi Sơn cấy mơ 25 2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 26 2.3 Vật liệu nghiên cứu .26 2.4 Phương pháp thí nghiệm 27 2.4.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy 27 2.4.2 Phương pháp tạo nguồn mẫu ban đầu 27 2.4.3 Phương pháp nuôi cấy tạo chồi từ chồi ngủ 27 2.4.4 Phương pháp nhân nhanh chồi 27 2.5 Phương pháp thu thập số liệu 28 2.6 Các tiêu theo dõi 28 2.7 Phương pháp phân tích số liệu 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Xây dựng quy trình vơ mẫu từ Hồi Sơn từ đoạn thân mang chồi ngủ 31 3.2 Khảo sát ảnh hưởng số chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả tạo chồi từ chồi ngủ Hoài Sơn 32 3.3 Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn .36 3.3.1 Ảnh ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn mơi trường ni cấy bán rắn 36 3.3.2 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật BAP kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy lỏng lắc 38 ii 3.3.3 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy bán rắn 40 3.3.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 42 3.4 Sản phẩm nhiệm vụ 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 4.1 Kết luận 45 4.2 Đề nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 PHỤ LỤC vii PHỤ LỤC ix iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Môi trường tạo chồi nguồn mẫu số lồi 11 Bảng 1.2 Mơi trường tạo củ nguồn mẫu số loài 11 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian khử trùng đoạn thân Hoài Sơn có mang chồi ngủ dung dịch NaClO 14 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng chất điều hịa sinh trưởng thực vật BAP đến khả tạo chồi từ chồi ngủ đoạn thân Hoài Sơn 15 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy bán rắn 16 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả nhân chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 17 Bảng 2.6 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy bán rắn 18 Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả nhân chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 19 Bảng 2.8 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tái sinh chồi từ cụm chồi in vitro Hoài Sơn 21 Bảng 2.9 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tái sinh chồi từ cụm chồi in vitro Hoài Sơn 22 Bảng 2.10 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi in vitro Hoài Sơn 23 Bảng 2.11 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi in vitro Hoài Sơn 24 Bảng 2.12 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến sinh trưởng Hoài sơn in vitro 25 Bảng 2.13 Bố trí thí nghiệm giá thể trồng Hoài Sơn 26 Bảng 3.1 Kết ảnh hưởng nồng độ dung dịch NaClO thời gian khử trùng mẫu đoạn thân Hoài Sơn mang chồi ngủ 31 iv Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả tạo chồi từ chồi ngủ Hoài Sơn 32 Bảng 3.3 Kết ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn mơi trường nuôi cấy bán rắn 36 Bảng 3.4 Kết ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy lỏng lắc 38 Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy bán rắn 41 Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy lỏng lắc 43 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Hoài Sơn Hình 3.1 Cây Hồi Sơn in vitro phát triển từ chồi giai đoạn vơ mẫu 32 Hình 3.2 Chồi Hồi sơn đươc hình thành ảnh hưởng BAP Kinetine sau tháng nuôi cấy 35 Hình 3.3 Sự hình thành cụm chồi Hồi Sơn mơi trường tạo cụm chồi Hồi Sơn mơi trường nuôi cấy bán rắn 38 Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 40 Hình 3.5 Ảnh hưởng Kinetin NAA đển tạo cụm chồi Hồi Sơn tháng ni cấy mơi trường bán rắn 42 Hình 3.6 Ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 44 vi THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro thuốc quý Hoài Sơn (Dioscorea persimilis Prain et Burkill) (Giai đoạn 1)  Chủ nhiệm 1: Họ tên: Nguyễn