Xây dựng quy trình nhân giống in vitro sen đá Kim cương (Haworthia cooperi var. Truncata) từ giai đoạn khử trùng đến tạo cây con hoàn chỉnh

Bài viết Xây dựng quy trình nhân giống in vitro sen đá Kim cương (Haworthia cooperi var. Truncata) từ giai đoạn khử trùng đến tạo cây con hoàn chỉnh trình bày khảo sát ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 đến quá trình khử trùng mẫu cấy; Cảm ứng tạo mô sẹo; Phát sinh chồi từ mô sẹo; Tạo cây con hoàn chỉnh;...

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO SEN ĐÁ KIM CƯƠNG (HAWORTHIA COOPERI VAR TRUNCATA) TỪ GIAI ĐOẠN KHỬ TRÙNG ĐẾN TẠO CÂY CON HOÀN CHỈNH Phan Thị Linh, Ngô Nhựt Khương Nguyễn Hữu Kiên* Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh GVHD:: TS Trịnh Thị Lan Anh TĨM TẮT Sen đá Kim Cương (Haworthia cooperi var Truncata) hay gọi thực vật mọng nước thuộc họ Asphodelaceae Sen đá Kim Cương khơng đẹp mà lồi đem đến may mắn, tài lộc, hạnh phúc Sen đá nhân giống phương pháp truyền thống đáp ứng nhu cầu thị trường Vì vậy, điều cần thiết phải xây dựng quy trình nhân giống phù hợp tạo nguồn mẫu in vitro bệnh, tăng sinh mô, nhân chồi rễ tạo hoàn chỉnh để cung cấp giống sen đá Kim cương đáp ứng nhu cầu chất lượng số lượng Kết nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống hồn chỉnh từ giai đoạn khử trùng đến tạo hồn chỉnh Q trình khử trùng mẫu với chất khử trùng HgCl2 tốt nồng độ 0,100% có bổ sung Tween-20 phút Tỷ lệ tạo mô sẹo tốt môi trường MS bổ sung 1,00 mg/L BA kết hợp 0,100 mg/L NAA; tạo chồi hiệu môi trường bổ sung 2,00 mg/L BA; rễ tạo hoàn chỉnh tối ưu bổ sung 0,05 mg/L NAA vào môi trường nuôi cấy Từ khóa: khử trùng, nhân giống, mơ sẹo, sen đá Kim Cương (Haworthia cooperi var Truncata), tạo hoàn chỉnh ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, nhu cầu trồng xanh để trang trí nhà ngày tăng Một loại ưa thích sen đá hình dáng, màu sắc, kiểu dáng đẹp, có nhiều chủng loại màu sắc đa dạng đặc tính dễ trồng, khơng tốn nhiều thời gian chăm sóc Các lồi thuộc chi Haworthia trồng thương mại làm vật trang trí số lồi q có giá trị kinh tế cao thị trường bán lẻ tốc độ tăng trưởng chậm khó nhân giống (Chen et al., 2019) Thông thường sen đá nhân giống phương pháp truyền thống tách con, hủy đỉnh, nhân giống nhân giống hạt phương pháp tỷ lệ nảy mầm chưa cao (Bayer, 1982); (Pilbeam, 1983) đáp ứng nhu cầu thị trường số lượng chất lượng giống (Chen et al., 2019) Các phương pháp phụ thuộc nhiều vào yếu tố mơi trường (khí hậu, độ ẩm, nhiệt độ, ánh sáng,…) thời gian để hồn tồn tự phát triển khỏe mạnh lâu (Rogers, 1993); (Richwine et al., 1995); (Chen et al., 2019) Vì lý việc nhân giống in vitro sen đá Kim Cương nói riêng lồi khác thuộc chi sen đá nói chung cần thiết Phương pháp nhân giống in vitro khắc phục hầu hết khó khan nhân giống truyền thống; không bị ảnh hưởng yếu tố môi trường, tạo khỏe mạnh, không hạn 514 chế số lượng, giúp có khả thích nghi với mơi trường bên ngồi, đáp ứng nhu cầu chất lựng số lượng thị trường VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Cây sen đá Kim Cương mua từ trại sen đá thành phố Lựa chọn khỏe mạnh, khơng có sâu bệnh, thời kỳ phát triển tốt nhất, phát triển đầy