Luận văn thạc sĩ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN Dendrobium fimbriatum Hook

DANH MỤC BẢNG khởi ñộng ñến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy trên loài nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh protocorm của loài lan 4.10: Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-
-

NGUYỄN THỊ SƠN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG

IN VITRO LAN Dendrobium fimbriatum Hook.

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT

Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ LÝ ANH

HÀ NỘI – 2011

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan rằng các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn

là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Sơn

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo và các cán bộ Viện Sinh học Nông nghiệp đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tôi làm việc và thực hiện

đề tài nghiên cứu của mình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo Trường Đại học Nông nghiệp

Hà Nội, ban chủ nhiệm khoa Nông học, Viện đào tạo sau đại học, các thầy

cô giáo trong bộ môn Rau – Hoa – Quả đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi về kiến thức và chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 9 năm 2011

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Sơn

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

MS Murashige & Shoog, 1962

LSD Sai khác tối thiểu có ý nghĩa ở P = 0.5

(Least Significant Difference)

DANH MỤC BẢNG

khởi ñộng ñến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy trên loài

nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh protocorm của loài lan

4.10: Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường nuôi

4.13 Ảnh hưởng của than hoạt tính ñến khả năng ra rễ của cây lan

Dendrobium fimbriatum Hook ngoài vườn ươm (Sau 3 tuần trồng) 66

tăng chiều cao cây và số lá trên cây lan Dendrobium fimbriatum

DANH MỤC HÌNH

4.10 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy

ñến ñộng thái tăng ñường kính cụm protocorm lan Dendrobium

4.11 Ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây bổ sung vào môi trường nuôi cấy

4.12 Ảnh hưởng của khoai tây ñến khả năng nhân nhanh protocorm lan

4.13 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến ñộng thái tăng số chồi lan

4.14 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến HSN chồi lan

4.15 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến

4.16 Ảnh hưởng của hàm lượng ñường bổ sung vào môi trường nuôi cấy ñến

4.17 Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường

4.18 Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ sung vào môi trường

4.19 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín bổ sung vào môi trường nuôi cấy

4.20 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín bổ sung vào môi trường nuôi cấy

4.21 Ảnh hưởng của hàm lượng chuối chín ñến khả năng nhân nhanh cụm

4.22 Ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng của chồi lan

4.23 Ảnh hưởng của THT ñến khả năng ra rễ của cây lan Dendrobium

4.24 Ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng ñến sinh trưởng chồi lan

4.25 ðồ thị biểu diễn ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống của lan

4.26 Ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống của lan Dendrobium fimbriatum

4.27 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái tăng

4.27 Ảnh hưởng của các loại chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến ñộng thái tăng

vị thuốc dân tộc cổ truyền dùng ựể chữa sốt nóng, khô cổ, kém ăn, giảm thị lực Theo

cuốn ỘDược ựiểnỢ Trung Quốc năm 1997, nhiều loài ựược sử dụng làm thuốc như: D

loddigesii Rolfe, D fimbriatum Hook., Var oculatum Hook., D chrysanthum Wall., D candidum Wall ex Lindl., D nobile Lindl (đỗ Huy Bắch, 2004)

Tuy nhiên, trong quá trình phát triển kinh tế xã hội, do những nguyên nhân khác nhau, nhiều loài Hoàng thảo ựã bị tuyệt chủng hoặc bị ựe doạ tuyệt chủng Năm 2004, một số loài lan thuộc chi lan Hoàng thảo ựã có trong danh lục đỏ của

ỘSách ựỏ Việt NamỢ như: Thuỷ Tiên Hường (Dendrobium amabile (Lour.) OỖBrien, 1909), Hạc Vĩ (Dendrobium aphyllum (Roxb.) C Fisch 1928), Ngọc vạn vàng (Dendrobium chrysanthum Lindl 1830), Kim điệp hay Hoàng thảo Long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook 1823), Hoàng thảo hoa trắng-vàng (Dendrobium

nobile var albolu-teum Huyen & Aver 1989),

Dendrobium fimbriatum Hook (Hoàng thảo long nhãn) sống phụ sinh, bám trên

cây gỗ lớn trong rừng, ở ựộ cao 200 -1400m Nở hoa tháng 3 -7 Trong thực tế loài lan Hoàng Thảo này gần như ựã bị con người khai thác ựến cạn kiệt nhằm thu lợi nhuận Ở một số nơi như: Lai Châu (Tà Ngâu - Sìn Hồ), Lào Cai (SaPa), Hà Giang (Lao Và Chải - Yên Minh), Cao Bằng (Trà Lĩnh - Quốc Toản, Nguyên Bình), Bắc Kạn (Ba Bể), Vĩnh Phúc (Tam đảo), Ninh Bình (Mây Bạc - Cúc Phương), Nghệ An

(Vinh), Lâm đồng (núi Braian - Di Linh - đà Lạt), Cà Mau loài này ựược trồng trên

những cành gỗ mục hay cành cây treo ngoài gió (Dương ðức Huyến, 2007) Người trồng lan thường sử dụng phương pháp nhân giống vô tính truyền thống như tách cụm, chồi nên hệ số nhân giống thấp Nguồn dược liệu quý thiên nhiên ban tặng cho con người ñang ñứng trước nguy cơ suy giảm nghiêm trọng về số lượng, chất lượng, không ñáp ứng ñược nhu cầu sử dụng của con người

Hơn nữa, hoa lan là một loài hoa khó nhân giống (ñặc biệt với cây lan có các ñặc tính quý) cho nên phương pháp nuôi cấy mô là phương pháp tối ưu ñể nhân giống ñáp ứng nhu cầu của thị trường, góp phần bảo vệ nguồn tài nguyên và phát triển ngành nuôi trồng, sản xuất và bảo tồn các giống lan quý

Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn trên chúng tôi thực hiện nghiên cứu ñề tài:

“Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Dendrobium fimbriatum Hook.”

1.2.1 Mục ñích

Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro lan Dendrobium

fimbriatum Hook nhằm phát triển nguồn gen cây lan và góp phần bảo tồn, thúc ñẩy

sản xuất cây lan rừng

1.2.2 Yêu cầu

- Xác ñịnh ñược nguồn vật liệu tối ưu cho việc ñưa mẫu vào nuôi cấy mô

- Xác ñịnh ñược chế ñộ khử trùng và môi trường tối ưu cho phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô

- Xác ñịnh ñược môi trường nhân nhanh in vitro có bổ sung một số hợp chất hữu cơ tự nhiên

- Xác ñịnh ñược môi trường tối ưu cho tạo cây hoàn chỉnh

- Xác ñịnh ñược giá thể, chế ñộ dinh dưỡng tối ưu ñể sinh trưởng phát triển của cây con nuôi cấy mô thích ứng ngoài vườn ươm

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

- ðây là công trình ñầu tiên nghiên cứu về nhân giống in vitro loài lan

Dendrobium fimbriatum Hook tại Việt Nam

- ðề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về loài lan Dendrobium

fimbriatum Hook chi Hoàng Thảo

- Cung cấp những cơ sở khoa học về quy trình nhân giống in vitro lan

Dendrobium fimbriatum Hook

- Các kết quả thu ñược sẽ bổ sung thêm tài liệu khoa học phục vụ cho công

tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học về loài lan Hoàng Thảo Dendrobium

fimbriatum Hook

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- ðề xuất ñược quy trình nhân giống in vitro và thích ứng cho lan Dendrobium

fimbriatum Hook.) ngoài vườn ươm

- Góp phần bảo tồn, thúc ñẩy sản xuất cây Dendrobium fimbriatum Hook như

một nghề trồng lan mang lại giá trị kinh tế tại Hà Nội và các vùng phụ cận

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

fimbriatum Hook

2.1.1 Vị trắ phân bố và phân loại lan chi Hoàng Thảo (Dendrobium)

Các ựại diện của chi Hoàng thảo (Dendrobium) chủ yếu sống phụ sinh trên

thân hoặc các cành cây ở trong rừng hoặc trên các hốc mùn trên ựá, thường ở nơi

ẩm, thường mọc ở ựộ cao 500 Ờ 1500m so với mực nước biển, nhưng có khi gặp chúng mọc ở ựộ cao 200m hoặc tới 2000m

