Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây mía tím Kim Tân

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho cây mía tím Kim Tân từ vật liệu ban đầu là mắt mầm. Môi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân là MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 500 mg/l THT + 7,0 g/l agar cho hệ số nhân cụm chồi là 4,30 cụm chồi/ mẫu/4 tuần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm.

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi, 2012 Từ điển thuốc Việt Nam, tập 1, trang 288 NXB Y học Phạm Tiến Dũng, 2008 Thiết kế thí nghiệm xử lý kết phần mềm thống kê IRRISTAT NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Lan, 2006 Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng NXB Nơng nghiệp Trung tâm Nghiên cứu Dược liệu Bắc Trung - Viện Dược liệu, 2013 Nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật trồng Cà gai leo (Solanum hainanense Hance) đạt suất, chất lượng cao tạo nguyên liệu làm thuốc Thanh Hóa Viện Dược Liệu, 2003 Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập + NXB Khoa học kỹ thuật Study on growing density and fertilizer doses for Solanum hainanense in Phu Tho province Nguyen Huu Thien, Nguyen Thi Hanh, Đinh Thi Thu Trang Abstract The study was carried out in Tam Nong - Phu Tho with the aim of providing the most appropriate density and fertilizer doses for Solanum hainanense cultivated on two main types of local agricultural lands (hilly land and riverside land) The results showed that: Density and fertilizer effected growth, development and yield of S hainanense in Phu Tho In particular, S hainanense grew and developed well and the yield was highest on both types of land when growing with density of 50,000 plants/ha, growing distance of 40 ˟ 50 cm The most appropriate fertilizer dose for S hainanense grown on riverside land was 20 tons of Manure + 180 kg N + 150 kg P2O5 + 125 kg K2O, the dried yield reached 4.35 tons/ha The most suitable fertilizer dose for S hainanense grown on hilly land was 20 tons of Manure + 220 kg N + 150 kg P2O5 + 125 kg K2O, the dried yield reached 4.03 ton/ha Keywords: Solanum hainanense, growing density, growing space, fertilizer dose Ngày nhận bài: 28/11/2018 Ngày phản biện: 9/12/2018 Người phản biện: TS Nguyễn Thế Yên Ngày duyệt đăng: 11/1/2019 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MÍA TÍM KIM TÂN Mai Thị Tân1, Vũ Thị Hồi1, Lê Thị Thu Hằng1 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho mía tím Kim Tân từ vật liệu ban đầu mắt mầm Mơi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 500 mg/l THT + 7,0 g/l agar cho hệ số nhân cụm chồi 4,30 cụm chồi/ mẫu/4 tuần chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm Trong đó, hệ số nhân chồi đạt cao 8,56 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 7,33 cm sau tuần nuôi cấy môi trường MS + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar + 500 mg/l THT bổ sung 0,75 mg/l BA 0,5 mg/l IBA Môi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 11,36 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 1,21 cm sau tuần nuôi cấy Giá thể tiếp nhận mía in vitro