Văn Toàn Năm sinh: 02/03/1983 Nam/Nữ: Nam Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Sinh học Năm đạt học vị: 2006 Chức vụ (nếu có): Trưởng phịng HTCN TBTV Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: Ấp 1, Phạm Văn Cội, Củ Chi, Hồ Chí Minh Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 01212816981 E-mail: nguyenvantoan0203@yahoo.com.vn  Chủ nhiệm 2: Họ tên: Vũ Thị Thúy Hằng Năm sinh: 03/10/1994 Nam/Nữ: Nữ Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Sinh học Năm đạt học vị: 2016 Chức vụ (nếu có): Chun viên phịng HTCN TBTV Tên quan cơng tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP.HCM Điện thoại quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: Ấp 2, xã Phạm Văn Cội, Củ Chi, TP.HCM Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 01204 887 828 E-mail: vuthuyhang0310@gmail.com  Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC  Thời gian thực hiện: 12 tháng  Kinh phí duyệt: 125.775.710 đồng Nội dung: Giai đoạn (01/2017 – 12/2017): Nhân nhanh cụm chồi in vitro Hoài Sơn Nội dung 1: Khử trùng tạo nguồn mẫu ban đầu Hoài Sơn từ đoạn thân mang chồi ngủ Thời gian thực hiện: 01/01/2017 đến 28/02/2017 Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng BAP Kinetine đến khả tạo chồi từ chồi ngủ Hoài Sơn Thời gian thực hiện: 01/03/2017 đến 31/05/2017 Nội dung 3: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (BAP kết hợp NAA, Kinetine kết hợp với NAA) đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hai môi trường nuôi cấy: bán rắn lỏng lắc Thời gian thực hiện: 01/06/2017 đến 30/11/2017 Giai đoạn (01/2018 – 12/2018): Ra rễ tạo Hoài Sơn hoàn chỉnh Nội dung 4: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến tái sinh chồi từ chồi in vitro Hoài Sơn Thời gian thực hiện: 01/2018 đến 02/2018 Nội dung 5: Khảo sát ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nhóm auxin (NAA, IBA) đến khả rễ chồi in vitro Hoài Sơn Thời gian thực hiện: 03/2018 đến 05/2018 Nội dung 6: Xác định mơi trường khống dinh dưỡng phù hợp cho sinh trưởng Hoài Sơn in vitro hoàn chỉnh Thời gian thực hiện: 06/2018 đến 08/2018 Nội dung 7: Nghiên cứu số loại giá thể ảnh hưởng đến phát triển Hồi Sơn cấy mơ Thời gian thực hiện: 09/2018 đến 11/2018 Sản phẩm nhiệm vụ: 50 bình chồi Hồi Sơn với tiêu chuẩn bao gồm: cụm chồi/bình, chồi/cụm chồi, chồi có chiều cao từ 0,5 cm làm tiến triển theo chiều hướng không thuận lợi cho mẫu cấy (Jain & Ishii, 2012) Bảng 3.5 Kết ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy bán rắn NT Hàm lượng chất điều hòa Tỷ lệ hình Số chồi Kinetin (mg/L) NAA (mg/L) thành chồi (%) trung bình ĐC 1,0 0,0 100 0,47e CT1 1,0 0,2 100 0,48e CT2 1,0 0,4 100 0,41f CT3 1,5 0,0 100 0,65b CT4 1,5 0,2 100 0,79a CT5 1,5 0,4 100 0,58c CT6 2,0 0,0 100 0,63b CT7 2,0 0,2 100 0,63b CT8 2,0 0,4 100 0,51d CV(%) - 3,16 F (tính) - ** Chú thích: a, b, c kí hiệu cho nhóm Trong cột, trung bình ký tự khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê ** có khác biệt ý nghĩa ý thống kê Dựa vào bảng số liệu cho thấy cho thấy nghiệm thức không bổ sung chất điều hịa sinh trưởng tỉ lệ tái sinh từ cụm chồi số lượng hình thành thấp Ở nghiệm thức khơng bổ sung Kinetin cho khả tạo cụm chồi thấp Số lượng chồi hình thành tăng tỉ lệ thuận với nồng độ Kinetin tăng dần đạt cao nồng độ Kinetin 1,5 mg/L Vượt nồng độ (2,0 mg/L) số lượng chồi hình thành giảm giảm Điều chứng tỏ Kinetin có vai trị quan trọng cảm ứng tạo cụm chồi Hoài Sơn Đối với nghiệm thức có bổ sung Kinetin NAA cho kết tốt so với chất bổ sung riêng lẻ Điều chứng minh Kinetin NAA có tác dụng hỗ trợ q trình nhân nhanh cụm chồi Hồi Sơn Và kết cao 41 nghiệm thức CT4 bổ sung Kinetin nồng độ 1,5 mg/L NAA nồng độ 0,2 mg/L thể tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi số lượng chồi trung bình 7,9 chồi/mẫu Kết phù hợp với nghiên cứu trước Zhang Liu (2010) công bố môi trường tăng sinh chồi tốt cho Dioscorea collettii Hook F MS + mg/L BAP + 0,1 mg/L NAA MS + mg/L KT + 0,5 mg/L NAA (Zhang, Sa, & Liu, 1998) Hình 3.5 Ảnh hưởng Kinetin NAA đển tạo cụm chồi Hồi Sơn tháng ni cấy môi trường bán rắn A Ki mg/L; B Ki mg/L: NAA 0,2 mg/L; C Ki mg/L: NAA 0,4 mg/L; D Ki 1,5 mg/L: NAA mg/L; E Ki 1,5 mg/L: NAA 0,2 mg/L; F Ki 1,5 mg/L: NAA 0,4 mg/L; G Ki mg/L: NAA mg/L; H Ki mg/L: NAA 0,2 mg/L; I Ki mg/L: NAA 0,4 mg/L; 3.3.