Theo Dương đức Huyến (2007) xây dựng hệ thống phân loại lan Hoàng Thảo ở Việt Nam chủ yếu dựa trên hệ thống của Seidenfaden (1985) thành 15 sectio

Sectio 1: Grastidium (Blume) J J Smith - Trúc lan

Những loài thuộc sectio này mang các ựặc ựiểm: thân rất mảnh, lá mảnh dạng lưng-bụng; bẹ lá nhẵn; gốc môi tự do không có cựa

Sectio này có khoảng 100 Ờ 120 loài Phân bố ở lục ựịa đông Nam Á, Inựônexia, đông bắc Oxtraylia, ưu thế ở Niu Ghinê Ở Việt Nam có 3 loài

Sectio 2: Conostalix Kraenzl

Thuộc về sectio này gồm các loài có ựặc ựiểm gần với sect Grastidium (thân rất

mảnh, lá mảnh dạng lưng-bụng) nhưng khác là bẹ lá có phủ lông dài màu ựen Gốc cánh môi có mép dắnh với mép bên của chân cột tạo thành cựa ngắn

Có 14 loài phân bố ở lục ựịa đông Nam Á, Malayxia, Singapo, Inựônêxia, đông Nam Ôxtrâylia Ở Việt Nam có 3 loài

Sectio 3: Formonsae (Benth & Hook F.) Hook.f

đặc ựiểm: lá mỏng dạng lưng-bụng; lá non và bẹ lá mang lông ngắn màu ựen

hoặc nâu giống với sect Conosatlix Tuy nhiên thân các loài của tông này dày mập

lên hình trụ hoặc hình con suốt; hoa to màu trắng hoặc vàng nhạt

Sect này có khoảng 30 Ờ 35 loài ở lục ựịa nhiệt ựới châu Á, Inựônêxia, Philippin Việt Nam có 10 loài

Sectio 4: Dendrobium Ờ Hoàng thảo

đây là sectio khá lớn có nhiều loài hơn cả Chúng mang ựặc ựiểm khá giống với

sect Formosae bởi thân mập, hình trụ hoặc hình con suốt Cụm hoa ngắn, nhiều hoa, hoa to So với sect Formosaei thì nó có một số ựặc ựiểm khác biệt ở chỗ hoa thường

có cằm ngắn dạng túi, cánh môi hơi cuộn lại thành hình phễu, tận cùng có chai dày

Sectio này có khoảng gần 300 loài phân bố ở lục ựịa nhiệt ựới châu Á, Trung Quốc (Hải Nam), ựảo đài Loan, Inựônêxia Việt Nam có 30 loài

Sectio 5: Breviflores Hook f

đây là một sectio không lớn, mang những ựặc ựiểm phần nào giống với sect

Dendrobium như: thân ắt nhiều dày mập lên, lá mỏng dạng lưng-bụng, gốc môi có

chai dày Tuy nhiên cánh môi ở sectio này có hình chén và vách có phủ lông chia môi thành 2 phần

Sectio này có khoảng 18 loài ở các lục ựịa châu Á, Hải Nam, Inựônêxia Việt Nam có 8 loài

Sectio 6: Distichophyllum Hook F

Sectio này có số loài tương ựối ắt và mang những ựặc ựiểm gần với sect

Grastidium và sect Conostalix ở chỗ thân còn mảnh; có dày lên ở một vài ựại diện

nhưng không mập hẳn; hoa không lớn; lá dẹt dạng lưng-bụng điều khác là lá xếp dày xắt và hơi dày lên; cằm hơi dài so với kắch thước của hoa

Trên thế giới có khoảng 15 loài phân bố ở đông Nam Á Việt Nam có 3 loài gồm:

Sectio 7: Superbientia Kraenzl

đặc ựiểm khá giống với sect Chrysotoxae ở chỗ thân mập hình con suốt; lá

dày dạng da, mọc cụm ở phần ựỉnh; chùm hoa dài Tuy vậy nó cũng khác biệt căn

bản ở chỗ hoa thường xếp thưa chứ không dày như ở sect Chrysotoxae Hơn nữa,

gốc cánh môi không có các u lồi lớn điều ựặc biệt là sectio này có cằm kép tạo thành khớp do sự dắnh lại của gốc môi, chân cột và mép trong gốc lá ựài bên

Thế giới có khoảng 13 loài phân bố ở lục ựịa châu Á, Inựônêxia, đông Bắc Ôxtrâylia Việt Nam có 1 loài

Sectio 8: Pedilonum (Blume)

đặc ựiểm của các loài trong sectio khá giống với sect Distichophyllum ở chỗ

thân thường hình trụ, lá hình mác, ắt nhiều mảnh Hoa của sectio này có cằm khá

dài, thường hình trụ và cong, cụm hoa nhiều hoa hơn sect Distichophyllum

Thế giới có 160-180 loài phân bố ở lục ựịa đông Nam Á, Phylippin, Indonexia, đông Bắc Ôxtrâylia, các ựảo ở phắa tây thái Bình Dương Việt Nam có 3 loài

Sectio 9: Stachyobium Lindl

Gồm các loài mang những ựặc ựiểm khá gần với sectio Dendrobium là có thân mập hình trụ và gần với sect Chrysotoxae có thân hình con suốt; lá mảnh giống với sectio Dendrobium nhưng lại thường mọc tập trung ở phắa ựỉnh giống với sectio Chrysotoxae, hoa cả hai sectio kể trên ở chỗ có mép cánh môi uốn lượn và xẻ

răng, không có u lồi rõ rệt

Trên thế giới có 40 Ờ 50 loài phân bố ở lục ựịa nhiệt ựới châu Á, Trung Quốc (đài Loan), Indonexia Việt Nam có 6 loài

Sectio 10: Chrysotoxae Kraenzl

Sectio này bao gồm các loài mang những ựặc ựiểm là có cánh hoa to, cánh môi thường phủ lông rậm, có u lồi, thân mập hình con suốt; lá tập trung ở ựỉnh; cụm hoa thường nhiều hoa

Thế giới có 10 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt ựới châu Á, Việt Nam

có 6 loài

Sectio 11: Bolbidium Lindl Ex Lindl

đây là một sectio nhỏ Mặc dù thân của các ựại diện dày mập lên hình con

suốt giống với sect Chrysotoxae nhưng chỉ gồm một lóng trên một cuống ngắn gồm

vài ựốt dưới lóng cùng của thân Hoa có cằm dài, cong và có cựa mật; cụm hoa ở

ựỉnh gồm một hoa ở giữa 2 lá là ựiểm khác biệt căn bản so với sect Chrysotoxae

Thế giới có 7 Ờ 8 loài phân bố ở lục ựịa châu Á, Philippin, Indonexia Việt Nam có 3 loài

Sectio 12: Crumenatae Pfitz

Các loài thuộc sectio này có thân mảnh; hoa nhỏ giống như sect Grastidium

nhưng 2 Ờ 3 lóng ở gốc phình lên thành bọng mập Một số loài có lá hình trụ, ựỉnh

nhọn; cánh môi chia thùy, khác hẳn với sect Grastidium

Thế giới có 40 Ờ 50 loài phân bố ở lục ựịa châu Á, một số ựảo như Hải Nam (Trung Quốc), đài Loan, Indonexia, Philippin Việt Nam có 8 loài

Sectio 13: Strongyle Lindl

Sectio này có các loài mang nhiều ựặc ựiểm của sect Grastidium là thân

mảnh không bao giờ dày mập lên, hoa nhỏ nhưng lại mang ựặc ựiểm khác hẳn là có

lá hình trụ, hơi cong giống với các ựại diện của sect Crumenatae

Sectio này có khoảng 20 loài phân bố ở lục ựịa châu Á, Philippin, Indonexia Việt Nam có 2 loài

Sectio 14: Aporum (Blume) Lindl

đặc ựiểm của các loài thuộc sectio này tương ựối giống với sect Strongyle ở

chỗ thân mảnh, hoa nhỏ, lá không còn dạng lưng-bụng nữa nhưn khác sect

Strongyle căn bản là thân và lá ựều dẹp bên; lá ngắn, mọng nước, xếp xắt lợp gốc

lên nhau

Thế giới có khoảng 40 loài phân bố ở lục ựịa châu Á, Trung Quốc (Hải Nam), Indonexia Việt Nam có 12 loài