đất cho tỷ lệ sống sót 83,3% sau tuần, sinh trưởng khỏe mạnh, phát triển tốt Từ khóa: Mía, quy trình, nhân giống, in vitro I ĐẶT VẤN ĐỀ Mía tím Kim Tân (Saccharum officinarum) có nguồn gốc từ huyện Thạch Thành - Thanh Hóa, giống mía đặc sản tiếng vùng đất xứ Thanh Giống mía có đặc điểm thân màu tím trịn đều, mềm, Với ưu điểm nó, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam 56 giống mía tím Kim Tân trồng nhiều địa phương nước Hiện tại, phương pháp nhân giống hom phương pháp nhân giống chủ yếu cho giống mía tím Kim Tân Bên cạnh giống mía tím Kim Tân canh tác thời gian dài với tình trạng khơng kiểm sốt nguồn giống ban Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 đầu dễ dẫn đến giống bị hỗn tạp, bị nhiễm lây lan bệnh, dễ bị già sinh lý gây thối hóa giống Vì vậy, để góp phần bảo tồn, phục tráng giống mía tím Kim Tân phục vụ sản xuất hàng hóa, mang lại hiệu kinh tế cao, cần sử dụng tiến kỹ thuật nhân giống in vitro cho mía Các cơng trình nghiên cứu khẳng định sử dụng phương pháp nhân giống mía in vitro mang lại hiệu kinh tế phương pháp sử dụng phổ biến sản xuất mía quy mơ lớn Phương pháp cho phép nhân nhanh, tạo số lượng giống lớn thời gian ngắn đặc biệt giống có chất lượng tốt, đồng mặt di truyền, bệnh Tuy nhiên giống mía khác có phản ứng với điều kiện mơi trường nuôi cấy khác (Mulugeta et al., 2018) Do đó, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho mía tím Kim Tân nhằm góp phần tạo giống đồng có chất lượng cao cho sản xuất cần thiết II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Cây mía tím Kim Tân lấy vườn thí nghiệm thu thập mẫu thuộc xã Thành Trực, huyện Thạch Thành, tỉnh Thanh Hóa Mơi trường ni cấy sử dụng môi trường MS 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp chọn mẫu mía Thời điểm lấy mẫu mía tháng tuổi, mía có nhiều đặc tính khơng bị sâu bệnh đổ ngã, đốt, lóng mía dài Lấy thời tiết khơng mưa, khơ tuần, chặt lấy phần trên, cách gốc khoảng 10 lóng Cắt hết tai xung quanh, buộc thành bó dựng ngược xuống để nước không đọng bẹ 2.2.2 Phương pháp khử trùng mẫu - Ngồi tủ cấy vơ trùng: Lau tồn mẫu cồn 70o, bóc già, lau phấn, cắt phần dài bẹ mía Lau mẫu nước cất sạch, sau lau lại cồn cho vào tủ cấy - Trong tủ cấy cấy vơ trùng: Dùng tay bóc lớp bẹ, bóc khơng cho tay qua mẫu, bóc hết lớp bẹ bao bọc bên Dùng dao cắt mắt ˟ cm cắt đỉnh sinh trưởng cấy vào môi trường MS + mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + g/l agar để khởi động tạo vật liệu ban đầu 2.2.3 Nội dung nghiên cứu - Giai đoạn lựa chọn chồi vào mẫu: mắt ngủ đỉnh sinh trưởng tái sinh môi trường MS + mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + g/l agar sau khoảng - tuần; chồi trải qua lần cấy chuyển, sau khoảng - tháng chồi hình thành cụm chồi nhỏ, cụm chồi sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho giai đoạn nhân nhanh chồi mía in vitro - Giai đoạn nhân nhanh chồi mía: Chồi mía sau giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu tạo cụm chồi, gồm - chồi đơn nhỏ phát triển tốt sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm nhân nhanh Mơi trường thí nghiệm có bổ sung chất điều tiết BA, Kinetin, BA kết hợp