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc 42 Bảng 3.6 Kết ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc NT Hàm lượng chất điều hịa Tỷ lệ hình Số chồi Kinetin (mg/L) NAA (mg/L) thành chồi (%) trung bình ĐC 1,0 0,0 100 0,48e CT1 1,0 0,2 100 0,50e CT2 1,0 0,4 100 0,49e CT3 1,5 0,0 100 0,71b CT4 1,5 0,2 100 0,92a CT5 1,5 0,4 100 0,60d CT6 2,0 0,0 100 0,64c CT7 2,0 0,2 100 0,63c CT8 2,0 0,4 100 0,49e CV(%) - 1,21 F (tính) - ** Chú thích: a, b, c kí hiệu cho nhóm Trong cột, trung bình ký tự khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê ** có khác biệt ý nghĩa ý thống kê Dựa vào bảng kết cho thấy, ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hoài Sơn hệ thống nuôi cấy lỏng lắc giống với nghiệm thức tương ứng bổ sung Kinetin, NAA nồng độ tương ứng môi trường nuôi cấy bán rắn.Tuy nhiên tất nghiệm thức tương ứng cho kết tốt Điều cho thấy môi trường ni cấy lỏng lắc thích hợp cho q trình nhân nhanh cụm chồi Hoài Sơn 43 A B C D E F G H I Hình 3.6 Ảnh hưởng Kinetin kết hợp với NAA đến khả tạo cụm chồi Hồi Sơn hệ thống ni cấy lỏng lắc A Ki mg/L; B Ki mg/L: NAA 0,2 mg/L; C Ki mg/L: NAA 0,4 mg/L; D Ki 1,5 mg/L: NAA mg/L; E Ki 1,5 mg/L: NAA 0,2 mg/L; F Ki 1,5 mg/L: NAA 0,4 mg/L; G Ki mg/L: NAA mg/L; H Ki mg/L: NAA 0,2 mg/L; I Ki mg/L: NAA 0,4 mg/L; 3.4 Sản phẩm nhiệm vụ 50 bình chồi Hồi Sơn với tiêu chuẩn bao gồm: cụm chồi/bình, chồi/cụm chồi, chồi có chiều cao từ 0,5 cm 44 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Xây dựng thành công quy trình nhân giống in vitro Hồi Sơn từ giai đoạn vô mẫu tới nhân nhanh tạo cụm chồi phương pháp nuôi cấy mô Môi trường cảm ứng tạo chồi từ chồi ngủ môi trường MS + 0,2 mg/L BAP + 1,0 mg/L Kinetin Môi trường cảm ứng tạo cụm chồi môi trường lỏng lắc môi trường MS + 1,5 mg/L Kinetin + 0,2 mg/L NAA 4.2 Đề nghị Khảo sát thêm ảnh hưởng thành phần hữu không xác định chuối, khoai tây, nước dừa đến khả nhân nhanh cụm chồi in vitro Hồi Sơn Chuyển giao quy trình cơng nghệ cho doanh nghiệp tham gia chương trình ươm tạo cá nhân có nhu cầu 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng việt Võ Văn Chi (2007) Sách tra cứu tên cỏ Việt Nam Nhà xuất Giáo dục Làn Văn Đông (2014) Nghiên cứu khả tái sinh khoai từ [Dioscorea esculenta (lour.) burkill] kỹ thuật in vitro Đại học Nông lâm Thái Nguyên Phạm Văn Hiển, & Nguyễn Thị Chinh (2016) Nhân nhanh in vitro củ mài (Dioscorea persimilis Prain et Burk) đốt thân pp - 11 Phạm Hoàng Hộ (2007) Cây cỏ Việt Nam Nhà xuất Trẻ Nguyễn Nghĩa Thìn (1997) Cẩm nang nghiên cứu đa dạng sinh vật Hà Nội: Nhà xuất Nông nghiệp  Tài liệu tiếng anh Acedo, V Z., & Arradaza, C C (2012) Development of in vitro slow growth culture for yam (Dioscorea alata L.) Annals of Tropical Research, 34(1), pp 79 - 95 Ahuja, S., Mandal, B B., Dixit, S., & Srivastava, P S (2002) Molecular, phenotypic and biosynthetic stability in Dioscorea floribunda plants derived from cryopreserved shoot tips Plant Science, 163(5), pp 971 - 977 Binay, B M (2002) Molecular, phenotypic and biosynthetic stability in Dioscorea floribunda plants derived from cryopreserved shoot tips pp 329 - 336 Chen, Y., Fan, J., Yi, F., Luo, Z., & Fu, Y (2003) Rapid clonal propagation of Dioscorea zingiberensis Plant cell, tissue and organ culture, 73(1), pp 75 - 80 Das, S., Choudhury, M D., & Mazumder, P B (2013) In vitro propagation