luận văn thạc sĩ nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HOÀNG ĐỨC AN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG TRONG CHĂN NUÔI HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH MÃ SỐ: 60.54.10 NHA TRANG, 8/2008 2 MỤC LỤC MỤC LỤC 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5 DANH MỤC CÁC BẢNG 6 DANH MỤC CÁC HÌNH 7 MỞ ĐẦU 9 PHẦNI.TỔNGQUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 10 1.1.1. Chế phẩm sinh học là gì ? 10 1.1.2. Thành phần của chế phẩm sinh học 11 1.1.3. Tác dụng của chế phẩm sinh học 40 1.2. VI SINH VẬT HỌC ĐƯỜNG TIÊU HÓA CỦA ĐỘNG VẬT 47 PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 50 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50 2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học 50 2.2.1.1. Phương pháp xác định amoniac (đạm thối) bằng cách cất kéo hơi nước 50 2.2.1.2. Phương pháp phân tích hàm lượng H 2 S 51 2.2.2. Phương pháp phân tích vi sinh 52 2.2.2.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 52 2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra vi sinh vật tổng số 53 2.2.2.3. Phương pháp kiểm tra tổng số Coliform 56 2.2.2.4. Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 58 2.2.2.5. Phương pháp phân lập 59 2.2.2.6. Phương pháp giữ giống và cấy chuyền 60 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 60 2.2.3.1. Xác định mật độ quang 60 3 2.2.3.2. Xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn lactic 60 2.2.3.3. Phương pháp nhuộm Gram 61 2.2.3.4. Xác đinh khả năng phân hủy tinh bột và protein của vi khuẩn Bacillus 61 2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 62 2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm tổng quan để sản xuất chế phẩm vi sinh 62 2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm chế phẩm trên heo 62 2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 64 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 65 3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ tự nhiên 65 3.1.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng lactic phân lập được 66 3.1.3. Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính amylase và protease 70 3.1.4. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus phân lập và được lựa chọn 72 3.1.5. Quan sát hình thái khuẩn lạc nhóm vi khuẩn quang dưỡng 74 3.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH LÝ HÓA CỦA CÁC CHỦNG ĐÃ LỰA CHỌN 76 3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới khả năng sinh trưởng của các vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng 76 3.2.2. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng. 79 3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 79 3.2.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus 83 3.2.2.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang dưỡng 85 3.2.2.4. Ảnh hưởng tỷ lệ giống tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng 86 3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH 87 4 3.3.1. Chọn phương pháp thu hồi sinh khối của các chủng vi khuẩn 87 3.3.2. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh vật và đánh giá khả năng bảo quản của chế phẩm 88 3.3.3. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng vi khuẩn đã lựa chọn và phân lập 90 3.4. SƠ BỘ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG CHO CHĂN NUÔI HEO 92 3.4.1. Đánh giá mức độ ô nhiễm của phân heo 92 3.4.2. Kết quả sử dụng chế phẩm sinh học trong chăn nuôi heo 932 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 987 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1001 PHỤ LỤC 1032 PHỤ LỤC 1. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CÁC VI KHUẨN 1032 PHỤ LỤC 2. MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1054 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VSV: Vi sinh vật CFU: Colony forming units BOD (Biochemical Oxygen Demand): nhu cầu oxy sinh hóa. TSA: Tryptone Soya Agar VRB: Violet Red Bile Agar BGBL: Brilliant Green Lactose Borth SPW: Saline Pepton Water OD (Optical Density): mật độ quang TM: Cacbonat agar LA: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ND1, ND2, ND3, ND4, ND5: Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập nước dưa chua SC1, SC2, SC3, SC4, SC5: Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ sữa chua D1, D2, D3, D4, D5: Các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được từ đất 6 DANH MỤC CÁC BẢNG STT DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG 1 Bảng 1.1. Nhu cầu vitamine cần cho sự phát triển của một số loài vi khuẩn lactic 17 2 Bảng 3.1. Sự thay đổi giá trị pH của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa chua và nước dưa chua theo thời gian nuôi cấy 64 3 Bảng 3.2. Hoạt tính enzyme protease, amylase và đường kính vòng phân giải của 5 chủng Bacillus phân lập được 70 4 Bảng 3.3. Kết quả thu hồi sinh khối của các chủng nghiên cứu (CFU/ml) 87 5 Bảng 3.4. Số lượng vi sinh vật sống của chế phẩm theo 88 6 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phân heo 91 7 Bảng 3.6. Hiệu quả sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo mẹ 92 8 Bảng 3.7. Hiệu quả sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo 3 tháng tuổi 92 9 Bảng 3.8. Hiệu quả tăng trọng khi sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn nuôi heo 3 tháng tuổi 95 7 DANH MỤC CÁC HÌNH STT DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG 1 Hình 1.1. Hình ảnh giống heo Landrace 55 2 Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của chủng Lactobacillus acidophillus trên môi trường MRS 65 3 Hình 3.2. Hình dạng của chủng Lactobacillus acidophillus khi nhuộm tiêu bản tươi 66 4 Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của chủng ND2 trên môi trường MRS 87 5 Hình 3.4. Hình dạng của chủng ND2 khi nhuộm tiêu bản cố định 88 6 Hình 3.5. Hình dạng của chủng ND2 khi nhuộm tiêu bản tươi 91 7 Hình 3.6. Hình dạng thái khuẩn lạc của chủng SC4 trên môi trường MRS 67 8 Hình 3.7. Hình dạng của chủng SC4 khi nhuộm tiêu cố định 67 9 Hình 3.8. Hình dạng của chủng SC4 khi nhuộm tiêu bản tươi 68 10 Hình 3.9. Hình ảnh về tế bào Bacillus subtilis nuôi trên môi trường NB 71 11 Hình 3.10. Hình ảnh về tế bào vi khuẩn D3 nuôi trên môi trường NB 71 12 Hình 3.11. Hình dạng của chủng Bacillus subtilis dưới kính hiển vi quang học 72 13 Hình 3.12. Hình dạng của chủng D3 dưới kính hiển vi quang học 72 14 Hình 3.13. Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn quang hợp xanh lục và vi khuẩn tía trong ống thạch nghiêng 73 15 Hình 3.14. Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn tía khi nhuộm tiêu bản cố định 74 16 Hình 3.15. Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn xanh lục khi nhuộm tiêu bản cố định 76 8 17 Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 76 18 Hình 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus 77 19 Hình 3.18. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang dưỡng 79 20 Hình 3.19. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus acidophilus 79 21 Hình 3.20. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus sp1 80 22 Hình 3.21. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus sp2 80 23 Hình 3.22. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 82 24 Hình 3.23. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus sp 83 25 Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng vi khuẩn quang dưỡng 84 26 Hình 3.25. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn 85 27 Hình 3.28. Hiệu suất xử lý của chế phẩm đối với hàm lượng H 2 S và NH 3 của heo mẹ 94 28 Hình 3.29. Hiệu suất xử lý của chế phẩm đối với hàm lượng H 2 S và NH 3 của heo 3 tháng tuổi 94 9 MỞ ĐẦU Việt Nam là một đất nước với trên 75% dân số sống bằng nghề nông nghiệp. Trong sản xuất của Nông nghiệp, chăn nuôi là một lĩnh vực đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho người tiêu dùng. Trong lĩnh vực chăn nuôi ở nông thôn Việt Nam, chăn nuôi heo là một nghề có tỷ trọng lớn. Ngày nay do yêu cầu của thị trường nên nghề chăn nuôi heo có xu thế chuyển từ quy mô nuôi phân tán sang nuôi tập trung - nuôi công nghiệp. Do việc nuôi tập trung và nghề nuôi lại chưa được quy họach và đầu tư một cách đầy đủ dẫn tới nguy cơ ô nhiễm do các phế thải của chăn nuôi heo như: nước tiểu, phân, các vi sinh vậy gây bệnh,… Do vậy việc nghiên cứu nhằm có một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát nguồn ô nhiễm này rất cần thiết. Trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo” với mục đích sản xuất ra một chế phẩm vi sinh dùng để bổ sung vào thức ăn nuôi heo dưới dạng dịch với mục đích hạn chế mùi hôi thối và làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh trong phân heo thải ra môi trường. * NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN 1) Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus có hoạt tính sinh học cao từ môi trường tự nhiên. 