Kinetin BA kết hợp với IBA nồng độ khác - Giai đoạn tạo hồn chỉnh: Các chồi mía in vitro cao - cm, xanh, phát triển tốt cấy chuyển mơi trường có α-NAA với nồng độ từ 0; 0,25; 0,5; 0,75 1,0 mg/l để kích thích rễ Tất mơi trường ni cấy in vitro có thành phần gồm MS + 30 g/l sucrose + 7,0 g/l agar + 500mg/l THT điều chỉnh pH = 5,8 trước hấp khử trùng áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 121oC 20 phút Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16 h sáng/8 h tối, cường độ ánh sáng 2.000 - 2.500 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC Trước bố trí thí nghiệm cấy chuyển mẫu mơi trường MS + 30 g/l đường + g/l agar tuần để mẫu không bị ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng - Giai đoạn thích ứng tự nhiên: Tiêu chuẩn vườn ươm phát triển tốt cao - 10 cm, xanh tốt - lá, rễ khỏe mạnh, số rễ trung bình khoảng 10 - 11 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình 1,1 - 1,2 cm Huấn luyện cây: Thí nghiệm in vitro tiến hành vào tháng - nhiệt độ cao, nắng nhiều Trước in vitro, bình in vitro mang vườn ươm trước - ngày để tập nắng, cho quen với điều kiện ánh sáng, nhiệt độ bên Cây che lưới đen, ngày tưới lần vào sáng sớm chiều tối, sau khoảng tuần bỏ lưới che Chuẩn bị giá thể: Cát lọc rác bẩn, phơi khô, khử trùng; giá thể đất lấy trực tiếp vườn thí nghiệm trồng mẫu mía huyện Thạch Thành, Thanh Hóa; đất tán nhỏ; giá thể đất:cát trộn với tỉ lệ : 57 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý số liệu Các thí nghiệm phịng bố trí nhắc lại lần cơng thức, 10 bình/nhắc lại/cơng thức, bình cấy mẫu Các tiêu theo dõi quan sát đo đếm sau tuần thí nghiệm nhân nhanh rễ Thí nghiệm ngồi vườn ươm bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ, công thức nhắc lại lần, lần 30 mẫu, theo dõi sau tháng Số liệu xử lý thống kê theo chương trình Excel IRRISTAT 4.0 2.2.5 Các tiêu theo dõi Hệ số nhân (chồi/mẫu) = ∑ số chồi tạo thành/ ∑ số mẫu nuôi cấy; Chiều cao chồi (cm) = ∑ chiều cao chồi/∑ số mẫu ni cấy; Tỉ lệ hình thành chồi (%) = ∑ số chồi/∑ số mẫu cấy; Tỉ lệ hình thành rễ (%) = Số sống/Tổng số đưa trồng; Số rễ (rễ/mẫu) = ∑ số rễ/∑ số mẫu; Chiều dài rễ (cm) = ∑ chiều dài rễ/∑ số mẫu nuôi cấy; Tỉ lệ sống (%) = ∑ sống/∑ đưa trồng Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống mía tím Kim Tân phương pháp nuôi cấy in vitro 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm tiến hành từ tháng 11/2016 đến tháng 11/2017 Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu in vitro Để tiến hành xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu tiền đề quan trọng để định thành công nghiên cứu Một số kết nghiên cứu cho thấy nồng độ BA cao mơi trường ni cấy có hiệu 58 tốt việc vào mẫu mía giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía VN84-4137 cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật nhóm tác giả Lê Phi Long Phan Thị Thu Hiền (2013) cho thấy sử dụng mơi trường vào mẫu mía từ đỉnh sinh trưởng MS + 10 g/l agar + 20 g/l đường + mg/l BA Hơn nữa, từ kết thăm dị số mơi trường tái sinh chồi từ mắt mầm đỉnh sinh trưởng, môi trường MS + mg/l BA + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + 30 g/l đường + g/l agar sử dụng để tạo vật liệu khởi đầu hai loại vật liệu mắt ngủ đỉnh sinh trưởng mía Kết quan sát minh họa Hình Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Mắt mầm tuần tuần tuần Hình Sự phát triển chồi mía sau vào mẫu Khi vào mẫu hai nguồn vật liệu kết cho thấy hai vật liệu mắt ngủ đỉnh sinh trưởng mía phát sinh chồi sau - tuần Tuy nhiên, chồi chưa tận dụng để làm vật liệu khởi đầu cho trình nhân nhanh Các chồi trải qua - lần cấy chuyển, sau khoảng - tháng chồi hình thành cụm chồi nhỏ, cụm chồi sử dụng làm vật liệu khởi đầu Mặt khác, vật liệu đỉnh sinh trưởng ít, số lượng mắt mầm mía nhiều Trên sở mắt mầm mía lựa chọn nguồn vật liệu thích hợp để tạo vật liệu khởi đầu cho quy trình nhân nhanh 3.2 Giai đoạn nhân chồi mía in vitro 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro BA chất điều tiết sinh trưởng có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng mô phân sinh làm hạn chế già hóa tế bào Trong nhân giống in vitro, BA có vai trị đặc biệt quan trọng việc kích thích hình thành chồi non, định hệ số nhân chất lượng chồi (Hoàng Minh Tấn ctv., 2006) Bảng Ảnh hưởng BA đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro sau tuần CTTD CT CT1 (ĐC) CT2 CT3 CT4 CT5 LSD0,05 CV (%) BA (mg/l) 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 HSN Chiều (cụm cao TB chồi/mẫu) (cm) 2,00 1,12 3,67 1,36 4,30 1,64 3,00 1,52 2,30 1,32 0,16 0,24 2,70 1,60 Nhận xét + ++ +++ ++ ++ Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT+ g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, chồi mập, hệ số nhân chồi cao Qua kết thu bảng cho thấy: BA có tác dụng tích cực việc nhân nhanh mía tím Kim Tân ni cấy in vitro Các cơng thức có bổ sung BA cho hệ số nhân đạt 2,3 cụm chồi/mẫu, cao so với công thức đối chứng không bổ sung BA (2,0 cụm chồi/mẫu) Trong cơng thức có bổ sung BA, hệ số nhân đạt cao cơng thức có bổ sung 0,5 mg/l BA (4,3 cụm chồi/mẫu), sau giảm dần xuống cơng thức có bổ sung 0,75 - 1,0 mg/l BA tương ứng 3,0 2,3 cụm chồi/mẫu Các cụm chồi phát triển tốt, cụm chồi lại có chồi đơn sinh trưởng mạnh, phát triển thành cụm nên chiều cao trung bình thấp dao động từ 1,12 - 1,64 cm Kết thu có khác biệt số kết công bố trước đâycho nồng độ BA cao thích hợp nhân nhanh mía Điển cơng bố nhóm tác giả Hà Thị Thúy cộng tác viên (2013) môi trường nhân nhanh tốt mía MS bổ sung 1,5 mg/l BA cho hệ số nhân chồi lần Như vậy, công thức cho hệ số nhân chồi cao công thức 3: MS + 0,5 mg/l BA + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT+ g/l agar với hệ số nhân đạt 4,30 cụm chồi/mẫu, chiều cao trung bình cụm chồi 1,64 cm 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro Bên cạnh BA, Kinetin có ảnh hưởng tích cực đến khả nhân nhanh chồi số trồng Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng Kinetin đến sinh trưởng hệ số nhân chồi lại có đặc trưng riêng Các cụm chồi cấy mơi trường có bổ sung Kinetin với nồng độ thay đổi từ - 1,0 mg/l Kết nghiên cứu thể bảng 59 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro sau tuần CTTD CT Kinetin (mg/l) HSN Chiều (Cụm cao TB chồi/mẫu) (cm) Nhận xét CT1(ĐC) 0,00 2,00 1,12 + CT2 0,25 2,67 1,83 + CT3 0,50 3,20 2,17 +++ CT4 0,75 2,10 1,72 ++ CT5 LSD0.05 CV% 1,00 1,67 0,16 3,50 1,53 0,54 1,70 + Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose +500 mg/l THT+ g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, chồi mập, hệ số nhân chồi cao Qua kết thu bảng cho thấy: Tương tự BA, Kinetin có tác dụng việc nhân nhanh mía ni cấy in vitro Tuy nhiên, hệ số nhân thấp, chồi đơn lẻ cụm chồi có xu hướng phát triển mạnh chiều cao số Trong công thức thí nghiệm có bổ sung Kinetin, hệ số nhân đạt cao (3,20 cụm chồi/mẫu) mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin Khi nồng độ Kinetin tăng lên hệ số nhân chồi chiều cao chồi có xu hướng giảm Như vậy, Kinetin có tác dụng nhân chồi mía Kim Tân nồng độ thấp (0,5 mg/l Kinetin), 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng BA, Kinetin nước dừa đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro Một số kết nghiên cứu kết hợp BA, Kinetin nước dừa thích hợp cho nhân nhanh chồi mía (Hà Thị Thúy ctv., 2000) Hơn nữa, BA Kinetin nồng độ 0,5 mg/l thích hợp việc nhân nhanh giống mía tím Kim Tân Trên sở đó, thí nghiệm nước dừa sử dụng mơi trường có bổ sung BA, Kinetin nồng độ 0,5 mg/l kết hợp với việc bổ sung nước dừa nồng độ 0%; 5%; 10%; 15% nhằm xác định nồng độ nước dừa có hiệu việc tăng hệ số nhân chồi, chất lượng chồi sinh trưởng mía in vitro Thí nghiệm sau tuần ni cấy thể bảng Bảng Ảnh hưởng nước dừa đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro sau tuần CTTD CT CT1(ĐC) CT2 CT3 CT4 LSD0,05 CV (%) Nước dừa (%) 0,0 5,0 10 15 HSN Chiều (cụm cao TB chồi/mẫu) (cm) 3,56 1,38 5,33 1,51 6,30 2,00 4,30 1,48 0,29 0,38 3,30 1,30 ++ +++ +++ ++ Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT + g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, chồi mập, hệ số nhân chồi cao Kết cho thấy kết hợp BA, Kinetin nước dừa có ảnh hưởng đến nhân nhanh chồi mía tím Kim Tân Hệ số nhân chồi chiều cao chất lượng chồi tăng lên đáng kể kết hợp BA, Kinetin nước dừa Ở tất cơng thức có bổ sung nước dừa hệ số nhân chồi chiều cao chồi cao so với đối chứng Hệ số nhân chồi đạt cao 6,30 cụm chồi/mẫu nồng độ nước dừa 10% Tại nồng độ nước dừa cụm chồi có chiều cao trung bình xanh, mập, chất lượng chồi tốt Ở nồng độ nước dừa 15% hệ số nhân chồi, chiều cao chồi giảm Điều chứng tỏ việc nồng độ nước dừa cao bổ sung vào môi trường nuôi cấy khơng thích hợp cho việc nhân chồi mía tím Kim Tân Hình Chồi mía in vitro mơi trường có bổ sung nước dừa sau tuần 60 Nhận xét Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Như vậy, công thức nhân cụm chồi tốt là: MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 500 mg/l THT + 30 g/l đường+ g/l agar 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro Trong giai đoạn nhân cụm chồi, hệ số nhân thu thí nghiệm cao, nhiên chồi có chiều cao trung bình dao động khoảng cm Với chiều cao chồi thấp không đáp ứng tiêu chuẩn bố trí thí nghiệm rễ tạo hồn chỉnh Trên sở đó, cụm chồi tiếp tục sử dụng để bố trí thí nghiệm nhằm tăng hệ số nhân chất lượng chồi Trong thí nghiệm này, cụm chồi gồm - chồi đơn, chiều cao trung bình từ - cm sử dụng để bố trí thí nghiệm tăng