4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1Nghiên cứu khử trùng, chọn nguồn vật liệu ban ựầu và nuôi cấy khởi ựộng mẫu loài lan Dendrobium fimbriatum Hook.
ựộng mẫu loài lan Dendrobium fimbriatum Hook.
Thắ nghiệm 1: Nghiên cứu phương pháp khử trùng chồi (keiki)
Tạo nguồn vật liệu ban ựầu là một khâu hết sức quan trọng quyết ựịnh sự thành công trong việc nuôi cấy mô. Vật liệu khởi ựầu phải ựược khử trùng ựể ựược ựảm bảo sản phẩm tạo ra khi nuôi cấy là sạch nấm bệnh, khuẩnẦ Nguyên tắc của giai ựoạn vào mẫu là phải ựảm bảo mẫu nuôi cấy sạch và có khả năng phát sinh hình tháị Các yếu tố ảnh hưởng ựến tỷ lệ sạch và tỷ lệ sống của mẫu là nguồn mẫu, hoá chất khử trùng và thời gian khử trùng. Nếu dung dịch khử trùng không có tắnh sát trùng cao thì mẫu vào sẽ tỷ lệ bị nhiễm caọ Còn nếu thời gian khử trùng quá ắt thì mẫu sẽ không sạch, còn thời gian quá dài thì mẫu sẽ bị tổn thương và chết.
Phương pháp nhân giống in vitro sử dụng chồi cây làm vật liệu khởi ựầu có ưu ựiểm cây con vẫn giữ ựược ựặc tắnh di truyền của cây mẹ, hệ số nhân giống cao hơn so với các phương pháp nhân giống vô tắnh truyền thống. Tuy nhiên, do chồi ựược lấy ngoài tự nhiên nên cần phải khử trùng ựảm bảo cho mẫu ựưa vào nuôi cấy sạch, có khả năng phát sinh hình tháị
Chắnh vì vậy, chúng tôi tiến hành thắ nghiệm nghiên cứu chế ựộ khử trùng ựối với chồi cây của loài lan nghiên cứu và cấy trên nền môi trường MS + 100ml ND/lắt
môi trường +10g sacaroza/lắt môi trường + 6g agar/lắt môi trường. Trên cơ sở các
kết quả ựã nghiên cứu trên lan Hoàng Thảo (Dendrobium sp.), chúng tôi chọn khử
trùng trên 3 công thức và kết quả ựược trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ựến khả năng sống, vô trùng của chồi lan (sau 6 tuần)
Chỉ tiêu CT Tỷ lệ mẫu chết (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu sống, vô trùng (%) CT1 (HgCl2 (0,1%) 3 phút + 1 phút) 43,33 46,67 10,0 CT2 (H2O2 (2%) 5 phút + 2 phút) 26,67 66,67 6,67 CT3 (H2O2 (2%) 5 phút + HgCl2 (0,1%) 1 phút) 56,67 40,0 3,33
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 39 0 10 20 30 40 50 60 70 80 chết (%) nhiễm (%) sống (%) CT1 CT2 CT3
Hình 4.1: Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng ựến chồi loài lan
Dendrobium fimbriatum Hook.
