Luận văn thạc sĩ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN Dendrobium fimbriatum Hook

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI  NGUYỄN THỊ SƠN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN Dendrobium fimbriatum Hook. LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI – 2011 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Sơn Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn này tôi đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và cá nhân. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh, ThS. Vũ Ngọc Lan đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi làm việc và thực hiện đề tài nghiên cứu của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, ban chủ nhiệm khoa Nông học, Viện đào tạo sau đại học, các thầy cô giáo trong bộ môn Rau – Hoa – Quả đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 9 năm 2011 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Sơn Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục ñích, yêu cầu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu về chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) và loài Dendrobium fimbriatum Hook. 4 2.1.1 Vị trí phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium) 4 2.1.2 ðặc ñiểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo 7 2.1.3 ðặc ñiểm sinh thái học chi Dendrobium-Hoàng Thảo 10 2.1.4 ðặc ñiểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium fimbriatum Hook. 12 2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 13 2.2.1 Tính toàn năng của tế bào 13 2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào 14 2.2.3 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường ñến sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy 15 2.2.4 Nhân giống in vitro 19 2.3 Nghiên cứu nuôi cấy mô cây lan Hoàng Thảo trên thế giới và ở Việt Nam 20 2.3.1 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo trên thế giới 20 2.3.3 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo ở Việt Nam. 24 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. iv 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 27 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 28 3.2.1 Nội dung nghiên cứu 28 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 3.3 ðiều kiện thí nghiệm 36 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi 36 3.5 Xử lý số liệu 37 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 4.1 Nghiên cứu khử trùng, chọn nguồn vật liệu ban ñầu và nuôi cấy khởi ñộng mẫu lan Dendrobium fimbriatum Hook. 38 4.2 Nhân nhanh in vitro lan Dendrobium fimbriatum Hook. 43 4.2.1 Nhân nhanh protocorm 43 4.2.2 Nhân nhanh cụm chồi 52 4.3 Tạo cây hoàn chỉnh 61 4.4 Thích ứng cây in vitro tại vườn ươm 66 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70 5.1 Kết luận 70 5.2 ðề nghị 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 78 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CT Công thức CV(%) Hệ số biến ñộng (Correlation of Variants) ðC ðối chứng ðK ðường kính HSN Hệ số nhân MS Murashige & Shoog, 1962 LSD Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5 (Least Significant Difference) ND Nước dừa KC Knudson C, 1965 RE Robert Ernst, 1979 THT Than hoạt tính VW Vacin & Went, 1949 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1. Ảnh hưởng của chế ñộ khử trùng ñến khả năng sống, vô trùng của chồi lan (sau 6 tuần) 38 4.2. Ảnh hưởng của chế ñộ khử trùng ñến tỷ lệ mẫu sống và hình thái protocorm của lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 6 tuần) 41 4.3. Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên ở giai ñoạn nuôi cấy khởi ñộng ñến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy trên loài Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 6 tuần) 42 4.4. Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 44 4.5. Ảnh hưởng của các hàm lượng ñường sacaroza ñến khả năng nhân nhanh protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 46 4.6. Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh protocorm của loài lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 48 4.7. Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 50 4.8. Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 52 4.9. Ảnh hưởng của hàm lượng ñường saccaroza ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 54 4.10: Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 57 4.11. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy). 59 4.12. Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng của chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 8 tuần nuôi cấy) 61 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. vii 4.13. Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng ra rễ của cây lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 30 ngày nuôi cấy) 63 4.14. Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến sinh trưởng chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 30 ngày nuôi cấy) 65 4.15. Ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và chất lượng cây con lan Dendrobium fimbriatum Hook. ngoài vườn ươm (Sau 3 tuần trồng) 66 4.16. Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái tăng chiều cao cây và số lá trên cây lan Dendrobium fimbriatum Hook. ngoài vườn ươm (sau 2 tháng) 68 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Ảnh hưởng của chế ñộ khử trùng ñến chồi cây lan Dendrobium fimbriatum Hook. 39 4.2 Hình thái chồi cây sau khử trùng 39 4.3 Hình thái protocorm ở giai ñoạn khởi ñộng mẫu cấy trên CT2 42 4.4 Ảnh hưởng của nền môi trường ñến ñộng thái tăng ñường kính cụm protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 44 4.5 Ảnh hưởng của nền môi trường ñến HSN protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook 44 4.6 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường ñến ñộng thái tăng ñường kính cụm protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 46 4.7 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường ñến HSN protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 46 4.8 Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến HSN protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 49 4.9 Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi ñến khả năng nhân nhanh protocorm lan D.fimbriatum Hook. 49 4.10 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến ñộng thái tăng ñường kính cụm protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 51 4.11 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến HSN protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 51 4.12 Ảnh hưởng của khoai tây ñến khả năng nhân nhanh protocorm lan Dendrobium fimbriatum Hook. 52 4.13 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến ñộng thái tăng số chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 53 4.14 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến HSN chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 53 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………. ix 4.15 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến ñộng thái tăng số chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 55 4.16 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến HSN chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 55 4.17 Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến ñộng thái tăng số chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 58 4.18 Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến HSN chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 58 4.19 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến ñộng thái tăng số chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 59 4.20 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến HSN chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 59 4.21. Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook 60 4.22 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng của chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 62 4.23. Ảnh hưởng của THT ñến khả năng ra rễ của cây lan Dendrobium fimbriatum Hook. 64 4.24 Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến sinh trưởng chồi lan Dendrobium fimbriatum Hook. 65 4.25 ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống của lan Dendrobium fimbriatum Hook. ngoài vườn ươm. 67 4.26 Ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống của lan Dendrobium fimbriatum Hook. ngoài vườn ươm. 67 4.27 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái tăng chiều cao cây của lan Dendrobium fimbriatum Hook. ngoài vườn ươm. 69 4.27 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái tăng số lá của lan Dendrobium fimbriatum Hook. ngoài vườn ươm. 69 [...]... b o t n các gi ng lan quý Xu t phát t nh ng yêu c u th c ti n trên chúng tôi th c hi n nghiên c u ñ tài: Nghiên c u xây d ng quy trình nhân gi ng in vitro lan Dendrobium fimbriatum Hook. ” 1.2 M c ñích, yêu c u 1.2.1 M c ñích Nghiên c u xây d ng quy trình nhân gi ng in vitro lan Dendrobium fimbriatum Hook nh m phát tri n ngu n gen cây lan và góp ph n b o t n, thúc ñ y s n xu t cây lan r ng 1.2.2 Yêu... trình ñ u tiên nghiên c u v nhân gi ng in vitro loài lan Trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 2 Dendrobium fimbriatum Hook t i Vi t Nam - ð tài s cung c p nh ng d n li u khoa h c v loài lan Dendrobium fimbriatum Hook chi Hoàng Th o - Cung c p nh ng cơ s khoa h c v quy trình nhân gi ng in vitro lan Dendrobium fimbriatum Hook - Các k t qu thu ñư c s b sung thêm... ng d y, nghiên c u khoa h c v loài lan Hoàng Th o Dendrobium fimbriatum Hook 1.3.2 Ý nghĩa th c ti n - ð xu t ñư c quy trình nhân gi ng in vitro và thích ng cho lan Dendrobium fimbriatum Hook. ) ngoài vư n ươm - Góp ph n b o t n, thúc ñ y s n xu t cây Dendrobium fimbriatum Hook như m t ngh tr ng lan mang l i giá tr kinh t t i Hà N i và các vùng ph c n Trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c... mô ñ nhân gi ng cây lan Dendrobium fimbriatum Hook là hoàn toàn m i Các nghiên c u m i ch ñư c th c hi n trong th i gian g n ñây Vi t Nam trên m t s ñ i tư ng k trên và chưa có cơ quan, tác gi nào th c nghiên c u trên cây lan Dendrobium fimbriatum Hook ð góp ph n b o t n và phát tri n ngu n gen cây lan Dendrobium fimbriatum Hook ñang có nguy cơ b tuy t ch ng thì vi c nghiên c u xây d ng quy trình nhân. .. (George, Sherrington, 1984) * Các ch t ñi u ti t sinh trư ng Hi n nay, hai nhóm ch t ñi u ti t sinh trư ng ñư c s d ng nhi u nh t trong nuôi cây mô là auxin và xytokinin S cân b ng hàm lư ng auxin và xytokinin trong môi trư ng nuôi c y quy t ñ nh s phát sinh ch i hay r Auxin ñư c s d ng là IAA, 2,4D, α-NAA Còn Xytokinin có th là kinetin, BAP ho c nư c d a Trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c... h p nh t cho tái sinh ch i t protocorm và sinh trư ng c a ch i in vitro Môi trư ng MS + 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nư c d a và 1,0 mg/l NAA là Trư ng ð i h c Nông Nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 25 thích h p cho t o r c a ch i in vitro Vũ Ng c Lan và cs, 2011 ñã ñưa ra quy trình nhân gi ng in vitro gi ng lan Th ch h c (D.nobile Lindl.) môi trư ng nhân c m protocorm... o Vi t Nam Theo tác gi Tr n Văn Minh, Nguy n Văn Uy n (2001) k t lu n MS là môi trư ng nuôi c y cơ b n thích h p cho nhân gi ng lan Dendrobium in vitro, 1mg/l BA+ 0,1mg/l IBA là t h p ch t ñi u ti t sinh trư ng thích h p cho nhân protocorm chi lan này Hàm lư ng nư c d a 15% là ch t h u cơ b sung h u hi u nâng cao hi u qu phát sinh ch i trong quá trình nhân gi ng hoa lan Dendrobium Môi trư ng MS + 0,1mg/l... r ngư i ta dùng auxin Ch t ñi u ti t sinh trư ng là các y u t hoá h c c n thi t cho s sinh trư ng và phát tri n c a th c v t nói chung Nhưng ñ i v i cây hoa lan thì ch t ñi u ti t sinh trư ng có h n ch là gây bi n d m u c y 2.2.4 Nhân gi ng in vitro Theo Georger (1993) quá trình nhân gi ng in vitro bao g m các bư c sau: * Ch n l c và chu n b cây m Trư c khi ti n hành nhân gi ng in vitro c n ch n l c... v sau thì s vư t tr i càng rõ r t Bùi Th Tư ng Thu, Tr n Văn Minh (2007) s d ng môi trư ng VW b sung BA, NAA, kinetin, TDZ, nư c d a, ñư ng sucrose nuôi c y phát sinh và tăng sinh t bào soma, phát sinh và tái sinh phôi gi (PLB) c a cây hoa lan Dendrobium Nguy n Th M Duyên, 2006 ñã ñưa ra qui trình vi nhân gi ng lan Dendrobium anosmum Qu lan sau khi ñư c t th 4 tháng, kh trùng và gieo c y h t vào môi... 18 Cytokinin ñư c v n chuy n trong cây không phân c c như auxin, có th v n chuy n theo hư ng ng n và hư ng g c Cytokinin có th k t tương t như các phytohormone khác d ng t do và d ng liên trong cây chúng b phân gi i dư i tác d ng c a enzyme t o nên s n ph m cu i cùng là urê Các cytokinin t ng h p ñư c s d ng trong k thu t nuôi c y mô là kinetin và benzyladenin (Edwin F Geogre, 1993) Cytokinin có vai