of genus Dioscorea–a critical review Asian J Pharm Clin Res, 6(Suppl 3), pp 26 - 30 Díaz Narváez, L C., Carmona Wilches, O E., & Beltrán Herrera, J D (2015) Optimization of in vitro conservation of Dioscorea spp germplasm by minimal growth Revista Colombiana de Biotecnología, 17(1), pp 32 - 39 EzeibeEkwe, I O., Ezenwaka, C L., Mbagwu, F N., & Unamba, C N (2009) Effects of Combination of Different Levels of Auxin (NAA) and Cytokinin (BA) on 46 in vitro Propagation of Dioscorea rotundata L (White Yam) Journal of Molecular Genetics, 1(2 - 4), pp 18 - 22 Jain, M., & Ishii, K (2012) Micropropagation of woody trees and fruits (Vol 75) Springer Science & Business Media Jean, M., & Cappadocia, M (1992) Effects of some growth regulators on in vitro tuberization in Dioscorea alata L.‘Brazo fuerte’ and D abyssinica Hoch Plant cell reports, 11(1), pp 34 - 38 10 Jova, M C., Kosky, R G., & Cuellar, E E (2011) Effect of liquid media culture systems on yam plant growth (Dioscorea alata L.'Pacala Duclos') Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement, 15(4), p 515 11 Malaurie, B., Trouslot, M F., Berthaud, J., Bousalem, M., Pinel, A., & Dubern, J (1998) Medium-term and long-term in vitro conservation and safe international exchange of yam (Dioscorea spp.) germplasm Electronic Journal of Biotechnology, 1(3), pp 26 - 27 12 Poornima, G N., & Ravishankar, R (2007) In vitro propagation of wild yams, Dioscorea oppositifolia (Linn) and Dioscorea pentaphylla (Linn) African Journal of Biotechnology, 6(20), pp 2348 - 2352 13 Poornima, G N., & Ravishankar, R V (2007) In vitro propagation of wild yams, Dioscorea oppositifolia (Linn) and Dioscorea pentaphylla (Linn) African Journal of Biotechnology, 6(20) 14 Zhang, Z., Sa, W., & Liu, J (1998) Micropropagation and Microtuberization of Dioscorea collettii Hook F Biotechnology, 8(1), pp 18 - 20 47 PHỤ LỤC  Quy trình nhân giống in vitro Hồi Sơn (giai đoạn 1) Sơ đồ quy trình Đoạn thân Hoài Sơn mang chồi ngủ Khử trùng tạo nguồn mẫu ban đầu: sodium hypoclorite 2,5% 7,5 phút sau sodium hypoclorite 1,75% phút Mơi trường cảm ứng tạo chồi từ mắt ngủ: MS + BAP 0,2 mg/L + Kinetin 1,0 mg/L Môi trường nhân nhanh cụm chồi: MS + Kinetin 1,5 mg/L + NAA 0,2 mg/L ni cấy lỏng lắc Diễn giải quy trình Bước (Khử trùng mẫu cấy): Đoạn thân non Hoài Sơn có mang chồi ngủ làm xơ xà phòng rửa vòi nước chảy 10 phút để loại bỏ đất chất bám bề mặt Mẫu đưa vào tủ cấy, khử trùng cồn 70o 30 giây, rửa lại nước cất vơ trùng lần Sau lắc dung dịch sodium hypoclorite 2,5% 7,5 phút sau sodium hypoclorite 1,75% phút Tween 80, rửa lại nước cất vô trùng (3 – lần) Mẫu sau khử trùng cắt thành đoạn nhỏ chứa mắt ngủ đặt môi trường MS Mẫu theo dõi tuần Phịng Hỗ trợ cơng nghệ tế bào thực vật Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao nhiệt độ 25oC, chiếu sáng 12 vii Bước (Cảm ứng tạo cụm chồi từ chồi ngủ): Mẫu sau khử trùng bước đặt môi trường MS + BAP 0,2 mg/L + Kinetin mg/L Điều kiện nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 14h, cường độ chiếu sáng 2000 lux Bước (Cảm ứng tạo cụm chồi in vitro): Cụm chồi Hoài Sơn in vitro tách thành cụm nhỏ cấy chuyển qua môi trường MS + Kinetin 1,5 mg/L + NAA 0,2 mg/L Được nuôi cấy lỏng lắc với tốc độ máy lắc 60 vịng/phút Điều kiện ni cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 14h, cường độ chiếu sáng 2000 lux viii PHỤ LỤC Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thời gian khử trùng Javel mẫu đoạn thân Hoài Sơn mang mắt ngủ + Tỉ lệ mẫu nhiễm The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 7029.583333 1405.916667 28.37 0.0004 297.333333 49.555556 7326.916667 R-Square Coeff Var Root MSE Y Mean 0.959419 16.21398 7.039571 43.41667 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F Rep 76.916667 25.638889 0.52 0.6855 T 6952.666667 3476.333333 70.15 F F