2) Nghiên cứu các điều kiện thích hợp nuôi cấy để thu nhận sinh khối của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. 3) Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh dưới dạng dịch lỏng. 4) Bước đầu thử nghiệm sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn nuôi heo để giảm thiểu ô nhiễm từ phân heo. * Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI Các số liệu khoa học thu được sẽ làm phong phú thêm hiểu biết về ứng dụng của vi sinh vật trong chăn nuôi. Mặt khác kết quả nghiên của luận văn sẽ là các số liệu thực tế để bổ sung vào lĩnh vực giảng dạy môn học vi sinh vật của Trường Đại học Nha Trang. * Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Thành công của đề tài là cơ sở để ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong chăn nuôi động vật và xử lý môi trường. 10 PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 1.1.1. Chế phẩm sinh học là gì ? Chế phẩm sinh học là một tập hợp các chủng vi sinh vật có ích. Đó là các tế bào sống của các chủng vi sinh vật, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi và cải thiện môi trường, đồng thời cũng có thể tác dụng dương tính đối với cơ thể con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [2]. * Cơ sở khoa học của việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm sinh học Đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là sinh trưởng nhanh. Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn phụ thuộc đáng kể vào điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ hiếu khí và các yếu tố khác. Trong điều kiện thuận lợi, tế bào có thể phân chia sau 20-30 phút. Như vậy, sau 24 giờ có tới 48-72 vòng tăng đôi số lượng và từ 1 tế bào có thể đạt được khối lượng hàng ngàn tấn. Tuy nhiên, trong thực tế không thể có điều kiện lý tưởng để tăng sinh khối như vậy. Trong điều kiện nuôi cấy bình thường, vi khuẩn cần có thời gian để làm quen với môi trường mà chưa thể sinh trưởng ngay. Ở giai đoạn này, thường được gọi là pha lag. Khi đã qua giai đoạn làm quen, thì vi khuẩn bắt đầu sinh sản bằng cách nhân đôi theo cấp số nhân. Ở giai đoạn này, sinh khối tăng mạnh, các chất dinh dưỡng trong môi trường được sử dụng mạnh. Khi môi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng, sự tăng trưởng dừng lại và cuối cùng tế bào già đi và chết. Tùy theo từng loại vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy mà có thể thu hồi lượng sinh khối tối đa trong khoảng thời gian thích hợp. Một trong những đặc điểm thuận lợi cơ bản khi sử dụng vi khuẩn để sản xuất chế phẩm sinh học là tốc độ sinh trưởng. Có thể nuôi cấy vi khuẩn trên cơ chất rẻ tiền và sinh ra lượng lớn sinh khối một cách ổn định. Mặt khác, vi sinh vật cũng là nguồn cung cấp những enzyme cần thiết, thực hiện quá trình sinh học trong những điều kiện đơn giản, không đòi hỏi phương pháp phức tạp. Những vi sinh vật sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học phải được lựa chọn trên cơ sở bảo toàn những đặc tính sinh học theo thời gian, không có nguy cơ biến đổi về di truyền học [14]. [...]