hệ số nhân chất lượng chồi Trong thí nghiệm nồng độ BA từ 0,25 - 0,75 mg/l kết hợp với nồng độ IBA từ 0,1 - 0,3 mg/l sử dụng Kết sau tuần nuôi cấy thể bảng Bảng Ảnh hưởng BA IBA đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro CTTD HSN Chiều Hình chồi cao TB thái (chồi/ chồi chồi CT mẫu) (cm) CT1 (ĐC) 6,19 7,23 +++ CT2 0,25 5,56 7,66 ++ CT3 0,5 0,1 6,1 7,89 +++ CT4 0,75 8,56 7,33 +++ CT5 0,25 4,89 7,4 + CT6 0,5 0,2 6,89 7,12 ++ CT7 0,75 6,67 7,29 ++ CT8 0,25 4,78 6,38 + CT9 0,5 0,3 6,23 7,17 +++ CT10 0,75 5,44 6,38 ++ 0,25 5,08 7,15 Nồng độ BA 0,5 6,41 7,39 0,75 6,89 7,00 0,1 6,74 7,63 Nồng độ 0,2 6,15 7,27 IBA 0,3 5,48 6,64     0,24 0,29   LSD0,05 (BA) 0,24 0,29 LSD0,05 (IBA) LSD0,05 (BA*IBA) 0,41 0,51 CV (%)     3,9 4,1   Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT + 10% nước dừa + g/l agar, pH = 5,8; +: cụm chồi nhỏ, thấp, xanh nhạt; ++: cụm chồi có chiều cao thấp trung bình, hệ số nhân chồi trung bình; +++: cụm chồi có chiều cao trung bình, chồi mập, hệ số nhân chồi cao Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) Qua bảng cho thấy việc bổ sung BA IBA có ảnh hưởng tốt đến khả nhân nhanh chồi mía in vitro, hệ số nhân chồi chiều cao chồi tăng lên đáng kể, cụ thể là: Khi kết hợp BA với IBA (ở nồng độ 0,1 mg/l) HSN chồi tăng tăng nồng độ BA Nồng độ BA mức 0,25 - 0,5 mg/l cho HSN chồi thấp công thức đối chứng 6,19 chồi/mẫu, nhiên mức độ chênh lệch không lớn Khi tăng nồng độ BA lên 0,75 mg/l HSN chồi đạt giá trị cao 8,56 chồi/ mẫu, chiều cao chồi đạt 7,33 cm, chồi mập, cao, xanh tốt Khi kết hợp BA với tăng nồng độ IBA lên 0,2 mg/l HSN chồi giảm, dao động từ 4,89 - 6,89 chồi/mẫu Khi kết hợp BA với 0,3 mg/l IBA HSN chồi tất công thức giảm đáng kể Điều chứng tỏ nồng độ IBA cao ức chế khả nhân nhanh chồi mía tím in vitro Vậy việc kết hợp BA IBA có tác động tới khả nhân nhanh chồi mía in vitro Mơi trường nhân nhanh tối ưu là: MS + 0,75 mg/l BA + 0,1 mg/l IBA + 10% nước dừa + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + g/l agar cho HSN chồi 8,56 chồi/ mẫu, chiều cao chồi đạt 7,33 cm chồi/mẫu, chất lượng chồi tốt, xanh tốt (Hình 3) 3.3 Nghiên cứu tạo hoàn chỉnh Sự phát triển khỏe mạnh hệ rễ nuôi cấy in vitro điều kiện thiết yếu cho phát triển tốt điều kiện nhà lưới đồng ruộng Trong số chất kích thích sinh trưởng α-NAA biết đến chất kích thích hình thành rễ Để xác định nồng độ thích hợp α-NAA bổ sung vào mơi trường, thí nghiệm tiến hành nhằm đánh giá ảnh hưởng α-NAA đến q trình hình thành rễ mía Kim Tân ni cấy in vitro Vật liệu thí nghiệm chồi đơn, cao từ - cm, phát triển tốt, tách từ cụm chồi nhân nhanh Kết thí nghiệm thể bảng Từ số liệu bảng thấy ảnh hưởng rõ rệt α-NAA đến rễ chồi mía Các cơng thức có bổ sung α-NAA cho tỉ lệ rễ 100%, rễ xuất sớm, chất lượng tốt Khi tăng nồng độ từ 0,25 mg/l đến 0,5 mg/l α-NAA số rễ/mẫu tăng từ 7,4 rễ/mẫu đến 11,9 rễ/mẫu Công thức cho số rễ/mẫu đạt giá trị cao quan sát nồng độ 0,5 mg/l α-NAA Tuy nhiên tăng nồng độ α-NAA lên 0,75 1,0 mg/l số rễ/mẫu chiều dài rễ có xu hướng giảm xuống Điều nhận thấy nồng độ cao α-NAA ức chế hình thành 61 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 rễ in vitro