luận văn thạc sĩ nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo

Đó là các tế bào sống của các chủng vi sinh vật, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi và cải thiện môi trường, đồng thời cũng có thể

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG ĐỨC AN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH

DÙNG TRONG CHĂN NUÔI HEO

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NG ÀNH: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH

MÃ SỐ: 60.54.10

NHA TRANG, 8/2008

MỤC LỤC

PHẦNI.TỔNGQUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC 10

1.1.1 Chế phẩm sinh học là gì ? 10

1.1.2 Thành phần của chế phẩm sinh học 11

1.1.3 Tác dụng của chế phẩm sinh học 40

1.2 VI SINH VẬT HỌC ĐƯỜNG TIÊU HÓA CỦA ĐỘNG VẬT 47

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 50

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 50

2.2.1 Phương pháp phân tích hóa học 50

2.2.1.1 Phương pháp xác định amoniac (đạm thối) bằng cách cất kéo hơi nước .50

2.2.1.2 Phương pháp phân tích hàm lượng H2S 51

2.2.2 Phương pháp phân tích vi sinh 52

2.2.2.1 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 52

2.2.2.2 Phương pháp kiểm tra vi sinh vật tổng số 53

2.2.2.3 Phương pháp kiểm tra tổng số Coliform 56

2.2.2.4 Định lượng E.coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 58

2.2.2.5 Phương pháp phân lập 59

2.2.2.6 Phương pháp giữ giống và cấy chuyền 60

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 60

2.2.3.1 Xác định mật độ quang 60

2.2.3.2 Xác định khả năng sinh acid của vi khuẩn lactic 60

2.2.3.3 Phương pháp nhuộm Gram 61

2.2.3.4 Xác đinh khả năng phân hủy tinh bột và protein của vi khuẩn Bacillus 61

2.2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 62

2.2.4.1 Bố trí thí nghiệm tổng quan để sản xuất chế phẩm vi sinh 62

2.2.4.2 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm chế phẩm trên heo 62

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 64

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 65

3.1 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM 65

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ tự nhiên 65

3.1.2 Quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng lactic phân lập được 66 3.1.3 Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus có hoạt tính amylase và protease 70 3.1.4 Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus phân lập và được lựa chọn 72

3.1.5 Quan sát hình thái khuẩn lạc nhóm vi khuẩn quang dưỡng 74

3.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH LÝ HÓA CỦA CÁC CHỦNG ĐÃ LỰA CHỌN 76

3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới khả năng sinh trưởng của các vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng 76

3.2.2 Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng .79

3.2.2.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic 79 3.2.2.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus 83 3.2.2.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của nhóm vi khuẩn quang dưỡng 85

3.2.2.4 Ảnh hưởng tỷ lệ giống tới khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và vi khuẩn quang dưỡng 86

3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN DÙNG ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH 87

3.3.1 Chọn phương pháp thu hồi sinh khối của các chủng vi khuẩn 87

3.3.2 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh vật và đánh giá khả năng bảo quản của chế phẩm 88

3.3.3 Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ các chủng vi khuẩn đã lựa chọn và phân lập 90

3.4 SƠ BỘ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG CHO CHĂN NUÔI HEO 92

3.4.1 Đánh giá mức độ ô nhiễm của phân heo 92

3.4.2 Kết quả sử dụng chế phẩm sinh học trong chăn nuôi heo 932

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 987

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1001

PHỤ LỤC 1032

PHỤ LỤC 1 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY CÁC VI KHUẨN 1032

PHỤ LỤC 2 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1054

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

VSV: Vi sinh vật

CFU: Colony forming units

BOD (Biochemical Oxygen Demand): nhu cầu oxy sinh hóa

TSA: Tryptone Soya Agar

VRB: Violet Red Bile Agar

BGBL: Brilliant Green Lactose Borth

SPW: Saline Pepton Water

OD (Optical Density): mật độ quang

TM: Cacbonat agar

LA: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

ND1, ND2, ND3, ND4, ND5: Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập nước dưa chua

SC1, SC2, SC3, SC4, SC5: Các chủng vi khuẩn lactic được phân lập từ sữa chua

D1, D2, D3, D4, D5: Các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được từ đất

Bảng 3.1 Sự thay đổi giá trị pH của các chủng vi khuẩn lactic

phân lập từ sữa chua và nước dưa chua theo thời gian nuôi cấy 64

3 Bảng 3.2 Hoạt tính enzyme protease, amylase và đường kính

vòng phân giải của 5 chủng Bacillus phân lập được 70

4 Bảng 3.3 Kết quả thu hồi sinh khối của các chủng nghiên cứu

5 Bảng 3.4 Số lượng vi sinh vật sống của chế phẩm theo 88

7 Bảng 3.6 Hiệu quả sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo

8 Bảng 3.7 Hiệu quả sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn heo

9 Bảng 3.8 Hiệu quả tăng trọng khi sử dụng chế phẩm sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH

2 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng Lactobacillus

3 Hình 3.2 Hình dạng của chủng Lactobacillus

4 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của chủng ND2 trên môi

14 Hình 3.13 Hình ảnh khuẩn lạc của vi khuẩn quang hợp

xanh lục và vi khuẩn tía trong ống thạch nghiêng 73

15 Hình 3.14 Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn tía khi nhuộm tiêu

16 Hình 3.15 Ảnh khuẩn lạc vi khuẩn xanh lục khi nhuộm

17 Hình 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh

18 Hình 3.17 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh

19 Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh

20 Hình 3.19 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng

sinh trưởng của chủng Lactobacillus acidophilus 79

21 Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng

sinh trưởng của chủng Lactobacillus sp1 80

22 Hình 3.21 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng

sinh trưởng của chủng Lactobacillus sp2 80

23 Hình 3.22 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng

sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 82

24 Hình 3.23 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng

sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bacillus sp 83

25 Hình 3.24 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng

sinh trưởng của chủng vi khuẩn quang dưỡng 84

26 Hình 3.25 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng

27 Hình 3.28 Hiệu suất xử lý của chế phẩm đối với hàm

28 Hình 3.29 Hiệu suất xử lý của chế phẩm đối với hàm

lượng H2S và NH3 của heo 3 tháng tuổi 94

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một đất nước với trên 75% dân số sống bằng nghề nông nghiệp Trong sản xuất của Nông nghiệp, chăn nuôi là một lĩnh vực đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong việc cung cấp thực phẩm cho người tiêu dùng Trong lĩnh vực chăn nuôi ở nông thôn Việt Nam, chăn nuôi heo là một nghề có tỷ trọng lớn Ngày nay do yêu cầu của thị trường nên nghề chăn nuôi heo có xu thế chuyển từ quy mô nuôi phân tán sang nuôi tập trung - nuôi công nghiệp Do việc nuôi tập trung và nghề nuôi lại chưa được quy họach và đầu tư một cách đầy đủ dẫn tới nguy cơ ô nhiễm do các phế thải của chăn nuôi heo như: nước tiểu, phân, các vi sinh vậy gây bệnh,… Do vậy việc nghiên cứu nhằm có một biện pháp hữu hiệu để kiểm soát

nguồn ô nhiễm này rất cần thiết Trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên

cứu sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong chăn nuôi heo” với mục đích sản xuất

ra một chế phẩm vi sinh dùng để bổ sung vào thức ăn nuôi heo dưới dạng dịch với mục đích hạn chế mùi hôi thối và làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh trong phân heo thải ra môi trường

* NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN

1) Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus có

hoạt tính sinh học cao từ môi trường tự nhiên

2) Nghiên cứu các điều kiện thích hợp nuôi cấy để thu nhận sinh khối của các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn

3) Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm vi sinh dưới dạng dịch lỏng 4) Bước đầu thử nghiệm sử dụng chế phẩm bổ sung vào thức ăn nuôi heo để giảm thiểu ô nhiễm từ phân heo

* Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

Các số liệu khoa học thu được sẽ làm phong phú thêm hiểu biết về ứng dụng của vi sinh vật trong chăn nuôi Mặt khác kết quả nghiên của luận văn sẽ là các số liệu thực tế

để bổ sung vào lĩnh vực giảng dạy môn học vi sinh vật của Trường Đại học Nha Trang

* Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

Thành công của đề tài là cơ sở để ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh vật dùng trong chăn nuôi động vật và xử lý môi trường

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẾ PHẨM SINH HỌC

1.1.1 Chế phẩm sinh học là gì ?

Chế phẩm sinh học là một tập hợp các chủng vi sinh vật có ích Đó là các tế bào sống của các chủng vi sinh vật, sống hợp sinh và sản sinh ra một số hợp chất có tác dụng đến đời sống cây trồng, vật nuôi và cải thiện môi trường, đồng thời cũng

có thể tác dụng dương tính đối với cơ thể con người khi đưa chế phẩm này vào đường ruột [2]

* Cơ sở khoa học của việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm sinh học

Đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là sinh trưởng nhanh Tuy nhiên, tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn phụ thuộc đáng kể vào điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ hiếu khí và các yếu tố khác Trong điều kiện thuận lợi, tế bào có thể phân chia sau 20-30 phút Như vậy, sau 24 giờ có tới 48-72 vòng tăng đôi số lượng và từ

1 tế bào có thể đạt được khối lượng hàng ngàn tấn Tuy nhiên, trong thực tế không thể có điều kiện lý tưởng để tăng sinh khối như vậy Trong điều kiện nuôi cấy bình thường, vi khuẩn cần có thời gian để làm quen với môi trường mà chưa thể sinh trưởng ngay Ở giai đoạn này, thường được gọi là pha lag Khi đã qua giai đoạn làm quen, thì vi khuẩn bắt đầu sinh sản bằng cách nhân đôi theo cấp số nhân Ở giai đoạn này, sinh khối tăng mạnh, các chất dinh dưỡng trong môi trường được sử dụng mạnh Khi môi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng, sự tăng trưởng dừng lại và cuối cùng

tế bào già đi và chết Tùy theo từng loại vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy mà có thể thu hồi lượng sinh khối tối đa trong khoảng thời gian thích hợp

