b, Giá trị sử dụng của loài Dendrobium fimbriatum Hook.
2.2.3 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường ựến sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy
của mẫu cấy
Theo Nguyễn Quang Thạch (2009) thì ngay từ những giai ựoạn ựầu của sự phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật tùy thuộc ựối tượng nghiên cứu, mục ựắch nghiên cứu khác biệt ựòi hỏi phải có những môi trường dinh dưỡng thắch hợp
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 16
khác nhaụ Dựa vào thành phần và hàm lượng chất dinh dưỡng vô cơ có thể phân các nhóm môi trường nuôi cấy thành bốn nhóm:
- Nhóm môi trường giàu dinh dưỡng: đại diện là môi trường MS (Murashige Ờ Skoogs, 1962) (Lê Xuân Lương, 2005). Nhóm môi trường này có hàm lượng muối khoáng cao, nhất là muối nitrat, amon, kali, các nguyên tố vi lượng ựầy ựủ. Môi trường thuộc nhóm này thắch hợp hầu hết các loại và ựối tượng nuôi cấỵ
- Nhóm môi trường ựủ dinh dưỡng: đại diện là các môi trường N6, B5, SH. Nhóm này có hàm lượng dinh dưỡng ựa lượng và vi lượng thấp hơn môi trường MS nhưng ựặc biệt có hàm lượng natri kali cao
- Nhóm môi trường nghèo dinh dưỡng: ựại diện cho nhóm này là môi trường Nitsch, Knop, KnudsonC
- Nhóm môi trường thắch hợp ựể nuôi cấy các cây thân gỗ: môi trường WPM, DKWẦ
Môi trường dinh dưỡng bao gồm khoáng ựa lượng, nguồn các bon, viamin và chất ựiều tiết sinh trưởng. Một số thành phần khác có thể ựược bổ sung thêm như nitơ vô cơ, axắt vô cơ và dịch chiết trái cây (Gamborg, 1986)
* Khoáng ựa vi lượng
Các chất khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô ựều ở dạng các muối vô cơ, cây lan có thể thắch nghi phổ rộng các hỗn hợp muối vô cơ.
Các muối khoáng ựược sử dụng như là thành phần của môi trường nuôi cấy mô tế bàọ Hầu hết các môi trường chứa ắt nhất 30mM nitơ vô cơ và Kali vô cơ. Muối amonium có thể ựược sử dụng từ 2-20mM trong môi trường. Nồng ựộ Ca,
SO4, photphat và muối Mg thay ựổi từ 1-3mM là thắch hợp
đạm là thành phần của acid nucleic ựóng vai trò quan trọng trong trao ựổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh tế bào (Moxolov, 1987), do ựó có ảnh hưởng trực tiếp ựến sự sinh trưởng và phát triển của câỵ đạm ựược sử dụng
trong nuôi cấy thường là dạng ammoium (NH4+) và nitrate (NO3-).
Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp Protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng. Lân thường ựược sử dụng ở hai dạng ion là
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 17
HPO42- và H2PO4-.
Nồng ựộ khoáng ựa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ thường giảm xuống còn một nửa so với bình thường (tùy thuộc loài cây). Nguyên nhân có lẽ do nhu cầu về ựạm trong giai ựoạn này giảm xuống (Nguyễn đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
* Vitamin
Thực vật cần vitamin ựể xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau, các vitamin thường ựược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamine HCl (B1); Pyridoxine HCl (B6); Acid Nicotinic; Myo-inositol (Nguyễn đức Lương và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)
* Nguồn sắt
Hiện nay hầu hết các phòng thắ nghiệm ựều dùng sắt ở dạng chelate kết hợp
với Na2-Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và
giải phóng dần ra môi trường theo nhu cầu của mô thực vật (Trần Văn Minh, 1999).
* Nguồn carbon
Nguồn carbon (Sucrose; Glucose hoặc Fructose) là một thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho rằng sự hiện diện của ựường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao cây con. Nồng ựộ sucrose (20 Ờ 30g/l) thường ựược thêm vào môi trường ựể ựẩy mạnh tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. Theo Debergh (1991), sự vắng mặt của ựường làm giảm các vấn ựề về nhiễm môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng tự dưỡng trong ựiều kiện in vitro
khi nồng ựộ CO2 và mật ựộ ánh sáng tăng lên.