chồi mía Kết thí nghiệm thu tương ứng với kết số cơng bố trước nhóm tác giả Nguyễn Thị Lan Hương cộng tác viên (2011) Nhóm tác giả bổ sung 0,5 mg/l α-NAA vào môi trường nuôi cấy giúp rễ tốt Bên cạnh tác giả Hà Thị Thúy cộng tác viên (2013) nhận định mơi trường có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA thích hợp cho rễ in vitro giống ROC 26 BH1 Hình Chồi mía in vitro môi trường bổ sung BA IBA sau tuần Bảng Ảnh hưởng α-NAA đến khả rễ chồi mía in vitro sau tuần CTTD Nồng độ α-NAA CT (mg/l) CT1 (ĐC) 0,00 CT2 0,25 CT3 0,50 CT4 0,75 CT5 1,00 LSD0,05 CV (%) Tỉ lệ rễ (%) 90 100 100 100 100 Số rễ TB/ mẫu 7,10 7,40 11,90 8,60 7,20 0,34 2,20 Chiều dài rễ TB/ mẫu (cm) 1,40 1,00 1,21 0,78 0,59 0,75 3,30 Ghi chú: Nền môi trường: MS + 30 g/l succrose + 500 mg/l THT + g/l agar, pH = 5,8 Tóm lại mơi trường rễ tối ưu giống mía Kim Tân MS + 0,5 mg/l α-NAA + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + g/l agar, rễ xuất sớm, số rễ/ mẫu nhiều, chất lượng rễ tốt 62 3.4 Thích nghi ngồi vườn ươm Trước đưa vào sản xuất việc thích nghi vườn ươm để đảm bảo tỷ lệ sống cao, sinh trưởng phát triển tốt khâu quan trọng Nhằm hạn chế số lượng chết môi trường thay đổi đột ngột, thời gian cho thích ứng thích hợp - ngày Trong thí nghiệm mía in vitro có chiều cao từ - cm, có xanh sinh trưởng tốt, trồng trực tiếp giá thể khác nhau, đặt nhà lưới có che che bớt 50% ánh sáng Qua bảng cho thấy, giá thể khác tỷ lệ sống trạng thái khác Trên giá thể đất cho tỷ lệ mía sống cao đạt 83,3% Trên giá thể đất + cát với tỷ lệ : giá thể cát tỷ lệ sống đạt 70% - 73,3%, nhiên sinh trưởng hơn, nhanh bị úa vàng Do giá thể tốt để thích ứng ngồi vườm ươm giá thể đất, cho tỷ lệ sống sót cao nhất, sinh trưởng khỏe mạnh Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 1(98)/2019 Bảng Ảnh hưởng loại giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng mía tím Kim Tân ngồi vườn ươm CTTD CT 100% Cát ẩm 100% Đất Đất: cát (1:1) Số 90 90 90 Tỉ lệ sống (%) 73,3 83,3 70,0 Trạng thái ++ +++ + Ghi chú: +: Lá úa vàng nhanh, sinh trưởng kém; ++: có tượng úa vàng; +++: xanh tốt, sinh trưởng khỏe IV KẾT LUẬN Vật liệu khởi đầu phù hợp cho nhân giống in vitro mía tím Kim Tân mắt mầm Mơi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 500 mg/l THT + 7,0 g/l agar cho hệ số nhân cụm chồi 4,30 cụm chồi/mẫu/4 tuần chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm Mơi trường thích hợp cho nhân nhanh cụm chồi mía tím Kim Tân MS + 0,5 mg/l BA + 0,5 mg/l Kinetin + 10% nước dừa + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar Môi trường cho hệ số nhân chồi 6,30 cụm chồi/mẫu/4 tuần chiều cao trung bình chồi đạt 2,0 cm Trên mơi trường MS + 10% nước dừa + 30 g/l đường + 7,0 g/l agar + 500 mg/l THT bổ sung 0,75 mg/l BA 0,5 mg/l IBA cho hệ số nhân chồi đạt cao 8,56 chồi/mẫu, chiều cao trung bình chồi đạt 7,33 cm sau tuần nuôi cấy Môi trường thích hợp để tạo rễ cho chồi in vitro môi trường MS + 500 mg/l THT + 30 g/l đường + g/l agar có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA cho tỷ lệ chồi tạo rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 11,36 rễ/chồi, chiều dài rễ trung bình đạt 