Một trong những đặc điểm thuận lợi cơ bản khi sử dụng vi khuẩn để sản xuất chế phẩm sinh học là tốc độ sinh trưởng Có thể nuôi cấy vi khuẩn trên cơ chất rẻ tiền và sinh ra lượng lớn sinh khối một cách ổn định Mặt khác, vi sinh vật cũng là nguồn cung cấp những enzyme cần thiết, thực hiện quá trình sinh học trong những điều kiện đơn giản, không đòi hỏi phương pháp phức tạp Những vi sinh vật sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học phải được lựa chọn trên cơ sở bảo toàn những đặc tính sinh học theo thời gian, không có nguy cơ biến đổi về di truyền học [14]

Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học hoàn toàn có cơ sở khoa học và đáp ứng với nhu cầu thực tiễn bởi vi sinh vật trong chế phẩm sinh học có những

ưu điểm cơ bản Trước hết là diện tích nuôi cấy nhỏ, tốc độ sinh trưởng nhanh, có thể thu được lượng sinh khối lớn trong vòng 20-30 giờ Mặt khác, các enzyme sinh ra có hoạt lực cao, nguồn nguyên liệu sử dụng dễ kiếm, phong phú và rẻ tiền Có thể thay đổi một cách dễ dàng môi trường nuôi cấy để đạt hiệu quả như mong muốn Đặc biệt, việc sản xuất không phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết vì diện tích nhỏ nên có thể khống chế được nhiệt độ cần thiết [5]

Nói chung các vi sinh vật dùng làm chế phẩm sinh học thường phải có các đặc điểm sau đây [2]:

- Có khả năng bám dính vào niêm mạc tiêu hóa của vật chủ

- Dễ nuôi cây

- Không sinh ra chất độc và không gây bệnh cho vật chủ

- Có khả năng tồn tại độc lập trong một thời gian dài

- Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật chủ có thể sử dụng

- Chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non

- Biểu hiện hiệu quả có lợi đối với vật chủ

Cơ chế tác dụng của các vi sinh vật trong chế phẩm sinh học đã được giải thích:

- Cạnh tranh thức ăn và vị trí bám với các vi sinh vật gây bệnh

- Làm bất hoạt các độc tố hoặc các sản phẩm trao đổi chất có hại do các vi sinh vật gây bệnh sinh ra

- Tạo ra các chất ức chế sinh trưởng của các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ chất kháng sinh, hydroperoxit

- Vi khuẩn quang dưỡng khử H2S-vi khuẩn tía có lưu huỳnh, vi khuẩn tía không lưu huỳnh và vi khuẩn xanh khử H2S

vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococus lactic)

và ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã hình thành từ năm 1881 Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic phân bố rộng rãi đặc biệt hay gặp trong các sản phẩm muối chua: dưa chua, cà muối, mắm chua, tôm chua, nem chua, sữa chua Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ

Lactobacteriaceae và chia thành hai nhóm là Streptoccaceae và Lactobacteriaceae

Mặc dù chúng không đồng nhất về mặt hình thái, gồm cả vi khuẩn hình que và hình sợi song về mặt sinh lý thì tương đối đồng nhất Tất cả đều là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, không di động, không có enzymee oxydase, catalase và nitratreductase Chúng có khả năng lên men, sử dụng carbohydrate là nguồn năng lượng và tạo thành acid lactic là sản phẩm cuối cùng chủ yếu hoặc duy nhất Vi khuẩn lactic sống từ kỵ khí đến vi hiếu khí [8]

Vi khuẩn lactic được chia làm các giống chủ yếu sau đây [18]:

* Giống Lactobacillus hình que, thường có kích thước (0,5-1,2)x(1-10)µm

Đây là loại vi khuẩn sinh acid lactic phổ biến và điển hình nhất Kích thước của

chúng thay đổi tùy loài, chẳng hạn Lactobacillus plantarum có dạng hình que xếp chuỗi hoặc đứng riêng lẽ (Pederson, 1936), Lactobacillus casei có dạng hình que

ngắn hoặc dài, tế bào hình que mảnh, đôi khi hơi cong, xếp thành cặp hay chuỗi

Giống Lactobacillus là loài trực khuẩn, có thể sống ở pH=3,8 hoặc thấp hơn,

hoạt động hô hấp thấp Nhiệt độ tối thích là 30-400C Lactobacillus phân bố rộng rãi

trong môi trường, đặc biệt trên những thực phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật, thường sống trong ruột chim và động vật hữu nhũ

* Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài ho ặc hình oval, đường kính từ

0,5÷0,8µm, chiều dài khoảng 1,6µm Đôi khi chúng có dạng hơi tròn, chiều dài khoảng 1÷3µm, xếp thành chuỗi và không tạo thành một đám tập trung Lên men dị hình sản phẩm là acid lactic cùng với CO2, etanol, các acid bay hơi Chúng phát triển được ở 100C, nhưng không mọc được ở 450C

Chỉ lên men được mono- và disaccharide, sống hiếu khí tùy ý Phân bố rộng rãi trên thực vật, sản phẩm sữa và các sản phẩm khác

* Giống Streptococus gồm Enterococci, Lactis streptoccoci và Streptococci,

có tế bào hình tròn hoặc oval, đường kính khoảng 0,5÷1µm, xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi dài Một số chủng có dạng hơi giống trực khuẩn vì chiều dài lớn hơn

chiều rộng, chẳng hạn Streptococus lactis là trực khuẩn rất ngắn, nhỏ

1,0÷1,5µmx0,5÷1,0µm gây chua sữa tự nhiên

Sống hiếu khí tùy ý Nhiệt độ phát triển 25-450C, tối thích ở 370C Ký sinh trên động vật có xương sống, đặc biệt vùng miệng và ruột

* Giống Pediococcus có dạng hình cầu, đường kính 0,5÷1,2µm, đứng riêng lẻ,

kết đôi hay tạo đám tứ cầu hay bát cầu khuẩn Chúng là các thể kỵ khí hoặc vi hiếu khí, thường yêu cầu có CO2 cho sự phát triển, lên men đồng hình Một số chủng có thể tạo thành màng nhầy từ saccharose

Nhiệt độ thích hợp là 25-400C Thường xuất hiện trên rau quả và các loại thực phẩm khác

* Giống Enterococcus có dạng tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước

(0,6-2,0)x(0,6-2,5)µm, thường xuất hiện ở dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng Hiếu khí tùy ý, lên men nhiều loại đường khác nhau tạo thành sản phẩm chính là acid lactic nhưng không sinh gas, pH cuối cùng là 4,2÷4,6

Môi trường dinh dưỡng phức tạp Có thể phát triển ở 10-450C (tối thích 370C), pH= 9,6; 6,5% NaCl Thường lên men lactic lactose Hiện diện rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt trong phân động vật có xương sống

* Giống Lactococus có dạng tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước

(0,5-1,2)x(0,5-1,5)µm, thường xuất hiện dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng Hiếu khí tùy ý, lên men nhiều loại carbohydrate với sản phẩm chủ yếu là acid lactic nhưng không sinh gas Phát triển được ở 10-450C, tối thích ở 300C Được tìm thấy phổ biến nhất trong các sản phẩm sữa và ở thực vật

- Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau thì khác nhau, đặc biệt là

nhu cầu về vitamine và nitơ Chẳng hạn, loài Lactobacillus được coi là nhóm vi

khuẩn có đòi hỏi về dinh dưỡng cao nhất Chúng đòi hỏi không chỉ các chất hữu cơ phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà còn nhu cầu lớn về các yếu

tố cần cho sự phát triển như vitamine, muối vô cơ [8]

- Nhu cầu dinh dưỡng Cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza (glucosese, fructose, mantoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit Nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các acid hữu cơ như acid malic, pyruvic, fumaric, axetic (Krasilnikov, 1965; Wittenbyry, 1965; Flesch, 1968; Bottazzi, 1971)

Một vài loại vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng các acid glucosenic và glactorunic tạo thành CO2, acid axetic và acid lactic

Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các loại acid amine như acid glutamic, acginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khí đó xảy ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2

Các loại vi khuẩn lactic khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau Ví dụ

Lactobacillus delbrueckii có thể sử dụng các đường maltoza, glucosese, galactoza,

saccaroza, dextrin và không sử dụng được lactoza, raffinoza trong khi đó

Lactobacillus bulgaricus có thể sử dụng được đường lactoza nhưng lại không sử

dụng được maltoza và saccaroza Một số vi khuẩn lactic lại có thể sử dụng được dextrin và tinh bột [8]

- Nhu cầu về nitơ:

Một số lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ

phức tạp có chứa nitơ, vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ Đôi khi trong

một số trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic, như Lactobacillus

helviticus, có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường

Theo Orla-Jensen dựa vào nhu cầu nitơ có thể chia vi khuẩn lactic ra làm ba nhóm:

- Các vi khuẩn lactic cần hỗn hợp phức tạp các acid amine trong môi trường

(chi phụ Thermobacterium)

- Các vi khuẩn có thể phát triển tốt trên môi trường chỉ có sistein và muối

amoni (chi phụ Streptobacterium)

- Các vi khuẩn có thể phát triển trên môi trường có nguồn nitơ duy nhất là

muối amoni (giống Streptococcus)

Như đã nói trên, để sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amine, vi khuẩn lactic còn cần những cơ chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ thịt, lactanbumin, casein, pepton, peptid [8]

- Nhu cầu Vitamine:

Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là loài Lactobacillus rất cần vitamine cho sự phát

triển Thường thì phải bổ sung vào môi trường các chất có chứa vitamine như nước

khoai tây, ngô, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất khác Các vitamine đóng vai trò là các coenzymee trong quá trình trao đổi chất của tế bào Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp được vitamine