Sectio 15: Oxystophyllum (Blume) Miq

Sectio này mang các ựặc ựiểm khá giống với sect Aporum là có lá và thân

dẹp bên, lá mọng nước và có gốc lợp xếp xắt lên nhau, hoa nhỏ đặc ựiểm khác biệt

so với sect Aporum là sectio này có 5 Ờ 7 lá bắc xếp dạng vẩy lợp, cánh môi có 1 u

lồi hình côn ở mặt dưới

Thế giới có khoảng 25 loài phân bố ở lục ựịa đông Nam Á, Indonexia Việt Nam có 1 loài

2.1.2 đặc ựiểm hình thái của chi lan Hoàng Thảo

a Thân

Các ựại diện của chi Hoàng thảo (Dendrobium) rất dễ nhận biết ngoài thiên

nhiên đó là các cây thân thảo mọc cụm, ựứng thẳng hoặc rủ thõng, phân ựốt, sống phụ sinh trên các cây gỗ hoặc ắt gặp các loài sống bám trên ựá, trong rừng ẩm Chi

lan Hoàng Thảo thuộc nhóm ựa thân (sympodial) với nhiều giả hành đây là nhóm bao gồm các cây tăng trưởng liên tục nhưng có chu kỳ nghỉ sau những mùa sinh trưởng Chi này vừa có thân thật vừa có giả hành Giả hành tuy là thân nhưng lại chứa diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa ựầy dịch nhầy, phắa ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ ựể tránh sự mất nước do sức nóng của mặt trời đa số các củ giả hành có màu xanh nên nó ựã cùng với lá làm nhiệm

vụ quang hợp (Trần Hợp, 2000)

Thân của các ựại diện chi Hoàng Thảo ựều phân ựốt, hình trụ, hình con suốt, hình chùy, hình trứngẦcó chiều dài thay ựổi từ 2-3cm ựến 120 cm hoặc ựôi khi hơn, kắch thước phổ biến là 20-50cm Lát cắt ngang thân có thể là hình tròn, bầu dục, ựôi khi hình 4 cạnh nhưng ựược gọi chung theo kắch thước ngang này là chiều dày, thay ựổi từ 0,3-1,5cm nhưng ựa số hay gặp là khoảng 0,5-1cm Thân có thể mảnh, ựôi khi dẹp bên hoặc là dày mập lên Phần dầy mập lên của thân gồm một vài lóng ở sát gốc hoặc ở sát ựỉnh, còn thì ựa số là ở giữa thân ựều dần lên ựến ựỉnh và xuống phắa gốc đôi khi phần dày lên theo hình con suốt có 4 gờ sắc Ở cá biệt vài loài chỉ có các mấu dày lên, còn lóng thì hầu như không làm thân có tràng hạt hoặc

sự dày lên là dần dần ựộc lập ở mỗi lóng làm thành dạng ựùi gà nối tiếp Phần tận cùng là gốc, nơi xuất phát của rễ, thường là nhỏ mảnh nhưng cũng không ắt trường hợp phình to ra (Dương đức Huyến, 2007)

b Rễ

Sự ựa dạng về hình thái và cấu trúc rễ ựã làm cho chi lan hoàng thảo phù hợp với ựiều kiện sống như khi sống trong ựất thì rễ mập, thân rễ bò dài (Trần Hợp, 2000) Rễ của các ựại diện chi Hoàng Thảo là rễ khắ sinh, mảnh, hình trụ, màu xanh

và chuyển thành nâu khi già, chúng thường ôm lấy giá thể hoặc buông thõng xuống

Ở một số loài sống bám lơ lửng trên vỏ thân cây gỗ làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng, hấp thụ dinh dưỡng, chúng ựược bao bọc bởi lớp mô hút ẩm dày bao gồm

cả những lớp tế bào chết chứa ựầy không khắ do ựó nó ánh lên màu xám bạc Chiều dài của rễ từ 0,1- 0,3cm; rễ thường mọc ra từ phần gốc của thân hoặc ựôi khi có thể

ở mấu thân của một vài loài

là tròn lệch nhau Chiều dài của lá thay ñổi từ 1-19 cm và chiều rộng từ 0,3-3,5cm

Lá hình trụ thường có bề dày (từ 0,2-0,4cm) (Dương ðức Huyến, 2007)

d Cụm hoa

Cụm hoa chùm thường nhiều hoa, ñôi khi ít hoa hoặc ñơn ñộc Cụm hoa dài thường rủ thõng xuống, nhiều loài có cụm hoa ñẹp có giá trị làm cảnh (Dương ðức Huyến, 2007)

e Hoa

Hoa lưỡng tính, ñối xứng hai bên Màu sắc hoa ña dạng, sặc sỡ Hoa ña số các loài có hương thơm, Bao hoa chia 2 vòng Vòng ngoài gồm 1 lá ñài giữa và 2 lá ñài bên Vòng trong gồm có 2 cánh hoa và một cánh môi (Dương ðức Huyến, 2007)

* Cằm

Là một bộ phận ñược hình thành nhờ mép phần gốc 2 lá ñài bên dính nhau và dính với chân cột Cằm có các hình bán cầu, hình túi ñến hình cựa, hình trụ cong ít nhiều (Dương ðức Huyến, 2007)

* Cánh môi

So với lá ñài, cánh hoa ít nhiều có kích thước và màu sắc khác biệt Tuy nhiên, ngay trong các cánh hoa thì cánh môi khác nhiều so với các thành phần còn lại của bao hoa cả về màu sắc, kích thước lẫn trang trí Trang trí ña dạng trên cánh

môi như ñốm, vạch, diềm tua, u lồi, ñường sống, lông phủ chiếm vị trí khá quan trọng trong phân loại Nhiều ñại diện có gốc cánh môi dính với chân cột tạo thành cựa (Dương ðức Huyến, 2007)

* Cột (trụ nhị-nhụy)

Cột hay còn gọi là trụ nhị-nhụy, thường thấp, mặt trước hơi lõm lòng máng; ñỉnh cột lõm ñể chứa khối phấn, hai mép ñỉnh cột có 2 răng cột; phủ lên ñỉnh cột nắp bao phấn (thường gọi ñơn giản là nắp) Ở gốc cột có mỏ, thường là một phần phụ dạng màng nhô ra nhằm ngăn cách bao phấn với nhụy (hốc ñặt phấn) Chỗ thấp nhất phía dưới cột là chân cột, thường hình tam giác thuôn và có tuyến mật Bao phấn hình mũ, bề mặt thường nhẵn hoặc có nhũ mịn, ñôi khi có lông nạc bao phủ Khối phấn hình chùy, không có chuôi, số lượng là 4, xếp thành 2 cặp Bầu hạ, thường nhỏ và thon dần xuống cuống hoa, ranh giới giữa bầu và cuống hoa không

rõ rệt, bầu 3 ô, rất nhiều noãn (Dương ðức Huyến, 2007)

f Quả

Quả nang thường hình chùy hoặc hình con suốt, chứa rất nhiều hạt nằm xen lẫn những sợi lông mảnh Khi quả già, gặp trời ẩm sợi này sẽ hút nước và trương lên, phá vỡ vỏ quả giải phóng hạt ra ngoài Hạt rất nhỏ, hầu như không trọng lượng, bao quanh hạt là lớp màng dạng mắt võng, trong suốt chứa ñầy không khí dễ dàng bay cùng hạt trong không khí nhờ gió (Dương ðức Huyến, 2007)

2.1.3 ðặc ñiểm sinh thái học chi Dendrobium-Hoàng Thảo

a Nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ ảnh hưởng nhiều ñến sự tăng trưởng phát triển của lan Dendrobium

thông qua con ñường quang hợp và hoạt ñộng trao ñổi chất Nhiệt ñộ thích hợp cây quang hợp tốt, khả năng tích luỹ chất khô cao nên sinh trưởng và phát triển của cây tốt Ngược lại nếu nhiệt ñộ quá cao hoặc thấp sẽ ảnh hưởng xấu ñến sinh trưởng và phát triển của lan

Lan Hoàng Thảo thuộc loại cây ưa nóng, sinh trưởng tốt ở nhiệt ñộ 24-330C Dưới 120C và trên 370C ñều làm chậm và ảnh hưởng lớn ñến sự ra hoa của cây