* Các chất hữu cơ tự nhiên
Có một lượng lớn những chất hữu cơ tự nhiên ựược bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro hoa lan như peptone, nước ép carot, khoai tây, táo, dịch chiết chuối, nước dừaẦNhững hợp chất tự nhiên này hỗ trợ rất tốt quá trình hình phát triển của cây nuôi cấy mô. Nước dừa với thành phần phức tạp chứa nhiều chất dinh dưỡng và hormonẹ Nó có tác ựộng thúc ựẩy sự tăng trưởng rõ rệt ựối với nhiều loại
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 18
mô cấy thực vật khác nhaụ Nó dễ dàng phối hợp với các thành phần trong môi trường nuôi cấy, không mất hoạt tắnh khi hấp khử trùng hay khi tiếp xúc với các ựiều kiện nuôi cấy trong khoảng thời gian ngắn. Nó thường ựược thêm vào môi trường nuôi cấy mô hoa lan ựể kắch thắch tạo mô sẹo và protocorm và thường ựược sử dụng ở dãy nồng ựộ từ 10- 25% về thể tắch. Ngoài ra, nước dừa cũng giữ vai trò quan trọng trong sự ựiều hoà biệt hoá của PLB, gia tăng tỷ lệ sống sót của những mẫu mô mỏng, giúp sự hình thành PLB tù ựỉnh phát hoa của những cây lan ựơn thân (Trần Văn Minh, 1999).
Trong nhiều công trình của mình, Stewardand Simmonds (1954) ựã chứng minh vai trò kắch thắch sự phân bào của tế bào lan khi bổ sung nước ép chuốị Nước ép trái chuối chứa nhiều cytokinin, auxin cũng như gibberellins, do vậy nhiều nghiên cứu ựã cho thấy nó hỗ trợ và kắch thắch sự ra rễ của hạt nảy mầm và chồi nuôi cấỵ Nước ép cà rốt chứa cytokinin, giàu chất khoáng (canxi và kali), vitamin (A, B1, B2, Cvà E) và glutamin ựược sử dụng kắch thắch sự phân chia tế bào của thực vật. Dịch chiết khoai tây chứa nhiều tinh bột, ựường, khoáng Kali, vitamin và axắt amin cũng ựã ựược sử dụng phổ biến làm tăng sự phát triển của mô sẹo hay các cơ quan nuôi cấỵ
* Than hoạt tắnh
Than hoạt tắnh có tác dụng hấp thu một số chất không có lợi cho sự phát triển của cây như các chất sản sinh ra trong quá trình khử trùng hoặc một số phenol do cây trồng tiết rạ Bổ sung thêm than hoạt tắnh vào môi trường có thể có lợi cho việc hình thành rễ của cây do than hoạt tắnh có tác dụng hạn chế mức ựộ chiếu sáng và nó có khả năng hấp thụ các chất ức chế sự ra rễ trong môi trường nuôi cấy (George, Sherrington, 1984)
* Các chất ựiều tiết sinh trưởng
Hiện nay, hai nhóm chất ựiều tiết sinh trưởng ựược sử dụng nhiều nhất trong nuôi cây mô là auxin và xytokinin. Sự cân bằng hàm lượng auxin và xytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết ựịnh sự phát sinh chồi hay rễ. Auxin ựược sử dụng là IAA, 2,4D, α-NAẠ Còn Xytokinin có thể là kinetin, BAP hoặc nước dừạ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 19
Cytokinin ựược vận chuyển trong cây không phân cực như auxin, có thể vận chuyển theo hướng ngọn và hướng gốc. Cytokinin có thể ở dạng tự do và dạng liên kết tương tự như các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải dưới tác dụng của enzyme tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các cytokinin tổng hợp ựược sử dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô là kinetin và benzyladenin (Edwin F. Geogre, 1993)
Cytokinin có vai trò kắch thắch phân chia tế bào mạnh mẽ. Vì vậy người ta xem chúng như là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, nguyên nhân là do cytokinin hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp axit nucleic và protein dẫn ựến sự phân chia tế bàọ
Auxin là một hormone kắch thắch sinh trưởng có ở mô phân sinh chồi, lá,mầm và rễ. Auxin có tác ựộng kắch thắch nhiều hoạt ựộng sinh trưởng làm trương giãn tế bào, tác ựộng ựến tắnh hướng ựất làm cho chồi ngọn và rễ chắnh sinh trưởng mạnh, ức chế sinh trưởng chồi bên, kắch thắch sự ra quả và tạo quả không hạt, ức chế sự rụng. Trong nuôi cấy mô thực vật muốn kắch thắch mô ra rễ người ta dùng auxin.
Chất ựiều tiết sinh trưởng là các yếu tố hoá học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật nói chung. Nhưng ựối với cây hoa lan thì chất ựiều tiết sinh trưởng có hạn chế là gây biến dị mẫu cấỵ