đủ, khỏe mạnh khơng có dấu hiệu bị sốc nhiệt Để hạn chế tối thiểu khả nhiễm nấm, tiến hành để phịng kín, tưới nước đầy đủ phun thuốc trị nấm (dạng phun sương) lần/ tuần trước vào mẫu khoảng tuần 2.2 Phương pháp Mẫu lựa chọn bánh tẻ Sử dụng mũi dao số 11 khử trùng cắt sát gốc; lưu ý: không dùng tay để bẻ để giảm tổn thương cho mẫu, mang bao tay y tế cầm mẫu để giảm khả nhiễm cho mẫu Dùng khăn giấy sạch, mềm thấm nhựa sau gói mẫu lại để nơi mát khoảng ngày cho vết thương khô lại Giai đoạn khử trùng ngồi tủ cấy, khơ vết thương tiến hành rửa xà phịng lỗng, xoa nhẹ hai bề mặt Tiếp theo, lắc mẫu phút với dung dịch Javel nồng độ – 7%, rửa lại nước lần Sau đó, cho mẫu chạy động lực học vòi nước nước khoảng 30 phút, dùng kẹp gắp mẫu vào bình erlen hấp khử trùng đưa vào tủ cấy vô trùng Trước đưa mẫu vào tủ cấy, tủ phải vệ sinh cồn 70 độ, bật UV khoảng 15 – 30 phút khử trùng tủ thêm lần cồn 70 độ để đảm bảo tủ cấy khuẩn tuyệt đối Các thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Môi trường sử dụng thí nghiệm mơi trường MS (Murashige Shoog, 1962), tùy vào giai đoạn nuôi cấy mà hóa chất khác nhau, chất điều hịa sinh trưởng khác sử dụng riêng lẻ kết hợp Các tiêu theo dõi tiến hành theo phương pháp nghiên cứu sinh học thông dụng: tỷ lệ nhiễm chết mẫu (%), tỷ lệ sống sót (%), tỷ lệ tạo mô sẹo (%), tỷ lệ tạo chồi (%), tỷ lệ rễ, đặc điểm 2.3 Thống kê xử lý số liệu Số liệu sau thu thập ứng với tiêu theo dõi xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010® Statgraphics centurion 19; phân tích phương sai (ANOVA), với P ≤ 0,05 2.4 Bố trí thí nghiệm 2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng chất khử trùng HgCl2 đến trình khử trùng mẫu cấy Chất khử trùng HgCl2 khảo sát nồng độ 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 0,125% giai đoạn khử trùng mẫu tủ cấy Mẫu khử trùng cồn 70 độ 30 giây, rửa lại nước cất vô trùng – lần; sau đó, mẫu tiếp tục khử trùng HgCl2 bổ sung 0,05% Tween-20 phút, sau rửa nước cất vô trùng từ – lần làm khô giấy lọc tiệt trùng (Boling et al., 2017) 515 Mẫu sau khử trùng, dùng dao cắt bỏ lớp mỏng phần cuống bị tổn thương Sau đó, cấy mẫu (khơng cắt nhỏ) lên mặt thạch mơi trường, phần cuống vị trí mặt cắt cắm nhẹ vào môi trường Môi trường nuôi cấy MS bổ sung sucrose 3% (w/v) làm đặc agar 0,7% (w/v) pH môi trường điều chỉnh đến 5,8 NaOH 0,1 M HCl 0,1 M Bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật trước điều chỉnh pH khử trùng Môi trường hấp khử trùng 121oC 20 phút Tất mẫu cấy nuôi 24 ± 1oC chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017) Thu kết sau 12 tuần nuôi cấy 2.4.2 Cảm ứng tạo mô sẹo Các mẫu cấy sau khử trùng cấy vào môi trường cảm ứng tạo mô sẹo Môi trường nuôi cấy bao gồm: môi trường MS bản, bổ sung BA thay đổi (0,25; 0,50; 1,00 1,25 mg/L BA) kết hợp với thay đổi nồng độ NAA (0,05; 0,075; 0,1 0,125 mg/L NAA) Mẫu nuôi cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng: 1500 – 2000 lux, chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017) thu kết sau 12 tuần nuôi cấy 2.4.3 Phát sinh chồi từ mô sẹo Mẫu mô sẹo cấy vào môi trường sử dụng MS làm môi trường bản, bổ sung 3% sucrose, 0,7% agar BA nồng độ khác (0,10; 0,15, 0,20; 0,25 mg/L), pH 5,8 Mẫu ni cấy phịng ni cấy nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux, chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017) thu kết sau tuần ni cấy 2.4.4 Tạo hồn chỉnh Các chồi dài (chiều dài – 1,5 cm) cấy môi trường MS bổ sung NAA thay đổi (0,000; 0,025; 0,050; 0,075 mg/L) NAA cho hình thành rễ Mẫu cấy ni phịng nhiệt độ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng: 2000 – 3000 lux, chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày (Boling et al., 2017) thu kết sau tuần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng HgCl2 việc khử trùng mẫu Sau 12 tuần nuôi cấy, thu kết trình bày bảng Bảng 1: Ảnh hưởng HgCl2 đến trình khử trùng mẫu Nồng độ (%) Tỷ lệ nhiễm chết mẫu (%) Tỷ lệ sống sót (%) 0,025 80,1a 19,9e* 0,050 64,4b 35,6d 0,075 50,3c 49,7c 516 0,100 11,9e 88,1a 0,125 29,7d 70,3b *Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Từ kết thu bảng 1, cho thấy khử trùng mẫu HgCl2 nồng độ 0,100% cho kết tốt (hình 1), kết tương tự với kết quy trình vào mẫu sen đá báo cáo (Boling et al., 2017) Vì vậy, vào mẫu sen đá Kim cương sử dụng HgCl2 nồng độ 0,100% 3.2 Cảm ứng tạo mô sẹo Sau tuần ni cấy, thu kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng BA NAA dến khả cảm ứng tạo mô sẹo BA (mg/L) NAA (mg/L) Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) 0,25 0,050 1,1h* 0,25 0,075 5,0h 0,25 0,100 13,3g 0,25 0,125 20,2g 0,50 0,050 44,3fg 0,50 0,075 52,2f 0,50 0,100 60,4ef 0,50 0,125 66,7e 1,00 0,050 75,3c 1,00 0,075 80,1b 1,00 0,100 90,1a 1,00 0,125 87,2b 1,25 0,050 83,1bc 517 1,25 0,075 79,0c 1,25 0,100 75,2c 1,25 0,125 71,0d *Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Ảnh hưởng BA NAA đến khả cảm ứng tạo mô sẹo bảng 2, cho thấy có tương tác chất điều hòa sinh trưởng thực vật BA NAA mẫu cấy sen đá Kim cương; nồng độ 1,00 mg/L BA kết hợp với 0,100 mg/L NAA cho kết tạo mơ sẹo nhiều tốt (hình 2), kết tương tự với kết nghiên cứu sen đá báo cáo (Wang et al., 2017; Chen et al., 2019) Nhưng khác với nghiên cứu của Boling cộng (2017), kết cho thấy nuôi cấy mô sẹo môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L BA 0,2 mg/L 2,4-D cho kết tạo mô sẹo tối ưu đối tượng sen đá 3.3 Phát sinh chồi từ mô sẹo Sau tuần nuôi cấy, thu kết trình bày bảng Bảng 3: Ảnh hưởng BA đến trình tạo chồi BA (mg/L) Tỷ lệ tạo chồi (%) 0,10 58,3c* 0,15 75,1b 0,20 80,5a 0,25 75,5b *Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Từ kết thu bảng cho thấy bổ sung BA 0,20 mg/L cho số lượng, hình thái, màu sắc chồi tốt Kết tương đồng với nghiên cứu Chen cộng (2019) 3.4 Tạo hồn chỉnh Sau tuần ni cấy, thu kết trình bày bảng Bảng 4: Ảnh hưởng NAA đến trình rễ tạo hoàn chỉnh Nồng độ (mg/L) Tỷ lệ rễ (%) 0,000 0,0d* 518 0,025 58,1c 0,050 79,3a 0,075 70,2b *Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p < 0,05 Ra rễ tạo hoàn chỉnh giai đoạn quan trọng nhân giống in vitro, rễ phải khỏe mạnh phát triển đầy đủ đưa vườn ươm Kết khảo sát nồng độ NAA bổ sung vào môi trường rễ sau tuần nuôi cấy cho thấy, nồng độ 0,050 mg/L cho kết rễ phát triển tốt (hình 3) Hình 1: Chồi phát sinh mô sẹo mẫu cấy sen đá Kim Cương sau tiến