Trong thực tế sản xuất tại miền Bắc có mùa ñông lạnh và mùa hè nóng thì

cần hạn chế tác ựộng xấu của nhiệt ựộ bằng cách vào mùa ựông thì che phủ nilon quanh nhà trồng lan hoặc thắp ựiện còn mùa hè che lưới phản quang, có hệ thống phun tưới thắch hợp và tạo ựiều kiện thông thoáng trong nhà lan sẽ ựem lại hiệu quả

rõ rệt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2009)

b Ẩm ựộ

độ ẩm thắch hợp giúp cho cây ựược phát triển nhanh hơn hoa tươi và lâu tàn

Dendrobium cũng như ựa số các giống lan khác chỉ phát triển tốt trong ựiều kiện

không khắ ẩm nhưng thoáng khắ, vào ban ngày cây cần ựộ ẩm khoảng từ 40-60%, vào ban ựêm ựộ ẩm thắch hợp từ 60-90% thì cây sẽ phát triển tốt hơn Loại giá thể

quá ẩm và úng sẽ là ựiều kiện bất lợi cho sự sinh trưởng của giống Dendrobium vì

có thể bị thối toàn bộ rễ và biểu hiện là các cây con mọc từ phần ngọn của thân (Bùi Thị Thu Hiền, 2009)

c Ánh sáng

Dendrobium là giống ưa sáng, có thể trồng trong ựiều kiện ánh sáng trực tiếp

hay khuếch tán Ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%, vì thế giàn che

với ựộ che sáng 30% dưới ựất và 40% ở trên cao với cường ựộ ánh sáng từ

15.000-30.000 lux rất thắch hợp cho sự phát triển của Dendrobium

Mùa hè của miền Bắc cường ựộ ánh sáng mạnh, nhu cầu ánh sáng của lan Hoàng Thảo khoảng 70-80% ánh sáng trực tiếp Trong ựiều kiện râm mát cây thường yếu, mọng nước, rất dễ nhiễm bệnh Về mùa ựông cường ựộ ánh sáng yếu

và thời gian chiếu sáng ngắn, ựể lan Hoàng Thảo sinh trưởng và phát triển tốt và

ra hoa ựược thì cần bổ sung ánh sáng bằng cách thắp ựiện cho vườn lan (Bùi Thị Hiền, 2009)

d Dinh dưỡng

Lan Hoàng Thảo yêu cầu một lượng dinh dưỡng nhất ựịnh ựể sinh trưởng và phát triển Tuy không ựòi hỏi số lượng lớn nhưng phải ựầy ựủ các thành phần dinh dưỡng N, P, K và các nguyên tố trung, vi lượng Tuỳ từng giai ựoạn sinh trưởng mà nhu cầu ựối với các thành phần dinh dưỡng có khác nhau (đào Thanh Vân, đặng Thị Tố Nga, 2008)

d Giá thể

Giá thể của Dendrobium cần chậu phải thật thoáng và không úng nước Tuy

nhiên do bản năng sinh học và cấu trúc thực vật với giả hành có thân, các loài thuộc

giống Dendrobium cần giá thể hơi ẩm chút ít nhưng không ñược làm thối căn hành

Vì thế một số loài Dendrobium có thể phát triển trên các giá thể là xơ dừa hay cả

quả dừa, dùng như một cái chậu chứa sẵn giá thể Tuy nhiên nếu giá thể là xơ dừa phải hạn chế số lần tưới nước, nếu chậu là quả dừa nguyên phải cưa phần ñáy, nếu

không cây bị thối vì quá ẩm Cũng có thể trồng cây lan Dendrobium với căn hành

cách ñáy chậu khoảng 3cm, rồi rải thật thoáng xung quanh căn hành là một số rễ lục bình giặt sạch Với cách trồng này thì kích thước chậu và cây phải thật tương xứng Tuy nhiên, giá thể than và gạch nung vẫn tỏ ra hiệu quả nhất ñối với các loài

Dendrobium

2.1.4 ðặc ñiểm hình thái và giá trị sử dụng của loài Dendrobium fimbriatum

Hook

a, ðặc ñiểm hình thái

Loài Dendrobium fimbriatum Hook Có tên Việt Nam là Hoàng thảo long

nhãn, Kim ñiệp, Mã tiên thạch hộc có thân dài 90cm, hình trụ, dày 0,7- 0,8 cm, lóng dài 3- 4cm Lá hình mác rộng, ñỉnh nhọn, dài 10-13cm, rộng 2-3cm Lá bắc dài khoảng 0,5cm Loài này có cụm hoa bên ở sát ñỉnh thân, dài 5-8cm, nhiều hoa, hoa màu vàng, ñường kính 4,5-5cm, cuống hoa và bầu dài khoảng 3cm Các lá ñài hình bầu dục, ñỉnh tù, dài 3-3,5cm, rộng 3,3-3,5cm; mép xẻ răng sâu hoặc có diềm tua dày, phân nhánh, giữa môi có một ñốm lớn màu tím ñỏ hoặc nâu tím Cột cao khoảng 0,5cm; răng cột tù Nắp bao phấn hình mũ cao, nhẵn Nở hoa tháng 3 ñến tháng 7 (Dương ðức Huyến, 2007)

b, Giá trị sử dụng của loài Dendrobium fimbriatum Hook

* Cây ñược dùng làm cảnh vì hoa to, thơm màu vàng cam với môi xẻ tua, ở họng có một ñốm màu nâu tím hoặc tím ñỏ giống mắt rồng rất ñẹp

* Các bộ phận của cây ñược sử dụng làm thuốc:

Theo dược ñiển Trung Quốc 1997 (bản in tiếng Anh) dùng nhiều loài làm

Thạch hộc như D.Loddigesii Rolfe, D.fimbriatum Hook., D.chrysanthum Wall.ex Lind., D.nobile Lindl Thạch hộc chứa alcaloid sesquiterpen, dendrobine (alcaloid

chính), nobilin, dendroxin, dendramin, dendrin, 8-hydroxydendroxin, 3-hydroxy- oxodendrobine, 6-hydroxydendroxin Hàm lượng dendrobine ở cây trồng là 0,58% (ở thân) và 0,6% (lá) và ở cây hoang dại là 3,2% (ở thân), 0,8% (lá), và 0,08% (rễ) (ðỗ Huy Bích và cs, 2004) Ngoài ra thạch hộc còn có một số alcaloid bậc 4 như N-methyldendrobinium iodid, N-isopentenyl dendrobinium bromid, dendrobine N-oxyd, N-isopentennyl dendroxinium clorid và N-isopenyl-6hydroxydendroxinium clorid Phần trên mặt ñất của thạch hộc chứa 2 dẫn chất pheantren là 4,7-dihydroxy-2- methoxy-9, 10-dihydrophenanthren và denbinobin Hai chất này ñộc ñối với tế bào (ðỗ Huy Bích và cs, 2004)

2-Thạch hộc ñược dùng chữa bệnh sốt nóng, khô cổ, ho, ñau rát họng, khát

nước thuộc chứng âm hư, nóng trong, chữa ñau lưng, chân tay nhức mỏi, làm thuốc

bổ ngũ tạng, chữ hư lao, ra mồ hôi trộm, nam giới thiểu năng sinh dục, di tinh ñau

dạ dày ợ chua, sau khi khỏi bệnh bị hư nhược, gầy yếu, kém ăn

Trong y học cổ truyền Trung Quốc Thạch hộc ñược coi là có tác dụng giúp ích cho dạ dày, làm tăng tiết dịch dưỡng âm trừ nhiệt, thuốc bổ và tăng sức lực toàn thân, chữa liệt dương, khát nước do âm hư hoặc suy giảm dịch cơ thể, ăn không ngon, buồn nôn, suy nhược cơ thể sau khi bệnh nặng, thị lực giảm (ðỗ Huy Bích và

cs, 2004)

Dùng thân và rễ loài Dendrobium fimbriatum Hook chữa ho khan, ñau lưng

mỏi gối, thiểu năng sinh dục (Võ Văn Chi, 1997)

2.2.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902), lần ñầu tiên ñã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một

cơ thể sinh vật ña bào ñều có khả năng tiềm tàng ñể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm của sinh học hiện ñại thì mỗi tế bào riêng rẽ ñã phân hoá ñều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và ñủ của cả cơ thể sinh vật ñó Khi gặp ñiều kiện thích hợp, mỗi tế bào ñều có thể phát triển thành một cá

thể hoàn chỉnh đó là tắnh toàn năng của tế bào

Tắnh toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chắnh là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho ựến nay con người ựã hoàn toàn chứng minh ựược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