Rogosa và cộng sự (1961) đã chỉ ra rằng acid nicotinic (vitamine B5) và acid pantotenic (vitamine B3) rất cần thiết cho sự phát triển của tất cả các loài vi khuẩn lactic Trong khi đó vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamine (vitamine B1), nhưng acid folic và acid p-amineobenzoic không ảnh hưởng đến sự phát triển của

loài Lactobacillus

Có thể tích tụ các vitamine trong tế bào vi khuẩn lactic đang được nghiên cứu

Người ta cho rằng tế bào của loài Lactobacillus leichmanii và Lactobacillus

delbrueckii có chứa vitamine B12 hấp thụ từ môi trường với tỷ lệ khoảng 0,5µg/g chất khô Khi đó hầu như toàn bộ lượng vitamine này được phát hiện thấy ở trong thành tế bào liên kết chặt chẽ với các chuỗi polypetid ở đó (Sasaki, 1972) Tế bào vi khuẩn lactic có thể hấp thụ một lượng vitamine như: vitamine B6, thiamine, lớn hơn nhu cầu của chúng để tạo ra một số lượng lớn trong tế bào (còn gọi là sự tiêu thụ thừa vitamine)

Nhu cầu vitamine còn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuôi cấy,

pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường Chẳng hạn khi thay đổi nhiệt độ khoảng 3-40C thì nhu cầu trao đổi riboflavin với môi trường bên ngoài của

Lactobacillus helveticus thay đổi khoảng 25%

Nhu cầu vitamine cũng vị ảnh hưởng bởi thành phần môi trường nuôi cấy Điều này có liên quan chặt chẽ tới sự có mặt của các acid amine, acid hữu cơ, dezoxyribozit Chẳng hạn vi khuẩn lactic sẽ không cần vitamine B12 nếu trong môi trường đã có dezoxyribozit Tương tự như vậy bazơ purin cũng ảnh hưởng tới nhu

cầu acid p-amineobenzoic của vi khuẩn lactic [8]

- Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic

Ngoài các acid amine và vitamine ra vi khuẩn lactic còn có nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng Dưới đây là một số hợp chất hữu cơ

ảnh hưởng đến sựu phát triển hoặc kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic:

- Các bazơ nitơ: Adenin, hypoxantin, guanin, uraxin, thimin, thimidin

- Acid hữu cơ: acid axetic và nhiều acid hữu cơ không bay hơi khác

- Acid amine: L-asparagin, L-glutamine

Trong môi trường có chứa các acid amine tự do, vitamine và nhiều cấu tử cần thiết khác, protein chưa thủy phân hoàn toàn sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của

vi khuẩn lactic Có khả năng là các peptid thực hiện vai trò cung cấp các acid amine cần thiết cho quá trình đồng hóa Chúng kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với các acid amine tự do (Raines, Haskell, 1986)

Một loạt chất thuộc về nhóm các yếu tố phát triển hữu cơ là acid axetic và acid xitric Có sự ảnh hưởng thuận lợi của xitrat đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic đã được chứng minh đó là lý do tại sao hiện nay người ta lại sử dụng rộng rãi xitrat làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Tương tự xitrat, acetate hay acid axetic có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Acetate được dùng làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy

nhiều vi khuẩn lactic

Một loại acid hữu cơ quan trọng khác có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loại vi khuẩn lactic là acid oleic (có thể thay thế bằng linoleic và acid linolenic)

Đó chính là nguyên nhân tại sao người ta lại sử dụng Tween-80, một dẫn xuất của acid oleic (polyoxythlen sorbitol monolat), trong thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy vi

khuẩn lactic Một vài loài vi khuẩn lactic (Lactobacillus acidophillus và Lactobacillus

bulgaricus) rất cần các acid béo không no cho sự phát triển Các acid béo không no ở đây

có tác dụng chuyển hóa thành biotin (vitamine H) chất sinh trưởng rất cần thiết cho vi

khuẩn lactic [8]

Bảng 1.1 Nhu cầu vitamine cần cho sự phát triển của một số loài vi khuẩn

lactic (Theo Títtler và cộng sự 1952; Snell, 1954) [8]

Acid P-amimobenoic Lactobacillus plantarum

Lactobacillus arabinosus

Biotin (B7,H)

Lactobacillus plantarum Lactobacillus arabinosus Streptococcus faecalis

0,400

Acid pantotenic

(Vitamine B3)

Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis

0-0,20

Riboflavin

(Vitamine B2)

Lactobacillus casei Streptococcus lactis

0-0,7 0-0,4

Vitamine B12 Lactobacillus lactis

Lactobacillus leichmanmii

0-0,05 0-0,05

- Nhu cầu các muối vô cơ

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, mangan, natri, kali, lưu huỳnh, magie đặc biệt là

mangan Chính mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nó cần thiết cho

quá trình sống bình thường của vi khuẩn này Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Mg2+,

Fe2+ có tác động tích cực lên sự phát triển và sinh sản acid amine (Ledesma, 1976)

Một vài enzyme có sự tham gia của các ion kim loại này trong cấu trúc trung tâm

hoạt động (Krischke, 1991), chẳng hạn như trường hợp của photphoructokinaza

Nhìn chung mangan và magie là những chất đóng vai trò chủ yếu sau:

- Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme

- Giải độc tế bào khỏi sự có mặt của oxy Mn2+ thay thế dioxyt dimustaza để

thải các gốc O2-

- Ổn định cấu trúc tế bào Mn2+ tham gia vào việc làm ổn định riboxom

- Mg2+ là chất hoạt động trong các quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi

khuẩn sử dụng tốt hơn các loại đường [8]

Hoạt tính enzyme protease, lipase và nuclease của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có hoạt tính proteolitic để tác dụng lên protein và peptid là các

enzyme proteinase và peptidase

Hoạt tính proteolitic có ở các dạng cầu khuẩn cũng như ở các dạng trực khuẩn

hoặc liên cầu khuẩn chịu nhiệt Trong quá trình phân giải protein của sữa, đặc biệt

là trong thời gian đầu nuôi cấy chủng (vi khuẩn vào sữa, sẽ xuất hiện sự tạo thành

các acid amine bao gồm asparagin, glycine, serin, acid glutamic, threonin, tyrosin,

valine, phenylalanine, isoleucine) cũng như các peptid

Trực khuẩn lactic có hoạt lực proteolitic cao hơn cầu khuẩn Chẳng hạn như:

L.Bulgaricus, L.casei có khả năng phân giải casein sang dạng hòa tan tới 25-30%,

còn Str.cremoris và Str.lactis chỉ chuyển hóa được 15-17%

Hoạt lực proteolitic của vi khuẩn lactic được đánh giá bằng hàm lượng N-amine tự do hòa tan trong môi trường Cần lưu ý, khi xác định hàm lượng N-

amine tự do phi protein đã có trong môi trường trước khi vi khuẩn hoạt động

Thủy phân protein của vi khuẩn lactic là do sự tác động của enzyme protease nội

bào cũng như ngoại bào Các dịch chiết từ tế bào (sau khi nuôi vi khuẩn 24 giờ, rồi phá

vỡ vỏ tế bào, ly tâm lấy dịch) ta đều thấy có hoạt tính enzyme này Tại đây ta thấy có

mặt của 2 enzyme liên kết với màng tế bào, một enzyme khác liên kết với tế bào chất Protease màng tế bào bị phá hủy ở nhiệt độ từ 3 đến 200C, còn protease ở tế bào chất

ổn định ở 30C, nhưng bất hoạt ở - 200C

Một số kim loại (Mg2+, Mn2+ ; Co2+ ) có tác dụng kích thích peptidase ở vùng

pH 5,5-6,0 Ngày nay người ta dùng một số tác nhân đột biến (tia cực tím, tia X, etylenimin ) có thể thu được một số thể đột biến của vi khuẩn chọn được những giống có hoạt tính để đưa vào sản xuất sinh khôi vi khuẩn lactic - làm giống ban đầu (hay khởi động) - stalet kullter hay zakvas, cho sản xuất hàng loạt các sản phẩm sữa Một trong những quá trình chế biến để thu sản phẩm này là quá trình chín của phomat có chất lượng cao: hương vị và hàm lượng acid amine tự do được tạo thành nhờ hoạt tính protease của giống ban đầu Quá trình tạo thành các acid amine làm cải thiện hương vị của phomat sẽ tốt hơn Leucine và valine có thể là tiền chất của 3-metybutanal và 2-metylpropanat là hai hợp chất tạo ra vị đặc biệt của phomat

Vi khuẩn lactic nói chung là không có hoạt tính lipase (enzyme phân hủy chất béo) Có một số nhà nghiên cứu cho rằng, các trực khuẩn và cầu khuẩn lactic có khả năng sử dụng triglyxerit để tạo nên một số chất béo mới ở dạng tự do cũng như dạng liên kết

Một số chủng Lactobacillus (L.fermenti, L.casei, L.salivarius, L.viridescens)

có khả năng sinh enzyme nuclease ngoại bào chứa ADN hoặc ARN Thỉnh thoảng

có những chủng sinh đồng thời 2 enzyme ngoại bào ADNaza và ARNaza

Như chúng ta đã biết, vi khuẩn lactic không có khả năng tạo thành catalaza

Song, vài chục năm trở lại đây hàng loạt các tác giả đã thông báo tìm thấy hoạt tính catalaza ở những vi khuẩn lactic khác nhau Thật vậy, một vài loài vi khuẩn lactic

có khả năng phân giải H2O2 được tạo thành trong việc sử dụng các cơ chất xác định,

sự có mặt hoạt tính này ở các loài vi khuẩn lactic được gọi theo tên khác là

Pseudocatalaza (Whittenbery, 1964) Pseudocatalaza tìm thấy ở các loài Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides và Lactobacillus plantarum

khi nuôi ở môi trường dinh dưỡng với 0,05% thạch, nhưng không có đường

glucosese Hoạt tính Pseudocatalaza giảm đáng kể khi pH môi trường giảm từ 7

xuống 4,5 [8]

Các chất bacterioxin của vi khuẩn lactic

Trong tự nhiên vi khuẩn lactic phát triển có tác dụng ức chế nhiều loại vi sinh vật khác, thậm chí ức chế nhiều chủng thuộc nhóm vi khuẩn này Hiện tượng này là tính sống đối kháng có quan hệ tương tác khá phức tạp Đặc điểm những mối quan

hệ này phụ thuộc vào nhiều yếu tố Mức độ của quan hệ tương tác được xác định bằng các điều kiện của môi trường sống và có thể được thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật

Tính đối kháng của vi khuẩn lactic được lặng lẽ ứng dụng vào thực tế đời sống của loài người từ thuở xa xưa, như trong sản xuất sữa chua, muối chua rau quả, thịt,

cá, ủ chua thức ăn gia súc… nhờ khả năng tạo thành acid lactic trong quá trình lên men Trong sách của xứ Tây Tạng cách đây vài ngàn năm đã thấy đề cập đến việc

sử dụng vi khuẩn lactic với mục đích phòng chữa bệnh cho đường tiêu hóa, trong việc bảo vệ sắc đẹp và là một trong những biện pháp “chống già” cho cơ thể

Trong thực tế ngày nay người ta vẫn đang khai thác đặc điểm của vi khuẩn

lactic vào đấu tranh với các vi sinh vật gây thối rửa thức ăn và các vi khuẩn gây bệnh

đường ruột (tả, lỵ, thương hàn, các vi khuẩn đường ruột gây viêm nhiễm bên trong cơ

thể có điều kiện như các bệnh do Enterococus hoặc trực khuẩn đường ruột gây ra)

Ngoài khả năng sinh acid lactic do lên men đồng hình và dị hình, vi khuẩn lactic còn có thể sinh ra hàng loạt các chất có hoạt tính kháng sinh, mặc dù hoạt lực của chúng không cao Các chất này được gọi chung là hoạt chất sinh học do vi khuẩn sinh

ra - bacterioxin Với hoạt tính kháng sinh không cao nên không được dùng trong y học để chữa bệnh và do đó lại là lợi thế cho chất kháng sinh loại này được dùng trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với tư cách là chất kích thích sinh trưởng

Trong nửa cuối của thế kỷ trước nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng,

tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn khác của vi khuẩn lactic ngoài acid lactic do vi

khuẩn này sinh ra còn có tác dụng của các chất bacterioxin như: nizin, diplocoxin, acidofilin, lactoxidin, lactolin, brevin [8]

+ Diplocoxin do Oxford tìm ra năm 1944 Vi khuẩn Streptococcus cremosis

tạo thành Nó được tính lũy trong môi trường lên men lactic, dễ hòa tan trong nước

và không hòa tan trong cồn tuyệt đối Đây là chất tương tự một protein, phân tử

lượng tương đối nhỏ và không chứa lưu huỳnh, phospho Diplocoxin không mất hoạt tính trong môi trường acid khi đun sôi (môi trường có 0,4% acid axetic) trong hai giờ, nhưng bất hoạt trong môi trường kiềm Trong nước thịt pH=7 có thể giữ được hoạt tính hàng tuần

+ Nizin: do Mattick, Hirsch tìm ra năm 1944 và 1947 Streptococcus lactis tạo

thành Nizin là một hợp chất polypetid có phân tử lượng là 3500, thành phần acid

amine và các tính chất khác giống với subtilin-chất bacterioxin do Bacillus subtilis tạo

thành (Gross et ah., 1969) Cấu tạo phân tử của nizin gần giống một phân tử protein Trong thành phần có các acid amine như leucine, valine, alanine, glycine, prolin, histidin, lysine, acid glutamic, acid asparatic, serine, methionin

Nizin được sản xuất ở qui mô công nghiệp ở Anh Sản phẩm là loại bột trắng dạng tinh thể, rất ít hòa tan trong nước, nhưng độ hòa tan được tăng lên ở môi trường acid (pH = 4,2 tan được 129g/l) Bảo quản nizin ở điều kiện bình thường hoạt lực kháng sinh giảm không đáng kể Hoạt lực là 1g = 40 triệu UI (theo hệ thống Riding) Phần lớn Nizin liên kết với màng và thành vỏ tế bào Ở đó nó không ở trạng thái tự

do mà ở trong tổ hợp với các polyme khác để tạo thành phức hợp canxi-nizin

Trong tế bào Str.lactis, nizin tham gia vào chức năng kiểm soát cơ chế kìm

hãm sinh trưởng ban đầu của chủng sản, nhưng không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Sinh tổng hợp nizin không xảy ra ở pha tiềm phát Tác dụng kìm hãm của

nizin thấy rõ ở vi khuẩn propionic, Staphylococus, Sarsina, nhưng không thấy ở

nấm men Với tác dụng của nizin, khả năng bền nhiệt của bào tử vi khuẩn bị suy giảm Nó được hấp phụ lên bề mặt bào tử làm phá hủy sức thẩm thấu của màng và kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào Cơ chế tác dụng của nizin đến tế bào là do nó có khả năng liên kết với nhóm sulfohydryl và ảnh hưởng tới hàng loạt enzyme quan trọng, trước hết là glutamine và acetyl-CoA

Nizin bị phá hỏng ở nhiều vi sinh vật có khả năng sinh enzyme nizinase Trong đường tiêu hóa nó mất hoạt tính ở vùng pH kiềm Nizin không được dùng làm thuốc kháng sinh chữa bệnh, vì nó hòa tan rất kém trong môi trường trung tính

và bị phân hủy trong phần cuối của đường tiêu hóa

Nhiều nước trên thế giới cho phép dùng nizin trong bảo quản và chế biến thực phẩm, như ở Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Nga, Úc… Nó được dùng chủ yếu trong đồ hộp để ngăn ngừa sự phá hỏng của các vi khuẩn sinh bào tử Thêm 100-200mg nizin vào 1kg sản phẩm có thể rút ngắn thời gian thanh trùng và ngăn chặn sự phá hỏng sản phẩm Nizin dùng cho sữa rút ngắn được thời gian hấp Pastơ sữa không đường, sữa

có đường, nâng cao được chất lượng phomat mềm [8]

Acidophilin là bacterioxin do vi khuẩn Lactobacillus sinh ra Nó được sinh ra

và tích tụ trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn hoạt động mạnh nhất của vi khuẩn

Song hành nhưng muộn hơn với acidophilin chủng sản còn tạo thành lactocidin-

một bacteoxin có hoạt tính kháng sinh

Acidophilin bền với nhiệt, đi qua được màng lọc tế bào, pHmax = 5,0-6,0 Nó

ức chế được vi khuẩn gây thối rửa, những vi khuẩn gây bệnh thương hàn

(Salmonella) tip A và B, lỵ (Disenteria), lao (Turbekulosa), bạch hầu (Difteria) và

cả Streptococcus cũng như Staphylococus [8]

Lactocidin sinh ra bởi trực khuẩn lactic (Lactobacillus) Nó có tác dụng

chống lại các vi khuẩn bền với acid, và cả với nấm mốc, cũng như nấm men

Candida albicans Nó dễ tan trong nước, bị hấp thụ bởi than hoạt tính ở vùng trung

tính và acid, bị phá hủy ở 1100C trong 20 phút

Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus hạn chế những vi sinh vật gây thối rữa

và gây bệnh trong ruột người và động vật Rất nhiều công trình đã khuyến cáo nên

dùng sữa acidophil cũng như chế phẩm với sinh khối L.acidophilus trong ăn uống

và chữa bệnh, chủ yếu là bệnh đường ruột Để chữa lỵ, euterocolit, rối loạn tiêu hóa

ở trẻ em và người lớn, người ta thường uống sữa acidophil hoặc sinh khối khô của

vi khuẩn (với tên thường gọi là biolactovin-chế phẩm của viện công nghệ sinh học) sau 15 ngày có thể ngừng diễn biến của bệnh Liệu pháp này còn áp dụng có kết quả với bệnh thiếu vitamine, bệnh thiếu máu Ở cộng hòa Pháp và một số nước khác đã

dùng chế phẩm hỗn hợp sinh khối các chủng thuộc các giống L.acidophilus,

L.bulgaricus và Str.lactis đặc biệt hiệu quả trong việc phục hồi sự cân bằng hệ vi

sinh vật đường ruột của động vật có vú và người do dùng thuốc kháng sinh dài ngày hoặc liều cao [8]

* Vi khuẩn Bacillus

Các vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử sống hiếu khí tùy tiện,

nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn Chúng rất phổ biến trong tự nhiên Một số loài của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột

của người và động vật Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất

hữu cơ chứa nitơ, như protein khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh ra amylase làm loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan và thủy phân tiếp theo thành các dextrin và các loại đường hợp thành Một

số chủng thuộc loài Bacillus subtilis, B.mesentericus… có thể có khả năng sinh ra

enzyme cellulase và hemicellulase phân hủy cellulose, hemicellulose

Quá trình thủy phân có thể tóm tắt như sau:

Sản phẩm của quá trình là amoniac (NH3) trong dung dịch amoniac ở dạng ion amon (NH4+) và kiềm hóa môi trường (từ trung tính sang kiềm) Do đó, vi khuẩn

Bacillus còn được gọi là vi khuẩn amon hóa hay các vi khuẩn gây thối rửa Ngoài

amoniac, sản phẩm còn tạo ra H2S do phân giải các acid amine chứa lưu huỳnh như xistein, sixtin và methionin Ngoài H2S là một khí độc và thối, còn có các khí thối khác như indol, scatol và mercaptan là dẫn xuất của lưu huỳnh

Protease của vi khuẩn Bacillus là protease kiềm được dùng nhiều trong bột

giặt, trong rũ lông thuộc da, trong thủy phân protein của thịt, cá

Ngoài các enzyme trên, các vi khuẩn còn có khả năng sinh ra bacterioxin - chất có

hoạt tính kháng sinh như subtilin từ Bacillus subtilis, bacitraxin từ B.licheniformis… Các

chất có hoạt tính này thường không dùng trong y tế nên không xảy ra hiện tượng nhờn thuốc đối với các vi sinh vật gây bệnh, riêng bacitraxin là chất kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột và kích thích tiêu hóa cũng như tăng trọng của vật nuôi

Các vi khuẩn amon hóa còn thấy ở các giống Pseudomonas, Proteus, E.coli,

Clostridium, xạ khuẩn, nấm sợi… Đây là các vi sinh vật dị dưỡng hoại sinh Trong

chế phẩm probiotic người ta thường sử dụng các chủng thuộc giống Bacillus:

Protein polypeptit oligopeptit axit amin NH3

B.subtilis, B.mesentericus, B.megathericum, B.licheniformis… Các chủng của

những loài này rất có ích, không gây bệnh cho người và động vật, đặc biệt là trong đường ruột

Như đã trình bày, các đại diện của các giống Bacillus đóng vai trò quan trọng

trong việc vô cơ hóa các hợp chất hữu cơ Thuộc về giống này là các vi khuẩn hình que với chiều dài khác nhau, thường gram dương, di động nhờ chu mao và có các

đặc điểm sinh lý khác nhau Các loài thuộc giống Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn

sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút Tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật mà bào tử nằm ở chính giữa, nằm ở gần đầu hoặc ở đầu tế bào

Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng với các điều kiện bất lợi Đó là những tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh Bào tử có màng nhiều lớp, chứa ít nước tự do và do đó có thể chịu đựng tốt với nhiều tác động bất lợi có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng Ở phần lớn vi khuẩn, trong tế bào chỉ có một bào tử Khi bào

tử được hình thành, ta thấy tế bào và các phần còn lại bị hủy đi và làm cho bào tử được rời ra Gặp các điều kiện thuận lợi bào tử sẽ nảy mầm Mỗi bào tử cho ra một

tế bào dinh dưỡng

Khi quan sát tiêu bản vi khuẩn sống, rất dễ dàng phân biệt được bào tử bởi vì chúng làm chiết quang rất mạnh Với các phương pháp nhuộm màu thông thường bào tử không bị nhuộm màu hoặc chỉ nhuộm được màu rất nhạt trông giống như các thể ẩn nhập sáng trên một nền tế bào chất nhuộm màu Để nhuộm bào tử phải được

xử lý bằng các dung dịch thuốc nhuộm đậm đặc và vừa nhuộm vừa phải đun nóng

Để xác định được vị trí của bào tử trong tế bào phải được sự nhuộm màu tương phản so với phần còn lại của tế bào Phương pháp tốt nhất để quan sát bào tử và vị trí của chúng trong tế bào là phương pháp soi các tế bào sống với kính hiển vi có thiết bị tương phản pha [8]

Trong đất thường gặp nhất các loài thuộc giống Bacillus sau đây:

+ Bacillus subtilis: khuẩn lạc khô, vô màu hay có màu xám nhạt, trắng, hơi

nhăn hay tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch Trực khuẩn ngắn nhỏ kích thước từ 3-5x0,6µm, nhiều khi nối lại thành sợi dài, ngắn khác nhau và có thể đứng riêng rẽ Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36-500C, tối đa là 600C Bào tử chịu được nhiệt khá cao, có hình bầu dục 0,9-0,6µm, phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm

+ Bacillus mensentericus-trực khuẩn gần giống B.subtilis Nhiệt độ tối thích cho

sinh trưởng là 36-450C, tối đa là 50-550C, ở pH= 4,5-5,0 ngừng phát triển

Khuẩn lạc thường bám chặt vào môi trường thạch, có khi dính vào môi trường, mỏng, nhăn nheo, màu xám nhạt-trắng, màu krem hoặc vàng nâu Có nhiều loài

khác nhau Thường gặp B.mesentericus ruber, khuẩn lạc có màu hồng và

B.mesentericus niger khuẩn lạc có màu đen Trực khuẩn mảnh, dài hoặc ngắn

3-10x0,5-0,6µm, đứng riêng rẻ hoặc thành chuỗi dài, bào tử hình bầu dục và kéo dài 0,9-0,5µm, nằm ở vị khí bất kỳ trong tế bào, tế bào không phình to ra khi hình thành bào tử

Hoạt tính amylase và protease cao hơn hẳn B.subtilis, nhưng lên men đường

lại kém hơn

Hai trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, trước hết là sản phẩm có hợp chất nitơ (protein) và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, nước quả, xiro…), sống kí sinh ở bánh mỳ, hạt nâu Các trực khuẩn này được dùng trong công nghiệp sản xuất enzyme amylase, protease, trong tự nhiên chúng phát triển và sinh ra các vật chất đối kháng (có tính kháng sinh) ức chế sinh trưởng nhiều vi khuẩn gây bệnh và hoại sinh Các chất này thường gọi là bacterioxin

Trong đất, trong nước và rác thải ta thường gặp nhiều Bacillus Có thể nói ở

đâu có các hợp chất hữu cơ tự nhiên là ở đây có thể gặp các chủng của hai giống này Chúng có thể hiếu khí, nhưng cũng có thể phát triển và hoạt động ở trong điều kiện kỵ khí tùy nghi

+ B.cerus khuẩn lạc phẳng, khá khuyếch tán với bề mặt hơi xù xì (dạng bột,

hạt nhỏ), hơi lõm, đục, mép lồi lõm Tế bào dày, rộng 1,0-1,5µm, dài 3-5µm, có khi

dài hơn, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi, thành sợi Bào tử hình bầu dục,

1,2-1,5x0,9µm, nằm lệch tâm Tế bào chất dạng hạt hoặc chứa không bào

+ B.simplex - khuẩn lạc giống B.cereus var mycoides - khuẩn lạc phẳng, có

dạng rễ cây hoặc dạng khuẩn ty (sợi nấm) bám sát vào môi trường Tế bào 5-10x0,8-1,2µm, đôi khi dài hơn, đứng riêng rẽ hay thành chuỗi, thành sợi dài Tế

bào chất có dạng chứa không bào Bào tử hình kéo dài, hình bầu dục,

1,0-1,5x0,8-1,0µm nằm lệch tâm

+ Bacillus megaterium - khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, không có

nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống như giọt bạch lạp (nến trắng),

lồi, nhẵn, nhưng thường có vòng, hoặc các vòng đồng tâm trên bề mặt, màu trắng

sữa, màu krem, có khi màu nâu nhạt, có ánh mỡ hay có dạng đục đến 2µm và chiều

dài từ 3-10x12µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và có

nhiều các chất dinh dưỡng dự trữ (mỡ, glycogen) Bào tử hình o van hay hình kéo dài

1,5x0,7-1,0µm, nằm lệch tâm, thường theo chiều ngang hay chiều xiên của tế bào

+ Bacillus polymyxa - khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn và nhày, đôi khi

mép có thùy Tế bào 2,0-7,0x0,6-1,0µm, đứng riêng rẻ, hay xếp đôi, thành chuỗi

ngắn Khi hình thành bào tử sẽ phồng nên hình quả chanh hay có dạng giống như

Clostridium Bào tử hình bầu dục, hình kéo dài 2,6-1,7µm nằm ở giữa tế bào, khi

hình thành bào tử, tế bào phồng lên một chút giống như Clostridium

+ B.brevis - khuẩn lạc màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng, lấp

lánh, mép có răng cưa, giống dạng mỡ đặc Tế bào 3-5x0,7-1,0µm, đứng riêng rẽ,

đôi khi xếp thành chuỗi Bào tử hình bầu dục, 0,8-1,0µm về chiều ngang, nằm ở

cuối tế bào và làm cho tế bào hơi phồng to lên

+ Pseudomonas - khuẩn lạc chuyển động với tiêm mao ở đầu tế bào, gram

dương Nhiều loài của giống này ưa lạnh, nhiệt độ tối thiểu là -2÷50C, tối thích là

20-250C, có hoạt tính amylase và protease có khả năng lên men nhiều loại đường và

tạo màng nhầy Trong môi trường có pH dưới 5,5 các vi khuẩn này bị kìm hãm phát

triển và sinh tổng hợp protease, nồng độ NaCl tới 5-6% thì sinh trưởng bị ngừng trệ

Nhiều loài Pseudomanas được dùng trong công nghiệp sản xuất enzyme và

acid amine Một số loài gây bệnh bacterioz cho cây trồng và tham gia vào làm hư

hỏng thực phẩm, giống như Bacillus các chủng Pseudomanas bao giờ cũng thấy ở

cống rãnh nước thải, trên bề mặt rác thải, chúng được mệnh danh là vi khuẩn rác rưởi hay cống rảnh

+ Proteus vulgaris: Trực khuẩn nhỏ, gram âm, không sinh bào tử Tùy thuộc

vào điều kiện sống các tế bào của loài này thay đổi hình dạng, kích thước đáng kể Đặc điểm của trực khuẩn này là chuyển động rất nhanh Chúng là các thể kỵ khí tùy tiện, sinh trưởng trong môi trường giàu hydratcacbon sẽ tạo thành một lượng lớn

CO2 và H2 Tính chất gây thối rữa của loài này thể hiện rất rõ khi chúng phân hủy các sản phẩm có protein thành các chất H2S, NH3 và indol Proteus phát triển tốt ở

nhiệt độ 250C cũng như 370C, ngừng sinh trưởng ở khoảng 50C

Trên môi trường đặc vi khuẩn sẽ mọc lan ở dạng mỏng bán trong suốt

+ Clostridium putreficum - trực khuẩn sinh bào tử, chuyển động, kỵ khí Bào tử

chịu nhiệt cao, nằm ở giữa tế bào hoặc gần một đầu Sự tạo thành bào tử sớm (trong

ngày đầu nuôi cấy) là đặc điểm của loài này Clos.sporogenes lên men hydratcacbon

tạo thành acid và khí Nó có hoạt tính protease phân hủy protein cho H2S bay ra Nhiệt

độ thích hợp cho phát triển là 35-400C, tối thiểu 50C

Cả hai loài Clostridium đều là kẻ phá hoại đồ hộp thịt, cá, giăm bông, xúc

xích, giò chả…[8]

Phân lập và tuyển chọn các giống Bacillus

Như chúng ta đã biết, vi khuẩn Bacillus rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là

vùng đất nhiều mùn Như vậy ta có thể dùng đất vườn làm nguồn phân lập các

chủng Bacillus tự nhiên

Từ đất vườn ta lấy khoảng vài gam hòa tan vào 10ml nước vô khuẩn Từ dịch huyền phù đất (lấy phần nước, bỏ cặn sau khi hòa đất vào nước) lấy ra 1ml hòa vào 10ml nước vô trùng tiếp theo và tiếp tục pha loãng 100 (102)… đến 107 hoặc hơn nữa Từ dịch pha loãng 104…106 ta lấy 1 giọt hoặc 1-2ml gieo cấy vào môi trường