... do các vi sinh vật gây bệnh sinh ra - Tạo ra các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ chất kháng sinh, hydroperoxit 1.1.2 Thành phần của chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học thường có những nhóm vi sinh vật sau: Các nhóm vi sinh vật cơ bản: - Vi khuẩn lactic - Vi khuẩn Bacillus 12 - Vi khuẩn quang dưỡng khử H2S -vi khuẩn tía có lưu huỳnh, vi khuẩn tía không lưu huỳnh và vi khuẩn...11 Vi c sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học hoàn toàn có cơ sở khoa học và đáp ứng với nhu cầu thực tiễn bởi vi sinh vật trong chế phẩm sinh học có những ưu điểm cơ bản Trước hết là diện tích nuôi cấy nhỏ, tốc độ sinh trưởng nhanh, có thể thu được lượng sinh khối lớn trong vòng 20-30 giờ Mặt khác, các enzyme sinh ra có hoạt lực cao, nguồn nguyên liệu... dùng nhiều trong chăn nuôi để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn cho gia súc, làm giảm sự phát triển của vi sinh vật có hại Người ta đã lợi dụng những đặc điểm này để sản xuất một số chế phẩm vi sinh cải thiện môi trường nước nuôi tôm Một số nghiên cứu trên chủng vi khuẩn thuộc loài B.subtilis có khả năng sinh hoạt tính protease mạnh đã được ứng dụng trong quy trình chế biến nước... phổ biến trong tự nhiên, lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, trước hết là sản phẩm có hợp chất nitơ (protein) và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, nước quả, xiro…), sống kí sinh ở bánh mỳ, hạt nâu Các trực khuẩn này được dùng trong công nghiệp sản xuất enzyme amylase, protease, trong tự nhiên chúng phát triển và sinh ra các vật chất đối kháng (có tính kháng sinh) ức chế sinh trưởng nhiều vi khuẩn... và dị hình, vi khuẩn lactic còn có thể sinh ra hàng loạt các chất có hoạt tính kháng sinh, mặc dù hoạt lực của chúng không cao Các chất này được gọi chung là hoạt chất sinh học do vi khuẩn sinh ra - bacterioxin Với hoạt tính kháng sinh không cao nên không được dùng trong y học để chữa bệnh và do đó lại là lợi thế cho chất kháng sinh loại này được dùng trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với tư... nhóm vi sinh vật phụ: - Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và Nitrobacter) - Nhóm xạ khuẩn - Nhóm nấm mốc Trong số này nhóm xạ khuẩn, nấm mốc thường chỉ dùng khi chế phẩm bổ sung vào phân hủy rác thải hoặc nuôi cấy chủng sinh ra một lượng enzyme đáng kể dùng bổ sung vào chế phẩm để hổ trợ sự phân hủy hợp chật hữu cơ [8] * Vi khuẩn lactic Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế. .. độc lập trong một thời gian dài - Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng - Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non - Biểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ Cơ chế tác dụng của các vi sinh vật trong chế phẩm sinh học đã được giải thích: - Cạnh tranh thức ăn và vị trí bám với các vi sinh vật gây bệnh - Làm bất hoạt các độc tố hoặc các sản phẩm trao... bệnh thiếu vitamine, bệnh thiếu máu Ở cộng hòa Pháp và một số nước khác đã dùng chế phẩm hỗn hợp sinh khối các chủng thuộc các giống L.acidophilus, L.bulgaricus và Str.lactis đặc biệt hiệu quả trong vi c phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột của động vật có vú và người do dùng thuốc kháng sinh dài ngày hoặc liều cao [8] 24 * Vi khuẩn Bacillus Các vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào... pH 5,5-6,0 Ngày nay người ta dùng một số tác nhân đột biến (tia cực tím, tia X, etylenimin ) có thể thu được một số thể đột biến của vi khuẩn chọn được những giống có hoạt tính để đưa vào sản xuất sinh khôi vi khuẩn lactic - làm giống ban đầu (hay khởi động) - stalet kullter hay zakvas, cho sản xuất hàng loạt các sản phẩm sữa Một trong những quá trình chế biến để thu sản phẩm này là quá trình chín của... glucosese Các chủng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas có khả năng sinh enzyme α-amylase cao Ngày nay, vi c thu enzyme α-amylase và protease từ các chủng vi 32 khuẩn chịu mặn, chịu kiềm rất được quan tâm vì những ưu điểm có được từ các loại enzyme thu được trong vi c ứng dụng: bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, làm nước mắm, tạo chế phẩm sinh học… Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus . tài Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo với mục đích sản xuất ra một chế phẩm vi sinh dùng để bổ sung vào thức ăn nuôi heo dưới dạng dịch với mục đích hạn chế mùi. dụng sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong chăn nuôi động vật và xử lý môi trường. 10 PHẦN I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 1.1.1. Chế phẩm sinh học là gì ? Chế phẩm. tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng 86 3.3. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH 87