2.2.2 Sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chắnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, ựược hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên tất cả các loại tế bào ựó ựều bắt nguồn từ một tế bào ựầu tiên (tế bào hợp tử)

Ở giai ựoạn ựầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa) Sau ựó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục ựược biến ựổi thành các tế bào chuyên hóa ựặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá, ựảm nhận các chức năng khác nhau Vắ dụ: Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm chức năng dẫn nước và dẫn dinh dưỡng

Quá trình phân hoá tế bào có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hoá

có chức năng riêng biệt

Tuy nhiên, khi tế bào ựã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyên hóa riêng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia Trong trường hợp cần thiết, ở ựiều kiện thắch hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh

mẽ Quá trình ựó gọi là phản phân hoá tế bào, ngược lại với sự phân hoá tế bào

Sự phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyên hoá

Sự phản phân hoá tế bào

Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,

phân hóa gen Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen ñược hoạt hoá (mà vốn trước nay bị ức chế) ñể cho ra tính trạng mới, còn một

số gen khác lại bị ñình chỉ hoạt ñộng và tính trạng ñó cũng biến mất Mặt khác một

số gen vẫn tiếp tục hoạt ñộng ñể duy trì các tính trạng ñã có (Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Quang Sáng, 2006) ñiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hoá trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hòa

Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối

mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho ñến cùng là kỹ thuật ñiều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong ñiều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách ñịnh hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật ðể ñiều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Trong môi trường nuôi cấy, tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật ñược biểu thị ở hình 4.1 Theo sơ ñồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng ñộ auxin (ñại diện là IAA)/cytokinin (ñại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mô nuôi cấy sẽ phát sinh hình thái theo hướng tạo rễcòn ở tỷ lệ cân ñối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus)

2.2.3 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường ñến sinh trưởng, phát triển

của mẫu cấy

Theo Nguyễn Quang Thạch (2009) thì ngay từ những giai ñoạn ñầu của sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật tùy thuộc ñối tượng nghiên cứu, mục ñích nghiên cứu khác biệt ñòi hỏi phải có những môi trường dinh dưỡng thích hợp

khác nhau Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các nhóm môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm:

- Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: ðại diện là môi trường MS (Murashige – Skoogs, 1962) (Lê Xuân Lương, 2005) Nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là muối nitrat, amon, kali, các nguyên tố vi lượng ñầy ñủ Môi trường thuộc nhóm này thích hợp hầu hết các loại và ñối tượng nuôi cấy

- Nhóm môi trường ñủ dinh dưỡng: ðại diện là các môi trường N6, B5, SH Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng ña lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS nhưng ñặc biệt có hàm lượng natri kali cao

- Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: ñại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch, Knop, KnudsonC

- Nhóm môi trường thích hợp ñể nuôi cấy các cây thân gỗ: môi trường WPM, DKW…

Môi trường dinh dưỡng bao gồm khoáng ña lượng, nguồn các bon, viamin và chất ñiều tiết sinh trưởng Một số thành phần khác có thể ñược bổ sung thêm như nitơ vô cơ, axít vô cơ và dịch chiết trái cây (Gamborg, 1986)

* Khoáng ña vi lượng

Các chất khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô ñều ở dạng các muối

vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các hỗn hợp muối vô cơ

Các muối khoáng ñược sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy

mô tế bào Hầu hết các môi trường chứa ít nhất 30mM nitơ vô cơ và Kali vô cơ Muối amonium có thể ñược sử dụng từ 2-20mM trong môi trường Nồng ñộ Ca,

SO4, photphat và muối Mg thay ñổi từ 1-3mM là thích hợp

ðạm là thành phần của acid nucleic ñóng vai trò quan trọng trong trao ñổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh tế bào (Moxolov, 1987), do ñó có ảnh hưởng trực tiếp ñến sự sinh trưởng và phát triển của cây ðạm ñược sử dụng trong nuôi cấy thường là dạng ammoium (NH4+) và nitrate (NO3-)

Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp Protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng Lân thường ñược sử dụng ở hai dạng ion là

HPO42- và H2PO4-

Nồng ñộ khoáng ña lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nửa so với bình thường (tùy thuộc loài cây) Nguyên nhân có lẽ do nhu cầu về ñạm trong giai ñoạn này giảm xuống (Nguyễn ðức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

* Vitamin

Thực vật cần vitamin ñể xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường ñược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamine HCl (B1); Pyridoxine HCl (B6); Acid Nicotinic; Myo-inositol (Nguyễn ðức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

* Nguồn sắt

Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm ñều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp với Na2-Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA) Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật (Trần Văn Minh, 1999)

* Nguồn carbon

Nguồn carbon (Sucrose; Glucose hoặc Fructose) là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của ñường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao cây con Nồng ñộ sucrose (20 – 30g/l) thường ñược thêm vào môi trường ñể ñẩy mạnh tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con Theo Debergh (1991), sự vắng mặt của ñường làm giảm các vấn ñề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng tự dưỡng trong ñiều kiện in vitro khi nồng ñộ CO2 và mật ñộ ánh sáng tăng lên

* Các chất hữu cơ tự nhiên

Có một lượng lớn những chất hữu cơ tự nhiên ñược bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro hoa lan như peptone, nước ép carot, khoai tây, táo, dịch chiết chuối, nước dừa…Những hợp chất tự nhiên này hỗ trợ rất tốt quá trình hình phát triển của cây nuôi cấy mô Nước dừa với thành phần phức tạp chứa nhiều chất dinh dưỡng và hormone Nó có tác ñộng thúc ñẩy sự tăng trưởng rõ rệt ñối với nhiều loại

mô cấy thực vật khác nhau Nó dễ dàng phối hợp với các thành phần trong môi trường nuôi cấy, không mất hoạt tính khi hấp khử trùng hay khi tiếp xúc với các ñiều kiện nuôi cấy trong khoảng thời gian ngắn Nó thường ñược thêm vào môi trường nuôi cấy mô hoa lan ñể kích thích tạo mô sẹo và protocorm và thường ñược

sử dụng ở dãy nồng ñộ từ 10- 25% về thể tích Ngoài ra, nước dừa cũng giữ vai trò quan trọng trong sự ñiều hoà biệt hoá của PLB, gia tăng tỷ lệ sống sót của những mẫu mô mỏng, giúp sự hình thành PLB tù ñỉnh phát hoa của những cây lan ñơn thân (Trần Văn Minh, 1999)

Trong nhiều công trình của mình, Stewardand Simmonds (1954) ñã chứng minh vai trò kích thích sự phân bào của tế bào lan khi bổ sung nước ép chuối Nước

ép trái chuối chứa nhiều cytokinin, auxin cũng như gibberellins, do vậy nhiều nghiên cứu ñã cho thấy nó hỗ trợ và kích thích sự ra rễ của hạt nảy mầm và chồi nuôi cấy Nước ép cà rốt chứa cytokinin, giàu chất khoáng (canxi và kali), vitamin (A, B1, B2, Cvà E) và glutamin ñược sử dụng kích thích sự phân chia tế bào của thực vật Dịch chiết khoai tây chứa nhiều tinh bột, ñường, khoáng Kali, vitamin và axít amin cũng ñã ñược sử dụng phổ biến làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay các

cơ quan nuôi cấy

* Than hoạt tính

Than hoạt tính có tác dụng hấp thu một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất sản sinh ra trong quá trình khử trùng hoặc một số phenol do cây trồng tiết ra Bổ sung thêm than hoạt tính vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tính có tác dụng hạn chế mức ñộ chiếu sáng và

nó có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ trong môi trường nuôi cấy (George, Sherrington, 1984)

* Các chất ñiều tiết sinh trưởng

Hiện nay, hai nhóm chất ñiều tiết sinh trưởng ñược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cây mô là auxin và xytokinin Sự cân bằng hàm lượng auxin và xytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết ñịnh sự phát sinh chồi hay rễ Auxin ñược sử dụng là IAA, 2,4D, α-NAA Còn Xytokinin có thể là kinetin, BAP hoặc nước dừa