đã chuẩn bị trong các hộp petri và dùng que gạt trang đều trên bề mặt Thao tác pha

loãng và gieo cấy cần phải làm trong điều kiện vô trùng Sau đó để các đĩa petri đã gieo cấy giống vào tủ ấm 300C trong 1-2 ngày Các đĩa làm đúng kỹ thuật mọc các khuẩn lạc riêng biệt và nhìn bằng mắt thường hoặc kính lúp xem đối chiếu với hình

thái, màu sắc khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ các loài thuộc giống Bacillus, rồi tách ra

cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm

Sau đó kết hợp với soi kính, nhuộm gram và xác định các đặc tính sinh lý, sinh

hóa… ta có thể sơ bộ phân loại các chủng Bacillus đã được phân lập và phân loại

Cũng từ phương pháp trên ta có thể cải tiến một khâu trong công việc phân lập

các chủng Bacillus Vi khuẩn Bacillus là các trực khuẩn sinh bào tử Vì vậy, dịch

huyền phù đất (đất vườn + nước) được gia nhiệt ở nhiệt độ 80-850C trong 15 phút

để sơ bộ diệt các tạp khuẩn khác rồi mới pha loãng và công việc tiếp theo như trên

Riêng Bacillus subtilis thường được gọi là trực khuẩn cỏ khô, vì chúng rất thích hợp được phát triển trên cỏ khô và vi khuẩn Bacillus mesentericus rất thích

hợp phát triển trên khoai tây, do đó được gọi là trực khuẩn khoai tây

Để phân lập được dễ dàng các chủng Bacillus subtilis ta lấy cỏ khô ở ngoài

vườn, cắt thành các đoạn nhỏ khoảng 1cm, bỏ vào các bình tam giác có chứa sẵn môi trường phân lập (môi trường ngập vừa cỏ khô) Có thể rắc thêm một ít bột CaCO3 lên

bề mặt cỏ Gia nhiệt tới 850C, giữ ở nhiệt độ này 15 phút Có thể tiến hành phân lập không có nguồn dịch huyền phù là đất vườn hoặc dịch huyền phù từ đất vườn Nếu dùng dịch huyền phù đất vườn thì lấy 1-2giọt dịch huyền phù nhỏ vào bình tam giác

có môi trường phân lập và cỏ rồi mới gia nhiệt

Các bình tam giác sau khi gia nhiệt ở 850C được đậy hoặc nút kín và đặt vào tủ

ấm 300C trong 2 ngày Vi khuẩn Bacillus subtilis thường mọc thành lớp nhầy trên

mặt cỏ Lớp nhầy này bằng que cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng và tiếp tục nghiên cứu

- Với vi khuẩn Bacillus mesenterius ta phân lập như sau: khoai tây được cắt

thành các thỏi dài có kích thước 0,5x0,5x3cm đặt vào các hộp petri phía đáy lót giấy lọc đã đổ một lớp môi trường phân lập (môi trường chỉ ngập 1/3 đến 2/3 thỏi khoai tây) Rắc một ít bột CaCO3 quanh thỏi khoai tây và gia nhiệt Có thể thêm 1-2 giọt

dịch huyền phù đất vườn hoặc không Sau khi gia nhiệt ở 850C trong 15 phút, đặt đĩa có khoai tây vào tủ ấm 300C trong 2 ngày Các vi khuẩn B.mesentericus thường

mọc trên bề mặt khoai tây thành lớp váng nhầy Từ đây được cấy chuyền sang môi trường thạch nghiêng làm giống nghiên cứu [8]

Sự phân hủy cơ chất của enzyme amylase và protease [17]

+ Enzyme protease:

Protease là enzyme xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid [-CO-NH-] giữa các L-acid amine trong phân tử protein hoặc các nhóm polypetid thành acid amine Protease có chức năng sinh học rất đa dạng đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống Ngoài chức năng xúc tác phản ứng thủy phân protein thành các acid amine và các chất có phân tử lượng thấp mà tế bào

có thể dễ dàng hấp thụ, protease còn có vai trò quyết định trong thiết lập sự cân bằng giữa tổng hợp và phân giải protein Bên cạnh đó chúng còn tham gia vào các quá trình khác như hình thành và nảy mầm bào tử của vi sinh vật, đông tụ máu, điều chỉnh huyết áp, biến hình các enzyme và điều hòa sự biểu hiện gen, Có thể chia protease thành hai nhóm protease nội bào và protease ngoại bào

- Cơ chế phân giải protein: Đầu tiên vi sinh vật tiết ra các enzyme ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các hợp chất có khối lượng nhỏ (các polypetid, oligopeptid) Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các acid amine nhờ các peptidase ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành acid amine Một phần các acid amine này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được tiếp tục phân giải để tạo thành NH3 và các sản phẩm khác Protein polypetid acid amine NH3

Quá trình này gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa, đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ hữu cơ thành dạng vô cơ (NH3) NH3 sẽ được chuyển hóa thành NO3 nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa Các hợp chất nitrat lại chuyển hóa thành dạng nitơ phân tử nhờ nhóm vi khuẩn khử nitrat Các vi khuẩn tham gia vào quá

trình amon hóa là B.mycoides, B.subtilis, B.cereus, Pseudomanas fluorescens,

P.aerurinosa… Như vậy, vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease mạnh là các vi

khuẩn thuộc giống Bacillus và Pseudomanas

+ Enzyme amylase

Các amylase có nguồn gốc khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế

tác dụng cũng như sản phẩm cuối Nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột

như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn nhưng α-amylase chủ yếu được tổng hợp từ

Bacillus như B.subtilis, B.licheniformis… Enzyme amylase của B.subtilis có khối

lượng phân tử là 9900Da Amylase của B.subtilis không đòi hỏi phải có chất hoạt

hóa, pH tối ưu cho enzyme B.subtilis là 5,0-6,0 Amylase củ B.subtilis được đông

khô bền với canxi acetate và natri acetate Enzyme α-amylase được dùng cho các

giai đoạn phân hủy đầu tiên trong trao đổi chất của tinh bột Nó là một trong những

enzyme đầu tiên được nghiên cứu

- Cơ chế phân hủy tinh bột: enzyme phân hủy tinh bột phân cắt chủ yếu liên

kết α-glucosezit Nhóm liên kết này gồm các enzyme: α-amylase, β-amylase,

glucoseamylase và dextrinaza

+ α-amylase: enzyme này xúc tác quá trình thủy phân liên kết α-1,4 glucosezit

bên trong mạch tinh bột và được phân loại là endoenzyme Sản phẩm tạo thành chủ

yếu là dextrin phân tử thấp, một lượng nhỏ mantoza và glucosese

Tinh bột α-dextrin (nhiều) + mantoza + glucosese (ít)

+ β-amylase: enzyme này tác động lên liên kết α-glucosezit từ đầu chuỗi tinh

bột đến liên kết α-1,6-glucosezit Sản phẩm tạo thành chủ yếu là mantoza và một

lượng nhỏ dextrin cao phân tử

Tinh bột 54-58% mantoza + 42-46% dextrin

+ Glucoseamylase: là enzyme loại exo và thủy phân các đầu không khử tạo

thành đường glucosese

Tinh bột 100% glucosese

Các chủng vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas có khả năng sinh enzyme

α-amylase cao Ngày nay, việc thu enzyme α-amylase và protease từ các chủng vi

α-amylaza

β-amylaza

Glucoamylaza

khuẩn chịu mặn, chịu kiềm rất được quan tâm vì những ưu điểm có được từ các loại enzyme thu được trong việc ứng dụng: bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản, làm nước mắm, tạo chế phẩm sinh học…

Một số ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

Dựa trên những đặc điểm được nghiên cứu về các chủng Bacillus, người ta thấy rằng các loài vi khuẩn Bacillus này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong

môi trường đất và nước nghèo dinh dưỡng Đặc biệt chúng có khả năng phân hủy thức ăn của tôm cá, phế thải hữu cơ, làm sạch môi trường nhờ enzyme do chúng tổng hợp được Ngoài ra chúng có khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn bacterioxin-một chất kháng sinh được dùng nhiều trong chăn nuôi để nâng cao hiệu suất tăng trưởng, hiệu suất sử dụng thức ăn cho gia súc, làm giảm sự phát triển của vi sinh vật

có hại Người ta đã lợi dụng những đặc điểm này để sản xuất một số chế phẩm vi sinh cải thiện môi trường nước nuôi tôm

Một số nghiên cứu trên chủng vi khuẩn thuộc loài B.subtilis có khả năng sinh

hoạt tính protease mạnh đã được ứng dụng trong quy trình chế biến nước mắm và

đã cho kết quả tốt Sản xuất nước mắm theo phương pháp cổ truyền mất từ 6-12 tháng, khi bổ sung vi khuẩn này chỉ mất 60-70 ngày

Các chủng Bacillus có hoạt tính enzyme protease cao được dùng trong công

nghiệp chế biến sữa, làm mềm thịt, tăng hương vị thịt khi chế biến, làm trong bia và nước hoa quả… Ngoài ra, protease phân lập từ các chủng này được bổ sung vào các loại nước tẩy rửa và bột giặt nhằm loại bỏ các vết bẩn có nguồn gốc protein

Các chủng Bacillus, Pseudomanas có khả năng sinh enzyme α-amylase được

sử dụng để hồ vải, sản xuất rượu bia, đường glucosese, maltoza, làm thuốc chống rối loạn tiêu hóa, làm mềm bánh mì… Đặc biệt, enzyme α-amylase từ chủng vi

khuẩn B.circular và Crytococus sp S-2 có thể phân giải tinh bột sống Điều này rất

hữu ích cho công nghiệp lên men vì có thể bỏ qua giai đoạn đường hóa và dịch hóa, tiết kiệm được thời gian và năng lượng