Hình 4.2. Hình thái chồi cây sau khử trùng
Kết quả bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy: Các công thức thắ nghiệm nghiên cứu
chế ựộ khử trùng chồi với loài lan Hoàng thảo Dendrobium fimbriatum Hook. ựã
tiến hành cho kết quả không khả quan. Sau 6 tuần theo dõi, công thức 1 (Ngâm chồi
trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 3 phút, rửa sạch bằng nước cất vô trùng (3lần),
tách bỏ bớt phần lá bao bên ngoài, ngâm trong dung dịch HgCl2 0,1% trong 1 phút,
rửa sạch bằng nước cất vô trùng (3 lần) có kết quả tốt hơn so với các công thức còn lại tuy nhiên tỷ lệ mẫu sống cũng chỉ ựạt 10%.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 40
Phương pháp khử trùng mẫu chồi ựã tiến hành cho kết quả không khả quan khi công sức và hóa chất bỏ ra nhiều, nguồn mẫu ựưa vào thắ nghiệm cũng nhiều mà lượng mẫu sạch thu ựược lại ựược rất thấp. Nguyên nhân do trên cây phong lan rừng là loại cây sống cộng sinh với nhiều loại vi sinh vật, nên trên những cây lan rừng luôn luôn tồn tại một hệ vi sinh vật phong phú ựa dạng phân giải các hợp chất hữu cơ do ựó tiềm ẩn trong bản thân chúng cũng có hệ vi sinh vật khó có thể loại trừ. Qua thực tiễn nghiên cứu chúng tôi thấy phương pháp khử trùng mẫu bằng chồi cây loài này là khó tiến hành thậm chắ các lần cấy chuyển tiếp theo hệ vi sinh vật tiềm ẩn trong chồi lại phát triển gây nhiễm tự phát nên rất khó kiểm soát. để giải quyết vấn ựề tái nhiễm này chúng tôi phải tiến hành khử trùng liên tục như vậy sẽ gây tốn kém về kinh tế và gây tổn thương ựối với mẫu cấy, ảnh hưởng không tốt ựến chất lượng sinh trưởng cây sau nàỵ Do ựó, chúng tôi ựã thay ựổi nguồn mẫu ban ựầu khi ựưa vào nuôi cấy mô, tiến hành bố trắ thắ nghiệm khử trùng mẫu quả thay cho mẫu chồị
Thắ nghiệm 2. Nghiên cứu phương pháp khử trùng quả loài lan
Dendrobium fimbriatum Hook.
Hạt lan phát triển rất kém ngay khi quả ựã chắn, chúng phụ thuộc vào sự nhiễm nấm ựể nảy mầm và phát triển trong tự nhiên. Phương pháp nuôi cấy không cộng sinh ựược phát triển nghiên cứu của Knudson (1922), hạt lan có thể nảy mầm trên môi trường khoáng có ựường. Ở nhiều nước trên thế giới, phương thức nảy mầm hạt lan in vitro là một phần quan trọng của trương trình bảo tồn và nhân giống các loài lan quý hiếm, cung cấp cây con cho chương trình phục hồi tái sinh rừng (McKendrick, 2000).
Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới trên ựã công bố kết quả nghiên cứu khử trùng mẫu quả của các giống lan (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004; Phạm Thị Kim Hạnh và cộng sự, 2009). Kế thừa các kết quả ựó chúng tôi tiến hành khử trùng quả lan theo 3 công thức và cấy trên nền môi trường MS + 100ml ND/lắt môi trường + 10g sacaroza/lắt môi trường + 6g agar/lắt môi trường. Các thắ nghiệm khử trùng quả lan ựều cho kết quả tối ưu, tỷ lệ mẫu sống vô trùng ựạt 100%.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 41
Sau 6 tuần theo dõi protocorm cảm ứng hình thành từ gieo hạt có màu xanh, kắch thước tọ Trong ựó, công thức khử trùng 1 (Nhúng quả vào cồn 96Ứ trong 1 phút rồi hơ trên ngọn lửa ựèn cồn) tỏ ra có nhiều ưu ựiểm hơn hẳn các công thức còn lại vì khử trùng qua ắt công ựoạn, dễ thực hiện. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng quả ựến tỷ lệ mẫu sống và hình thái protocorm của loài lan Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 6 tuần)
Chỉ tiêu CT Tỷ lệ mẫu sống có phát sinh protocorm (%) Hình thái protocorm CT1 (đốt bằng cồn 960 trong 1 phút ) 100 ++ CT2 (Cồn 960 1 phút + H2O2 (2%) 5 phút) 100 ++ CT3 (Cồn 960 1 phút + HgCl2 (0,1%) 5 phút) 100 ++
Ghi chú: ++ Kắch thước protocorm ựồng ựều, màu sắc xanh của protocorm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cả 3 công thức ựều cho kết quả tối ưu như nhau nhưng xét hiệu quả, các
công ựoạn thao tác thì CT1 (ựốt bằng cồn 960 trong 1 phút) là tốt nhất. Sau 6 tuần
nuôi cấy trên loài lan nghiên cứu thì 100% hạt ựược gieo trên môi trường MS + 100ml ND/lắt môi trường + 10g sacaroza/lắt môi trường + 6g agar/lắt môi trường phát sinh protocorm.