Cytokinin ñược vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc Cytokinin có thể ở dạng tự do và dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác Ở trong cây chúng bị phân giải dưới tác dụng của enzyme tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê Các cytokinin tổng hợp ñược sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin (Edwin F Geogre, 1993)

Cytokinin có vai trò kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn ñến sự phân chia tế bào

Auxin là một hormone kích thích sinh trưởng có ở mô phân sinh chồi, lá,mầm và rễ Auxin có tác ñộng kích thích nhiều hoạt ñộng sinh trưởng làm trương giãn tế bào, tác ñộng ñến tính hướng ñất làm cho chồi ngọn và rễ chính sinh trưởng mạnh, ức chế sinh trưởng chồi bên, kích thích sự ra quả và tạo quả không hạt, ức chế

sự rụng Trong nuôi cấy mô thực vật muốn kích thích mô ra rễ người ta dùng auxin

Chất ñiều tiết sinh trưởng là các yếu tố hoá học cần thiết cho sự sinh trưởng

và phát triển của thực vật nói chung Nhưng ñối với cây hoa lan thì chất ñiều tiết sinh trưởng có hạn chế là gây biến dị mẫu cấy

2.2.4 Nhân giống in vitro

Theo Georger (1993) quá trình nhân giống in vitro bao gồm các bước sau:

* Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc các cây mẹ các cây này cần phải sạch bệnh, ñặc biệt là bệnh virut Việc trồng các cây mẹ trong ñiều kiện thích hợp với chế ñộ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy

* Nuôi cấy khởi ñộng:

Là giai ñoạn khử trùng ñưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai ñoạn này cần ñảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

Khi lấy mẫu cần chọn ñúng loại mô, ñúng giai ñoạn phát triển của cây Quan

trọng nhất là ñỉnh chồi ngọn, ñỉnh chồi nách và sau ñó là các ñỉnh chồi hoa và cuối cùng là ñoạn thân, mảnh lá…

* Nhân nhanh:

Là giai ñoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con ñường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất ñịnh và tạo phôi

vô tính

Vấn ñề là phải xác ñịnh ñược môi trường và ñiều kiện ngoại cảnh thích hợp

ñể có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế ñộ nuôi cấy thường là 25-270C và 16h chiếu sáng/ngày, cường ñộ ánh sáng 2000-4000 lux Tuy nhiên ñối với mỗi loại ñối tượng nuôi cấy ñòi hỏi có chế ñộ nuôi cấy khác nhau

* Tạo cây hoàn chỉnh

ðể tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường ñược bổ sung một lượng auxin Một số loại chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất ñiều tiết sinh trưởng

* Thích ứng cây in vitro ngoài ñiều kiện tự nhiên

ðể ñưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần ñảm bảo một số yêu cầu

- Cây trong ống nghiệm ñã ñạt ñược những tiêu chuẩn hình thái nhất ñịnh (số

lá, số rễ, chiều cao cây )

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

- Phải chủ ñộng ñiều chỉnh ñược ẩm ñộ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như chế ñộ dinh dưỡng phù hợp

2.3.1 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo trên thế giới

Một số kết quả ñạt ñược trong nhân giống một số loài Dendrobium bằng

phương pháp nuôi cấy mô (theo George, 1993)

Tên loài Mẫu cấy Kết quả Tác giả

D bigibbum

Lindl

Các ñoạn thân Tái sinh các chồi bên Kukylezanka and

Wojciechowska

D spp Các ngọn chồi Tạo protocorm và tăng

sinh nhanh protocorm

Tạo protocorm và tăng sinh nhanh protorm

Morel (1974)

D lacniosum ðỉnh sinh trưởng

của chồi ngọn và chồi bên

Tạo sự khởi ñầu và nhân nhanh tiền củ (protocorm)

D.Miss

Hawaii

Các mắt của cọng hoa

Tái sinh chồi từ mắt Nuraini and

Mohd.Shaib (1992)

Dendrobium là loài lan ñược kinh doanh phổ biến trong thị trường hoa lan trên

thế giới Một số phương pháp nuôi cấy phát sinh cụm chồi qua nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và phôi PLB ñã ñược báo cáo (Manorama và cs, 1986; Artidi và Ernst, 1993; Nayak và cs, 1997, 2002) Nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trong môi trường lỏng ñược ñặc biệt quan tâm do là một hệ thống nuôi cấy thích hợp nhân nhanh công nghiệp trong các hệ thống bioreactor (Zimmerman, 1993) Nuôi cấy hạt

Dendrobium ñầu tiên ñược Itsuhyko Ito thực hiện tại phòng thí nghiệm ðại học

Kyoto (Ito, 1966,1967)

Nhân giống qua nuôi cấy chồi ñỉnh: Nhân giống Dendrobium ñầu tiên ñược

thực hiện tại ðại học Hawaii (Sagawa và Shoji, 1967; Kim và cs, 1970) qua nuôi cấy chồi ñỉnh Lim-Ho (1981) nuôi cấy thành công tách rời Gandawijaja (1980) nuôi cấy

chồi ñỉnh Dendrobium phalaenopsis Fernando (1979) nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng

Dendrobium caesar Lip Singh (1976) nuôi cấy chồi ñỉnh Dendrobium Ng Eng

Cheo Soediono (1983b) nuôi cấy chồi ñỉnh Dendrobium jaquelyn Thomas ‘White’ Nhân giống qua nuôi cấy chồi bất ñịnh: Khaw và cs (1978a, 1978b) nuôi cấy chồi bất ñịnh Dendrobium Khaw và Ong (1974) nuôi cấy chồi bất ñịnh Aranda và

Dendrobium Alice trên môi trường VW Kukulczanka và Wojciechowska (1983)

nuôi cấy chồi bất ñịnh Dendrobium antennatum và Dendrobium phalaenopsis Nhân giống Dendrobium Joannie Ostenhault qua nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng:

Vasundhara (1990) nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng tách rời trên môi trường lỏng VW có

bổ sung 15% nước dừa, ñặt trong tối 48h, sau ñó ñưa ra sáng, tạo PLB PLB ñược cấy chuyển, nhân sinh khối và tái sinh thành chồi trên môi trường bán rắn VW có

bổ sung 15% nước dừa

Nhân giống Dendrobium qua nuôi cấy ñốt thân: Arditti và cs (1973), Mosich

và cs (1973, 1974a,b) nuôi cấy ñốt thân trên môi trường Knop, chồi xuất hiện sau

45 ngày nuôi cấy, chồi ñược tách rời và nuôi cấy ra rễ

Nhân giống Dendrobium crumenatum qua nuôi cấy mô lá: Phương pháp này

ñược ñược trường ðH Quốc Gia Singapore phát triển (Manorama và cs, 1986)

Gieo hạt Dendrobium crumenatum in itro, chồi tái sinh từ hạt tách lấy lá non Lá

non ñược cắt thành mảnh mỏng và nuôi cấy trong môi trường lỏng VW (lắc 80rpm)

có bổ sung 2,4D (5mg/l), NAA (5mg/l), BA (2mg/l) Mô sẹo hình thành sau 40 ngày nuôi cấy và tạo PLB sau 3 tháng nuôi cấy

Nhân giống Dendrobium moschatum qua nuôi cấy lát mỏng thân: Kanjilal và cs

(1999) nuôi cấy lát mỏng thân (dày 1-1,5mm) của chồi từ hạt in vitro trên môi trường lỏng KnudsonC (lắc 80-120rpm) có bổ sung 15% nước dừa, 2mg/l NAA và 3mg/l

BA tạo PLB Nuôi cấy tăng sinh và tái sinh PLB trên cùng môi trường bán rắn

Nhân giống Dendrobium sonia: Prasad và cs (2001) ñã nuôi cấy chồi ñỉnh trên

môi trường MS có bổ sung 1mg/l NAA và 1mg/l BA hình thành cụm chồi sau 25 ngày nuôi cấy, với 11 chồi/mẫu

Nghiên cứu sự tạo mô sẹo trên Dendrobium cho thấy: mô sẹo sinh trưởng

chậm, dễ bị hoại tử trong quá trình nuôi cấy ñược ghi nhận (Chang và Chang 1998;