hành khử trùng với HgCl2 nồng độ 0,100%, sau 12 tuần ni cấy 519 Hình 2: Mô sẹo phát sinh chồi từ mô sẹo sen đá Kim Cương bổ sung 1,00 mg/L BA kết hợp với 0,10 mg/L NAA sau tuần ni cấy Hình 3: Sự rễ tạo hồn chỉnh sen đá Kim Cương mơi trường bổ sung 0,050 mg/L NAA sau tuần nuôi cấy Kết luận Quá trình khử trùng mẫu HgCl2 cho thấy nồng độ 0,100% thích hợp cho khử trùng mâu cấy sen đá Kim cương Quá trình cảm ứng tạo mơ sẹo, cho thấy kết hợp 1,00 mg/L, BA với 0,10 mg/L NAA cho khả tạo mô sẹo tốt Cảm ứng tạo chồi mẫu mô sẹo sen đá Kim Cương với nồng độ BA 2,0 mg/L cho tỷ lệ bật chồi cao chồi phát triển tốt Giai đoạn cuối cùng, tạo hoàn chỉnh với nồng độ 0,050 mg/L NAA rễ phát triển tốt Các kết nghiên cứu sử dụng 520 nhân giống in vitro sen đá Kim Cương nói riêng lồi sen đá nói chung Tuy nhiên, loài cụ thể cần nhiên cứu thêm để đạt kết tốt rút ngắn thời gian nhân nhanh phục vụ giống chất lượng cao cho nhu cầu thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bayer M.B (1982) The new Haworthia handbook Cape and Transvaal Printers, Capetown [2] Boling L., Hongzhou F., Chaorong M., Ming C., Qingdong C (2017) Establishment of a Rapid and Effificient Micropropagation System for Succulent Plant Haworthia turgida Haw Hortscience, 52 (9): 1278-1282 [3] Murashige T., Skoog F.A (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures Physiol Plant, Compenhagem, 15:473-479 [4] Ogihara Y., K Tsunewaki (1978) Tissue culture in Haworthia I Effects of auxins and kinetin on callus growth Bot Mag Tokyo, 91:83-91 [5] Ogihara Y (1979) Tissue culture in Haworthia II Effects of three auxins and kinetin on greening and redifferentiation of calluses Bot Mag Tokyo, 92:163-171 [6] Pilbeam J (1983) Haworthia and Astroloba: a collector’s guide B.T Batsford, London [7] Richwine A.M., Tipton J.L., Thompson G.A (1995) Establishment of Aloe, Gasteria, and Haworthia shoot cultures from inforescence explants Hortscience, 30:1443-1444 [8] Rogers S.M.D (1993) Optimization of plant regeneration and rooting from leaf explants of fve rare Haworthia Sci Hortic, 56:157-161 [9] Wang Y., Mu H., Yongping L.V., Li H., Wang Y., Chen J (2017) In vitro plant regeneration and tissue culture industrialized proliferation of Shoujin Acta Botany Chinese Bulletin of Botany, 52 (3): 331-336 [10] Yen-Ming C., Jian-Zhi H., Ting-Wen H., Chun P (2019) Efects of light intensity and plant growth regulators on callus proliferation and shoot regeneration in the ornamental succulent Haworthia Springer Botanical Studies, 60 (10): 1-8 521 ... rễ tạo hoàn chỉnh sen đá Kim Cương môi trường bổ sung 0,050 mg/L NAA sau tuần ni cấy Kết luận Q trình khử trùng mẫu HgCl2 cho thấy nồng độ 0,100% thích hợp cho khử trùng mâu cấy sen đá Kim cương. .. phát triển tốt Giai đoạn cuối cùng, tạo hoàn chỉnh với nồng độ 0,050 mg/L NAA rễ phát triển tốt Các kết nghiên cứu sử dụng 520 nhân giống in vitro sen đá Kim Cương nói riêng lồi sen đá nói chung... sát ảnh hưởng chất khử trùng HgCl2 đến trình khử trùng mẫu cấy Chất khử trùng HgCl2 khảo sát nồng độ 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 0,125% giai đoạn khử trùng mẫu tủ cấy Mẫu khử trùng cồn 70 độ 30