Như vậy, ựối với loài lan Hoàng Thảo Dendrobium fimbriatum Hook. thì
chọn nguồn vật liệu ban ựầu là quả lan và chế ựộ khử trùng tối ưu là nhúng quả
trong cồn 960 rồi hơ trên ngọn lửa ựèn cồn trong 1 phút.
Thắ nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ựến giai ựoạn khởi ựộng mẫu tạo vật liệu ban ựầu loài lan Dendrobium
fimbriatum Hook.
Ở thắ nghiệm 1 và thắ nghiệm 2 chúng tôi ựã xác ựịnh ựược chế ựộ khử trùng tối ưu và nguồn vật liệu ban ựầu ựưa vào nuôi cấy mô của loài lan nghiên cứụ Bước tiếp theo chúng tôi tiến hành thắ nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất
tự nhiên ựến giai ựoạn khởi ựộng mẫu tạo vật liệu banựầụ Các công thức ựều ựược
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 42
thêm một loại dịch chiết hữu cơ tự nhiên khác nhaụ Kết quả thắ nghiệm ựược trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của các dịch chiết hữu cơ tự nhiên ở giai ựoạn nuôi cấy khởi ựộng ựến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy trên loài
Dendrobium fimbriatum Hook. (Sau 6 tuần)
Chỉ tiêu CT Tỷ lệ hạt tạo chồi Tỷ lệ hạt tạo protocorm Hình thái protocorm CT1: đC 0 100 ++
CT2: đC + 60g khoai tây/lắt môi trường 0 100 +++
CT3: đC + 60g cà rốt/lắt môi trường 0 100 ++
CT4: đC + 60g táo/lắt môi trường 0 100 ++
CT5: đC + 60g chuối/lắt môi trường 0 100 ++
Ghi chú: đC = Môi trường MS + 100ml ND/ắt môi trường + 10g sacaroza/lắt môi trường + 6g agar/lắt môi trường.
+++, ++ Kắch thước protocorm to, ựồng ựều, màu sắc xanh của protocorm
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43
Qua bảng 4.3 chúng tôi thấy: Ở 4 công thức thắ nghiệm (CT2, CT3, CT4, CT5) khi bổ sung các loại dịch chiết khác nhau (khoai tây, cà rốt, táo, chuối) vào môi trường gieo hạt thì tỷ lệ mẫu phát sinh protocorm không có sai khác so với công thức ựối chứng (không bổ sung dịch chiết hữu cơ tự nhiên). Ở tất cả các công thức tỷ lệ mẫu phát sinh protocorm ựều ựạt 100%, tuy nhiên ở CT2 các protocorm ựồng ựều và kắch thước to hơn so với protocorm ựược phát sinh ở các công thức khác.
Sau 6 tuần theo dõi chúng tôi không thấy có sự sai khác rõ rệt về hiệu quả giữa các công thức ựược bổ sung các loại dịch chiết hữu cơ tự nhiên về khả năng phát sinh protocorm của mẫu hạt lan ở giai ựoạn nuôi cấy khởi ựộng.
Vậy ựối với giai ựoạn khởi ựộng mẫu hạt lan Dendrobium fimbriatum Hook.
chỉ cần sử dụng môi trường đC là môi trường MS+ 100ml ND/lắt môi trường+ 10g
sacaroza/lắt môitrường + 6g agar/lắt môi trường là tối ưụ