Lin và cs, 2000; Roy và Banerjee, 2001) Hơn nữa môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo

có bổ sung Auxin, cytokinin, nước dừa cho kết quả khả quan (Yam và cs, 1991, Arditti và Ernst 1993) và duy trì mô sẹo (Ishii và cs, 1998; Lin và cs, 200; Chen và Chang 2000; Huan và cs, 2004) Tuy nhiên nuôi cấy kéo dài trong môi trường có chất kích thích sinh trưởng dẫn ñến biến tính tế bào soma (Vazquez, 2001) và cần ñiều khiển Auxin và xytokinin thích hợp trong tái sinh mô sẹo hình thành chồi và PLB (Roy và cs, 2007)

Chung và cs (2007) thành công trong nuôi cấy phát sinh phôi vô tính trực tiếp

từ lá giống hoa lan Dendrobium Chiengmai Pink ñã nghiên cứu ảnh hưởng của 4

loại auxin (2,4D; NAA; IBA; IAA) và 5 loại cytokinin (Ki, BA, 2ip, TDZ, zeatin) trên môi trường 1/2MS ñến sự tạo mô sẹo trực tiếp ghi nhận auxin không ảnh hưởng ñến sự hình thành phôi vô tính trong tối và ngoài sáng sau 60 ngày nuôi cấy; phôi phát sinh tốt với 1mg/l TDZ với 5-25% mẫu nuôi cấy tạo phôi và ñạt 33,6 phôi/mẫu; phôi thứ cấp phát sinh trên vết cắt bản lá và có tần suất tạo phôi cao ñể trong tối; NAA (0-0,1-1mg/l) kết hợp TDZ (0-0,3-3mg/l) nâng cao hiệu suất thành phôi; chồi tái sinh từ phôi dễ dàng trên môi trường 1/2MS không chất kích thích sinh trưởng và có tỷ lệ sống cao khi thuần hóa

Roy và cs (2007) ñã thành công trong nghiên cứu nhân giống Dendrobium qua con ñường nuôi cấy tạo mô sẹo và tái sinh PLB Dendrobium chrysotoxum Lindl

Trên môi trường MS, tần suất tạo mô sẹo cao với µM TDZ hay BA; mô sẹo tạo PLB

và chưa thấy xuất hiện biến tính tế bào soma sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng; tuy nhiên sự hình thành PLB phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ cytikinin và auxin và kỹ thuật nuôi cấy, BA kích thích sinh trưởng

mô sẹo và tăng sinh PLB; TDZ gây hoại tử mô sẹo, NAA không tác ñộng mạnh lên quá trình tạo mô sẹo nhưng ảnh hưởng ñến quá trình cấy truyền mô sẹo; hệ số tăng sinh mô sẹo khi bổ sung 0,5mg/l NAA là 69 lần sau 3 tháng nuôi cấy; tái sinh sẹo ñạt hiệu quả cao nhất 133 PLB/100mg mô sẹo với môi trường bổ sung 1µM NAA, sự tái sinh và hình thành PLB PLB phụ thuộc vào loại và nồng ñộ cytokinin sử dụng

PLB Dendrobium ñược sử dụng làm nguyên liệu nuôi cấy chuyển gen trong

Janna và cs, 2006)

Khi gieo hạt một số loài Dendobium sp Luan và cs (2006) ñã bổ sung 0,5mg/l

NAA kích thích sự nảy mầm và phát sinh protocorm khi gieo hạt lan trên nền môi trường MS

Anjum S, (2006) nghiên cứu trên lan Dendobium malones ñã tái sinh protocorm

từ mẫu lá trên môi trường MS + 1,0mg/l Kinetin + 0,5mg/l NAA và protocorm sau khi ñược hình thành ñược cấy chuyển lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,0mg/l BAP ñể phát sinh hình thái và thu ñược số lượng protocorm nhiều nhất

2.3.3 Tình hình nuôi cấy mô lan Hoàng Thảo ở Việt Nam

Theo tác giả Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (2001) kết luận MS là môi

trường nuôi cấy cơ bản thích hợp cho nhân giống lan Dendrobium in vitro, 1mg/l

BA+ 0,1mg/l IBA là tổ hợp chất ñiều tiết sinh trưởng thích hợp cho nhân protocorm chi lan này Hàm lượng nước dừa 15% là chất hữu cơ bổ sung hữu hiệu nâng cao

hiệu quả phát sinh chồi trong quá trình nhân giống hoa lan Dendrobium Môi trường

MS + 0,1mg/l BA + 20%ND là môi trường tổ hợp các chất ñiều tiết sinh trưởng và chất hữu cơ bổ sung ñạt hiệu quả cao trong tái sinh chồi và chiều cao của chồi lan

Dendrobium in vitro

Theo Trịnh Cẩm Tú, Bùi Trang Việt (2006) sự ra hoa của Dendrobium sp

liên quan ñến sự chuyển tiếp mô phân sinh tạo lá và thân sang mô phân sinh tạo hoa Mô phân sinh hoa tự là vị trí phát sinh cơ quan liên tục với một vùng nhỏ các tế bào gốc ña năng ðời sống và hoạt ñộng của mô phân sinh hoa tự liên quan ñến số

nụ hoa trên hoa tự ñược quan sát bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường MA có bổ sung zeatin 1mg/l, AIA 0,5mg/l và GA3 1mg/l Với BA 5mg/l, mô phân sinh hoa tự của phát hoa tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vì tiếp tục tạo phát hoa

Theo Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du (2007) có thể sử dụng ánh sáng tự nhiên như một giải pháp tiết kiệm ñiện máy lạnh và ñèn chiếu sáng ñể nuôi cấy

phong lan Dendrobium Dendrobium có tốc ñộ lớn nhanh và khi sử dụng tinh bột

thay cho ñường tỷ lệ nhiễm giảm Lượng agar dùng làm ñông môi trường giảm ñi Trong ñiều kiện ánh sáng tự nhiên chiếu mạnh cây có sắc tố tím ñỏ Kết quả nghiên

cứu cho thấy ở môi trường ánh sáng tự nhiên việc sử dụng carbohydrat ở dạng tinh bột tốt hơn so với dùng ñường Kể từ ngày 30 trở ñi bắt ñầu ghi nhận ñược sự khác biệt với cây sống trên môi trường chứa ñường Trong vòng 60 ngày, thời gian nuôi cấy càng kéo dài về sau thì sự vượt trội càng rõ rệt

Bùi Thị Tường Thu, Trần Văn Minh (2007) sử dụng môi trường VW bổ sung

BA, NAA, kinetin, TDZ, nước dừa, ñường sucrose nuôi cấy phát sinh và tăng sinh

tế bào soma, phát sinh và tái sinh phôi giả (PLB) của cây hoa lan Dendrobium

Nguyễn Thị Mỹ Duyên, 2006 ñã ñưa ra qui trình vi nhân giống lan

Dendrobium anosmum Quả lan sau khi ñược tự thụ 4 tháng, khử trùng và gieo cấy

hạt vào môi trường sau 3 tháng gieo cấy tỷ lệ nảy mầm ≥ 85% trên môi trường MS + 1 mg/l NAA và môi trường MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA Chồi lan Dendrobium anosmum phát triển tốt nhất trên môi trường MS + 2mg/l BA, ở thời gian 3 tháng sau khi cấy ñạt HSN chồi 3,17lần, chồi cao 20,6 mm Chồi lan tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS + 1 mg/l NAA Sau 3,5 tháng tạo ñược cây hoàn chỉnh, ñạt tiêu chuẩn ñể ñưa ra ngoài vườn ươm

Qui trình vi nhân giống lan Dendrobium mini thì chồi lan phát triển tốt trên

môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA Và sau 2 tháng nhân chồi ñạt HSN là 3,8 chồi, chồi cao 1,26cm Môi trường MS/2 + 0,2 mg/l NAA cho kết quả ra rễ tốt và sau 2 tháng chồi lan tạo rễ hình thành cây hoàn chỉnh ñể ñưa ra vườn ươm Khi thích ứng cây ra vườn ươm trên nhiều loại giá thể khác nhau thì thấy rằng ñối với lan Dendrobium mini trong giai ñoạn ñầu nuôi trồng (từ cây mới ra mô ñến khi cây ñược 7,5 tháng tuổi) thì giá thể thích hợp nhất cho cây là dớn và dừa miếng