1,21 cm sau tuần ni cấy Giá thể tiếp nhận mía in vitro đất cho tỷ lệ sống sót 83,3% sau tuần, sinh trưởng khỏe mạnh, phát triển tốt TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Lan Hương, Nguyễn Kim Ngân, 2011 Vi nhân giống mía Saccharum officinarum L Luận văn tốt nghiệp Đại học Nông nghiệp Hà Nội Lê Phi Long, Phan Thị Thu Hiền, 2013 Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống mía VN84-4137 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật” Tạp chí KH&CN Nghệ An, số 4/2014, tr 1-5 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch Vũ Quang Sáng, 2006 Giáo trình sinh lý thực vật NXB Đại học Nông nghiệp Hà Nội Hà Thị Thuý, Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, 2000 Nghiên cứu nhân nhanh số giống mía ni cấy mơ callus non Tạp chí Nơng nghiệp Cơng nghệ thực phẩm, số 10.456 Hà Thị Thúy, Trần Thị Hạnh, Vũ Anh Tuấn, Đỗ Năng Vịnh, 2013 Nghiên cứu xây dựng phát triển quy trình sản xuất giống mía bệnh theo quy mô công nghiệp công nghệ tế bào Hội thảo quốc gia khoa học trồng lần thứ Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2013 Mulugeta Hailu, Meseret Chimdessa and Manikandan Muthswamy, 2018 In vitro propagation of selected sugarcane (Saccharum officinarum L.) varieties (C86-165 and C86-12) through shoot Apical Meristem Hort Agric 3(1): 1-7 Study on micropropagation of sugar cane variety “Kim Tan” Mai Thi Tan, Vu Thi Hoai, Le Thi Thu Hang Abstract This study was carried out in order to establish an in vitro micropropagation process of sugarcane “Kim Tan” from axillary bud After weeks, the highest values of shoot clusters proliferation (4.3 shoot clusters/explant; shoot length cm) was obtained on MS medium with 0.5 mg/l BA, 0.5 mg/l Kinetin, 10% coconut water, 30g/l sucrose and 500 mg/l activated charcoad The highest values of shoot multiplication (8.56 shootlets/shoot; shoot length 7.33 cm) was recorded on MS medium supplemented with 0.75 mg/l BA, 0.1 mg/l IBA, 10% coconut solution, 30g/l sucrose and 500 mg/l activated charcoad after weeks In vitro shoots were rooted on medium with 0.5 mg/l α-NAA, 500mg/l charcoal Maximum rooting percentages (100%) with 11.36 roots/shoot and mean length of roots per shoots (1.21 cm) were achieved after weeks The plantlets were successfully acclimated and well developed in soil substrate with a high survival (83.3%) Keywords: Sugarcane, process, micropropagation, in vitro Ngày nhận bài: 12/11/2018 Ngày phản biện: 9/12/2018 Người phản biện: TS Vũ Ngọc Thắng Ngày duyệt đăng: 11/1/2019 63 ... 2018) Do đó, nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho mía tím Kim Tân nhằm góp phần tạo giống đồng có chất lượng cao cho sản xuất cần thiết II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật... kỹ thuật nhân giống in vitro cho mía Các cơng trình nghiên cứu khẳng định sử dụng phương pháp nhân giống mía in vitro mang lại hiệu kinh tế phương pháp sử dụng phổ biến sản xuất mía quy mơ lớn... mg/l Kinetin Khi nồng độ Kinetin tăng lên hệ số nhân chồi chiều cao chồi có xu hướng giảm Như vậy, Kinetin có tác dụng nhân chồi mía Kim Tân nồng độ thấp (0,5 mg/l Kinetin), 3.2.3 Nghiên cứu ảnh