* Vi khuẩn quang dưỡng

Vi khuẩn quang dưỡng sống ở vùng kỵ khí nhiều nước, trong các ao hồ nước

nông, trong các dòng nước chảy chậm, trong hồ và vịnh biển nhỏ Vì vi khuẩn tía

lưu huỳnh thường tạo thành màng màu hồng hoặc đỏ thẫm trên bề mặt bùn hoặc trên các vật liệu thực vật đang bị phân hủy Đôi khi chúng sinh sản trên mặt bùn tạo thành một lớp dày đến một hoặc vài decimet Hiện tượng “nước nở hoa” ở những

thủy vực nước nông do các đại diện lớn của Thiorhodaceae-Chromatium okenii,

Ch.waraminegii, Ch.weissei và Thiospirillum jensence, ngoài ra còn gặp các đại

diện nhỏ của Chromatium cũng như các vi khuẩn lưu huỳnh xanh Thường xuyên có thể tìm thấy Athiorhdaceae nhưng hiếm khi có khối lượng lớn

Trong ao hồ, đầm, vịnh ta thấy hệ vi khuẩn phân bố như sau:

- Lớp mặt tảo đơn bào, tảo đa bào và vi khuẩn lam

- Lớp kế tiếp là các vi khuẩn hiếu khí dị dưỡng như Pseudomonas, Bacillus,

Cytophaga

- Lớp dưới (trung gian trên tầng đáy) là các vi khuẩn màu tía, màu lục

- Lớp đáy là các vi khuẩn khử sulfat, các thể sinh metan và các loài

Clostridium kỵ khí nghiêm ngặt

Sự phát triển ồ ạt có tính thời vụ của vi khuẩn quang dưỡng được thấy ở vùng

kỵ khí của hồ thấp hơn vùng có sự thay đổi nhiệt độ đột ngột Vi khuẩn ở đây cần

H2S, CO2 và các hợp chất hữu cơ Các tia hồng ngoại của ánh sáng không đi qua được độ sâu 10-30m Với độ sâu như vậy, phổ phân phối tối đa năng lượng thích hợp với vùng lọc ánh sáng 450-500nm (vùng quang phổ xanh và xanh lục) Với vùng quang phổ như vậy chỉ có carotenoid hấp thụ được ánh sáng Điều này cho thấy tại sao các sắc tố trong vi khuẩn tía lại có hàm lượng cao tương đối vậy Carotenoid (cũng giống như ở tảo và tảo lục) giúp cho vi khuẩn trao đổi chất quang hợp ở vùng có độ sâu lớn Thích ứng ở vùng này có các vi khuẩn giàu carotenoid có

màu nâu (các loài Chlorobium phacobacteroides, Chl.phacovibroides thuộc nhóm

Chlorobiaceae)

Trong công tác bảo vệ môi trường, làm sạch nước thải người ta chú ý nhiều đến vi khuẩn Trước hết là nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh để phân hủy các chất hữu cơ làm nhiễm bẩn nước, sau đó là nhóm vi khuẩn amon hóa nitrat và phản nitrat cùng với nhóm vi khuẩn quang dưỡng (khử H2S) và nhóm vi khuẩn khử sunfat

Nguồn H2S là do các acid amine có chứa lưu huỳnh (xistein, sixtin, methionin)

bị phân hủy và các nguồn sunfat biến đổi tạo thành làm ô nhiễm môi trường nước

H2S là chất khí có độc tính cao Nhóm vi khuẩn lưu huỳnh phát triển sẽ khử H2S và tham gia làm sạch nước Ngoài việc phân hủy H2S chúng còn có thể tham gia vào việc phân hủy các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là một số hợp chất mạch vòng [17]

Đặc điểm hình thái của vi khuẩn quang dưỡng

Vi khuẩn quang dưỡng (phototroph) - những vi sinh vật nước điển hình phổ

biến cả trong nước ngọt, nước lợ cũng như nươc mặn Có thể chia chúng thành 3 nhóm sau:

- Vi khuẩn tía không lưu huỳnh (Athiorhodaceae)

- Vi khuẩn tía có lưu huỳnh (Thiorhodaceae)

- Vi khuẩn lưu huỳnh màu xanh (Clorobiceae)

Theo Bergey, tên mới của vi khuẩn tía không lưu huỳnh là Rhodospirillaceae, của vi khuẩn tía có lưu huỳnh là Chromatiaceae

Ánh sáng là nguồn năng lượng đối với tất cả các loài vi khuẩn quang dưỡng Quang hợp ở vi khuẩn xảy ra ở điều kiện kỵ khí và không kèm theo sự tách oxi Điều khác biệt với thực vật (cây xanh) là vi khuẩn quang dưỡng không sử dụng nước làm chất cho H+, chúng yêu cầu những chất cho (donor) có mức độ khử cao hơn Vi khuẩn quang dưỡng có nhiều hình thái khác nhau: hình cầu

(Amoebobacter), hình que (Thiodictyon), hình dấu phẩy (Ectothiorhodospira)… Các đại diện của Athiorhodaceae sử dụng các chất hữu cơ có khả năng cho H+, còn H2S ở mức độ nào đó sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng Đa số các loài của

chi này (chẳng hạn như: Rhodospirillium rubrum hoặc Rhodopseudomanas

sphervides) có khả năng sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí trong tối Khi đó các hạt

lưu huỳnh tạm thời nằm lại trong tế bào Những vi khuẩn này nhận được nguồn cacbon cần thiết bằng con đường cố định CO2 tương tự như các sinh vật quang tự

Vi khuẩn quang dưỡng Gram âm, chuyển động nhờ tiêm mao nằm ở một hoặc

hai đầu tế bào Nhóm vi khuẩn tía lưu huỳnh gồm Chromatium okenii (5x20µm) và

Thiospirillum jenense (3,5x5,0µm) là một loại vi khuẩn khổng lồ Những vi sinh vật

này đã gây sự chú ý đặc biệt cho các nhà khoa học khi quan sát chúng qua kính hiển

vi Chúng chuyển động nhờ tiêm mao và dưới ảnh hưởng của một số chất kích thích

khác Chr.warmingii khác biệt với Chr.okenii ở chỗ: kích thước tế bào nhỏ hơn và

lưu huỳnh tập trung ở vùng cực

Những đại diện của giống Chromatium nếu ở kích thước lớn có dạng quả thận,

dạng hình que ở kích thước nhỏ hơn Những tế bào hình cầu chuyển động là đặc

điểm của giống Thiocystis (Th.Violacea,Th.gelatinosa) Những tế bào Thicapsa

roseopersicina và Th Pfennigii cũng có dạng hình cầu nhưng không chuyển động

Những loài thuộc giống Ectothiorhodospira có dạng hình dấu phẩy (Vibrio) và khác

biệt với tất cả các vi khuẩn tía ở chỗ oxi hóa H2S, chúng không tích lũy lưu huỳnh - sản phẩm trung gian của sự oxi hóa - trong tế bào mà ở ngoài tế bào Ở nhiều vi khuẩn tía có không bào

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh gồm ba giống: các loài hình que thuộc giống

Rhodopseudomonas, các loài Rh.visidis, Rh.spheroides, Rh.capsulata, Rh.palustris

và Rh.gelatinosa khác nhau ở đặc tính sinh lý, hình thái và phương thức sinh sản Các loài có hình xo ắn Rh.rubrum, Rh.fulvum, Rh.molischianum và Rh

Photometricum thuộc giống Rhodospirillium khác nhau về hình thái và kích thước

Các vi khuẩn xanh có chứa lưu huỳnh cũng đã được nghiên cứu, đó là

Cholorochromatium, chúng là một quần thể tế bào, chuyển động nhờ tiêm mao dài

mọc ở đầu

Nói chung các tế bào vi khuẩn quang dưỡng sinh sản bằng cách phân đôi nhưng có nhiều loài thuộc nhóm vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể sống và hoạt động ở điều kiện vi hiếu khí Sinh trưởng trong điều kiện có ánh sáng tế bào của chúng thường có màu đỏ tía (huyết dụ), tím, nâu vàng, nâu hay xanh Sự khác nhau

về màu sắc là do khả năng hấp thụ ánh sáng Khi sinh trưởng trong môi trường có hợp chất lưu huỳnh và được chiếu sáng vi khuẩn tía lưu huỳnh tích tụ nguyên tố này

ở dạng giọt trong tế bào, còn các vi khuẩn tía không lưu huỳnh thì không có hiện tượng này Đây là đặc tính cơ bản phân loại hai nhóm vi khuẩn tía [17]

Phân loại dinh dưỡng của vi khuẩn quang dưỡng

- Quang tự dưỡng vô cơ:

Vi khuẩn quang dưỡng là các thể quang tự dưỡng vô cơ có thể sử dụng các chất vô cơ như CO2, H2S để xây dựng tế bào Ngoài ra chúng còn là các thể quang dưỡng hữu cơ sử dụng các chất hữu cơ làm chất khử trong quá trình oxi hóa các hợp chất này để thu năng lượng và các vật liệu tế bào

Các vi khuẩn lưu huỳnh thường sống ở tầng đáy thủy vực với điều kiện kỵ khí hoặc vi hiếu khí, có khả năng hấp thụ ánh sáng cao hơn vi khuẩn lam, tảo và cây xanh Trong tế bào vi khuẩn lưu huỳnh chứa sắc tố làm cho tế bào có màu tía (huyết dụ) và màu xanh lục Các sắc tố trong tế bào của các vi khuẩn này là bacteriochlorophyll (khuẩn diệp lục) và carotenoid Hệ thống quang hợp bao gồm cytochrom, quinon và feredoxin (protein chứa sắt, không chứa nhân hem) Quá trình quang dưỡng vô cơ, CO2 được đồng hóa và phụ thuộc vào chất cho điện tử ở môi trường như lưu huỳnh, hợp chất lưu huỳnh, H2 hay các hợp chất hữu cơ đơn giản làm chất khử

H2S + O2 H2S + 2S + năng lượng (Q)

2H2S + CO2 (CH2O) + 2S + H2O

Phương trình quang dưỡng có thể viết khái quát như sau:

CO2 + 2H2A (CH2O)n + 2A + H2O

Sản phẩm A sẽ là oxi tự do trong trường hợp sinh vật quang hợp là tảo, vi khuẩn lam, cây xanh A sẽ là S2 khi quang hợp không giải phóng oxi Có ít trường hợp chất hữu cơ oxi hóa đóng vai trò là H2A

Quá các phương trình trên ta thấy:

- Chất cho điện tử là H2S, S, H2, chất hữu cơ hay H2O

- Giải phóng ra oxi hay không tùy thuộc vào khả năng có quang oxi hóa nước hay không

- Nguồn năng lượng là hóa năng hay ánh sáng liên quan đến sắc tố của tế bào sinh vật [17]

- Quang tự dưỡng hữu cơ:

Ngoài khả năng tự dưỡng vô cơ: cố định CO2 và khử hợp chất lưu huỳnh của 3 phân nhóm vi khuẩn này, người ta còn chú ý đến khả năng quang tự dưỡng hữu cơ của chúng Khả năng này tập trung chủ yếu vào vi khuẩn tía không lưu huỳnh và vi khuẩn lưu huỳnh xanh lục

* Vi khuẩn tía lưu huỳnh

Vi khuẩn tía lưu huỳnh (Chromotiaceae) đòi hỏi kỵ khí và có ánh sáng bắt buộc

cho sinh trưởng Trong môi trường CO2 được dùng như nguồn cacbon duy nhất Trao đổi cacbon ở các vi khuẩn này đi theo chu trình Calvin với enzyme chìa khóa là Ribulose Biphosphat carboxylase/oxygenase Ngoài ra chúng có thể đồng hóa được acetate, pyruvate khi được chiếu sáng Nói chung các vi khuẩn tía lưu huỳnh sử dụng các nguồn cacbon hữu cơ là rất hạn chế

* Vi khuẩn tía không lưu huỳnh

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh: Ngoài khả năng quang dưỡng cố định CO2 còn

có khả năng sử dụng nhiều chất hữu cơ làm nguồn cacbon cho sinh trưởng Chúng

có cơ chế trao đổi chất hữu cơ rất linh hoạt Vi khuẩn tía không lưu huỳnh cố định

CO2 theo con đường khử pentose-phosphat của chu trình Calvin là con đường chính Ngoài ra chúng còn thích ứng với một vài đường trao đổi chất khác tùy điều kiện sống Nhiều chủng loài thuộc các giống này có thể sống và sinh trưởng được trong điều kiện kỵ khí và trong bóng tối Chúng sống nhờ chuỗi truyền điện tử hô

hấp với các chất nhận điện tử như NO3- làm nguồn dinh dưỡng mà cố định nitơ của chuỗi phản ứng nitrat

Trong nhiều trường hợp với các điều kiện khác nhau, vi khuẩn tía không lưu huỳnh có thể sử dụng năng lượng sinh ra trong hô hấp kỵ khí hoặc trao đổi chất theo kiểu lên men (kỵ khí) Sản phẩm lên men gồm các acid hữu cơ, CO2 và H2 Cơ chất là fructose thì sản phẩm có thể là succinate, acetate, propionate, formate, CO2 và nước nhưng khi lên men pyruvate sẽ tạo ra acetate, formate, CO2 và H2

Vi khuẩn tía không lưu huỳnh còn có thể sống trong điều kiện hiếu khí, một cách chính xác hơn là trong điều kiện vi hiếu khí chúng vẫn hoạt động bình thường

Ở điều kiện này chúng trao đổi chất theo kiểu hô hấp hiếu khí Phần lớn nguồn cacbon được oxi hóa hoàn toàn theo chu trình Kreb Ở ngoài ánh sáng sinh trưởng của loại vi khuẩn quang dưỡng này phụ thuộc vào thế năng Do có cơ chế điều chỉnh trao đổi chất “uyển chuyển” nên vi khuẩn này có thể sử dụng được nhiều nguồn cacbon để đồng hóa tế bào

Các chất hữu cơ mà vi khuẩn tía không lưu huỳnh sử dụng được là các hợp chất 1C, 2C, 3C như formate, acetate, metanol… và cả pyruvate, propionate, malat, glyxerol cùng một số đường đơn

Metanol được sử dụng bởi một số chủng vi khuẩn tía không lưu huỳnh khi sinh trưởng ngoài ánh sáng Metanol có thể khử thấp hơn so với vật liệu tế bào nên đòi hỏi phải có thêm CO2 với vai trò làm chất nhận điện tử PH thích hợp cho vi khuẩn quang hợp khi có metanol thường cao hơn khi sử dụng cơ chất khác

Để đồng hóa 2 phân tử metanol thành vật liệu tế bào (CH2O) cần phải bổ sung thêm một phân tử CO2 Metanol được oxi hóa tới formandehyt, sau đó tới chu trình Calvin Ở đây vai trò của enzyme RubisCo đóng 2 vai trò quan trọng: enzyme chìa khóa cho quá trình đồng hóa CO2 và enzyme xúc tác để CO2 có chức năng như một chất nhận điện tử

Đối với đường đơn (glucosese, fructose), một số loài có khả năng đồng hóa nhờ hệ thống enzyme vận chuyển phosphotranferase Glucosese được biến đổi theo con đường ED (Entner-Doudoroff), còn fructose lại đuợc chuyển hóa qua con đường EMB (Embden-Meyerhof-Paranas)

Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng thực tế CO2 là cần thiết cho sinh trưởng của vi khuẩn tía không lưu huỳnh, nhưng không phải là nguồn cacbon chính, vì

nó có thể dễ dàng được thay thế bới các chất nhận điện tử khác không có vai trò trực tiếp trong quá trình đồng hóa cacbon Vai trò quan trọng của enzyme RubisCo và chu trình Calvin trong trường hợp này là giữ cân bằng thế oxi hóa khử của tế bào

Ngoài đặc tính trên người ta còn phát hiện thấy vi khuẩn tía không lưu huỳnh còn có khả năng phân hủy một số chất hữu cơ mạch vòng Một số chất như benzal, benzoat, benzoinformate… có thể được vi khuẩn này sử dụng trong điều kiện kỵ khí, ở điều kiện hiếu khí thì không Trong điều kiện kỵ khí các acid mạch vòng bị este hóa nhờ thioeste-CoA tạo ra benzoyl-CoA Sau đó phức hợp này được hấp thụ vào tế bào Vòng benzen bị phá vỡ theo kiểu khử và sản phẩm tạo ra làm cơ chất cho hàng loạt các phản ứng tạo ra β-xetothioeste Cấu trúc vòng này sau đó bị phá

vỡ để tạo thành 1 acid 7C chứa 2 nhóm cacboxyl [17]

* Vi khuẩn xanh lục lưu huỳnh

Nhóm vi khuẩn xanh lục gồm hai họ: Chlorobiaceae (vi khuẩn lục lưu huỳnh) và

Chloroflexaceae (vi khuẩn xanh lục chuyển động) Chúng được xếp chung vào một

nhóm vì cùng có hai loại khuẩn diệp lục e và g, cơ quan quang hợp là Chloroxom Còn

sự trao đổi chất, hệ thống quang hợp và phân loại thì khác xa nhau

Đại diện của hai họ này là các giống Chlorobium và Choloflevus Chúng cố

định CO2 theo cơ chế hoàn toàn khác nhau Chlorobium cố định CO2 theo chu trình

Kreb với chiều khử, Choloflevus lại cố định CO2 theo con đường propionatee

3-hydroxy-Cả hai giống đều có thể sử dụng các chất hữu cơ cho sinh trưởng Giống thứ nhất có khả năng đồng hóa một số hợp chất hữu cơ tới mức độ nhất định Khả năng này chỉ biểu hiện khi có mặt CO2 và nguồn điện tử vô cơ Giống thứ hai có thể sinh trưởng với rất nhiều nguồn cacbon khác nhau ở điều kiện quang dưỡng cũng như hóa dưỡng

Các nghiên cứu cho thấy: các vi khuẩn lục lưu huỳnh có khả năng sử dụng cả

CO2 và các chất hữu cơ làm nguồn cacbon cho sinh trưởng Khi Chlorobium sinh

trưởng ngoài ánh sáng có thể sử dụng một số hợp chất hữu cơ đơn giản nhưng cần

phải có mặt CO2 hoặc cùng với các hợp chất khử của propionate, pyruvate, glutamat, glucosese Các hợp chất này sẽ biến đổi thành acetyl-CoA và đi vào chu trình Krebs theo chiều khử

Các loài vi khuẩn thuộc giống Choloflevus có khả năng tự dưỡng với CO2 làm nguồn cacbon duy nhất và sulfit là nguồn cho điện tử Trong điều kiện đủ ánh sáng

loài Choloflevus aurantiacus cũng có thể sử dụng H2 để khử CO2 và sinh trưởng khá tốt Quá trình cố định CO2 của Choloflevus theo chu trình 3-hydroxyl

propionate Ở chu trình này Acetyl-CoA được cacboxyl hóa thành malonnyl-CoA Chất này được cacboxyl hóa lần nữa để tạo thành succinyl-CoA và cuối cùng tạo thành Acetyl-CoA và glyoxylat Acetyl-CoA quay về chu trình, còn glyoxylat được

coi là sản phẩm phụ Vi khuẩn Choloflevus cũng có khả năng đồng hóa một số hợp

chất hữu cơ

Như vậy vi khuẩn tía và xanh lục quang dưỡng là các thể quang tự dương vô

cơ và có thể quang tự dưỡng hữu cơ Đây cũng là các cơ thể quang hợp Để tiện so sánh quang hợp của vi khuẩn tự dưỡng (quang hợp không thải ra oxy) với quá trình quang hợp của cây xanh [17]

sẽ giúp cho bệnh nhân tiêu hóa tốt hơn, làm giảm tiêu chảy và các triệu chứng khác do không dung nạp lactose Tính trạng tiêu hóa kém saccarose ở trẻ sơ sinh

do thiếu hụt saccarase c ũng được khắc phục bằng cách cho uống Saccharomyces

cerevisiae, nấm men có chứa saccarase