Nguyễn Văn Song và cs, 2011 ñề xuất khi nhân in vitro lan Dendrobium

chrysotoxum thì nguyên liệu là quả lan 3 tháng tuổi Môi trường thích hợp cho nảy

mầm và phát sinh protocorm là môi trường MS + 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất là MS + 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 2,0 mg/l BAP Môi trường MS + có 30 g/l sucrose, 8 g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 15% nước dừa, 2,0 mg/l BAP và 1,0 mg/l NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro Môi trường MS + 20 g/l sucrose, 8 g/l agar, 15% nước dừa và 1,0 mg/l NAA là

thích hợp cho tạo rễ của chồi in vitro

Vũ Ngọc Lan và cs, 2011 ñã ñưa ra quy trình nhân giống in vitro giống lan

Thạch hộc (D.nobile Lindl.) môi trường nhân cụm protocorm là KnudsonC (1965) +

100ml nước dừa + 10g saccharoza + 60g khoai tây/lít môi trường, trong 2 tháng cho

hệ số nhân ñạt 4,2 lần Nhân nhanh cụm chồi trên môi trường MS (1962) + 100ml nước dừa + 30g sacroza + 60g chuối chín, sau 2 tháng nuôi cấy cho hệ số nhân 3,15 lần và tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RE + 10g sacroza + 0,5g than hoạt tính Tóm lại: Chúng tôi ñã có tổng quan nghiên cứu về chi lan Hoàng Thảo

(Dendrobium) nói chung và lan Dendrobium fimbriatum Hook nói riêng Ở nước ta

việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô ñể nhân giống cây lan

Dendrobium fimbriatum Hook là hoàn toàn mới Các nghiên cứu mới chỉ ñược thực

hiện trong thời gian gần ñây ở Việt Nam trên một số ñối tượng kể trên và chưa có

cơ quan, tác giả nào thực nghiên cứu trên cây lan Dendrobium fimbriatum Hook ðể góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen cây lan Dendrobium fimbriatum Hook

ñang có nguy cơ bị tuyệt chủng thì việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống

in vitro lan Dendrobium fimbriatum Hook là việc làm cấp thiết và có ý nghĩa

3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tên la tinh: Dendrobium fimbriatum Hook

Tên Việt Nam: Hoàng thảo long nhãn, Kim ðiệp, Mã tiên thạch hộc, Long nhãn Nguồn mẫu từ Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðH Nông Nghiệp Hà Nội nghiên cứu thu thập tại Lai Châu

- Mẫu thí nghiệm: Chồi và quả lan Dendrobium fimbriatum Hook

- Môi trường: Murashige & Shoog (1962), Vacin & Went (1949), Knudson C (1965), Robert Ernst (1979)

- Các dịch chiết hữu cơ tự nhiên: Nước dừa, táo, chuối, khoai tây, cà rốt … Cách làm dịch chiết: quả táo ñỏ, cà rốt ñể cả vỏ rửa sạch, chuối tiêu chín bỏ

vỏ xay nhỏ mịn riêng từng loại; khoai tây ñể cả vỏ rửa sạch luộc chín dùng cả nước luộc xay nhỏ mịn

- Các loại chế phẩm dinh dưỡng qua lá:

Yogen (N:30%, P2O5hh: 10%, K2O:10%, trung – vi lượng: 2760ppm), Komix (N = 16,30%, Zn = 100ppm, P2O5 = 5,4%, B = 100ppm, K2O = 1,55%, M = 200ppm),

Antonic (Sodium - S - Nitrogualacolate 0,03 %, Sodium - O - Nitrophenolate 0,06 %, Sodium - P - Nitrophenolate 0,09 %),

Growmore (N: 30%; P2O5: 10%; K2O: 10%; Ca:0,05%; Mg: 0,1%; S: 0,2%; B: 0,02%; Cu: 0,05%; Fe: 0,10%; Zn: 0,05%)

- Giá thể: Bột dừa, xơ dừa, than củi

Nghiệp Hà Nội – Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội

3.2.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Nghiên cứu khử trùng, chọn nguồn vật liệu ban ñầu ñưa và

nuôi cấy khởi ñộng loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu phương pháp khử trùng chồi (keiki)

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu phương pháp khử trùng quả loài lan Dendrobium

fimbriatum Hook

Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ñến

giai ñoạn khởi ñộng mẫu tạo vật liệu ban ñầu loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Nội dung 2 Nhân nhanh in vitro loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Nội dung 2.1 Nhân nhanh protocorm

Thí nghiệm 4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến khả

năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 5 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng ñường ñến khả năng

nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ

sung vào môi trường nuôi ñến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium

fimbriatum Hook

Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng khoai tây ñến khả năng nhân nhanh protocorm loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Nội dung 2.2 Nhân nhanh cụm chồi

Thí nghiệm 8 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 9 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng ñường ñến khả năng

nhân nhanh cụm chồi loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 10 Nghiên cứu ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên bổ

sung vào môi trường nuôi ñến khả năng nhân nhanh cụm chồi loài lan Dendrobium

fimbriatum Hook

Thí nghiệm 11 Nghiên cứu ảnh hưởng của các hàm lượng chuối chín ñến

khả năng nhân nhanh cụm chồi loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Nội dung 3.Tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 12 Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường nuôi cấy ñến sinh

trưởng chồi loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 13 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) ñến khả

năng sinh rễ của chồi loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 14 Nghiên cứu ảnh hưởng của cường ñộ chiếu sáng tới sinh

trưởng chồi loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Nội dung 4 Thích ứng cây in vitro tại vườn ươm

Thí nghiệm 15 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ñến tỷ lệ sống và chất

lượng cây con ngoài vườn ươm loài lan Dendrobium fimbriatum Hook

Thí nghiệm 16 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chế phẩm dinh dưỡng qua lá ñến

chiều cao cây và số lá trên cây lan Dendrobium fimbriatum Hook ngoài vườn ươm

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu khử trùng, chọn nguồn vật

liệu ban ñầu ñưa và nuôi cấy khởi ñộng loài lan Dendrobium fimbriatum

Hook

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu xác ñịnh phương pháp khử trùng chồi (keiki)

trong 1 phút, tráng sạch lại bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch HgCl2

0,1% trong 3 phút, tráng sạch lại bằng nước cất vô trùng, tách bỏ bớt phần lá bao bên ngoài, ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 1 phút, tráng sạch lại bằng nước cất vô trùng Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu

+ CT2: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch cồn 700trong 1 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch H2O2 2% trong 5 phút, tráng sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng, tách bỏ bớt phần lá bao bên ngoài, ngâm trong dung dịch H2O2 2% trong 2 phút, tráng sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu

+ CT3: Tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch cồn 700trong 1 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch H2O2 2% trong 5 phút, tráng sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng, tách bỏ bớt phần lá bao bên ngoài, ngâm trong dung dịch HgCl2 trong 1 phút, tráng sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng Cấy mẫu vào trong môi trường nuôi mẫu là môi trường MS + 100ml ND/lít môi trường+10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường Thí nghiệm trên mẫu chồi cây với 3 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 30 mẫu/công thức

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu phương pháp khử trùng quả của loài lan

Dendrobium fimbriatum Hook

+ CT1: Tráng sạch quả bằng nước cất vô trùng, nhúng quả trong dung dịch cồn

960 hơ trên ngọn lửa ñèn cồn Cắt, rạch quả và gieo hạt trên môi trường nuôi cấy + CT2: Tráng sạch quả bằng nước cất vô trùng, ngâm rửa trong dung dịch cồn

960, tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch H2O2 2% trong 5 phút, tráng sạch nhiều lần bằng nước cất vô trùng Cắt, rạch quả và gieo hạt trên môi trường nuôi cấy

+ CT3: Tráng sạch quả bằng nước cất vô trùng, ngâm rửa quả trong dung dịch cồn 960, tráng sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 phút, tráng sạch quả nhiều lần bằng nước cất vô trùng Cắt, rạch quả và gieo hạt trên môi trường nuôi cấy là môi trường MS + 100ml ND/lít môi trường + 10g sacaroza/lít môi trường + 6g agar/lít môi trường

Thí nghiệm trên mẫu quả với 3 công thức, bố trí 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 3 quả/công thức