Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh khoai tây

Cây khoai tây (Solanum tuberosum) có nguồn gốc ở vùng cao nguyên thuộc núi Andes (Nam Mỹ) ở độ cao 2000 đến 5000m. Cây khoai tây đã từ Nam Mỹ du nhập vào Tây Ban Nha vào khoảng năm 1570 và Anh Quốc vào năm 1590. Sau đó, nó được lan truyền khắp châu Âu và tiếp theo là châu Á (Hawkes 1994). Thế kỷ 17, người Châu Âu đã bắt đầu ăn khoai tây và nó đã trở thành một cây lương thực quan trọng của thế giới. Hiện nay, trên thế giới cây khoai tây là một trong những cây lương thực chính được xếp vào hàng thứ 4 trong số những cây lương thực quan trọng nhất của thế giới và được trồng ở 148 nước kéo dài từ 71 độ vĩ tuyến Bắc đến 40 độ vĩ tuyến Nam. Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc năm 2008 diện tích khoai tây trên thế giới là 18.380.000 ha với tổng sản lượng 323 triệu tấn. Trong đó, diện tích trồng khoai tây của Châu âu chiếm 52,6% chiếm 52,3% của thế giới. Châu á diện tích trồng khoai tây chiếm 30,6% chiếm 28,2% tổng sản lượng của thế giới. Hiện tại khoai tây đứng vào hàng thứ tư về nguồn lương thực nuôi sống con người, cùng với ngô, lúa mì và gạo.

CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lựa chọn chủng vi sinh vật hữu ích 3.1.1 Hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật Để phục vụ cho công tác nghiên cứu sản xuất chế phẩm, tiến hành lựa chọn chủng vi sinh vật có hoạt tính đối kháng vi khuẩn gây bệnh cao dựa vào hồ sơ chủng giống vi sinh vật hữu ích đề tài lưu giữ Bộ môn Vi sinh vật, Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa Trong nghiên cứu đề tài sử dụng 03 chủng vi khuẩn có hoạt đối kháng vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh khoai tây với đặc điểm hình thái khuẩn lạc thể hình bảng Hình Đặc điểm hình thái chủng vi khuẩn lựa chọn Bảng Nguồn gốc, đặc điểm hình thái khuẩn lạc hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn STT Ký hiệu chủng CX6 H7 C10 Nguồn gốc Hình thái khuẩn lạc Mê Linh Tròn, lồi, bóng, Hà Nội Mê Linh nhày, vàng chanh Trắng ngà, dẹt, bề Hà Nội Thường Tín mặt nhăn Trắng ngà, nhăn, tâm Hà Nội lồi tạo múi, nhày Chú thích: (+) có hoạt tính; (-) khơng có hoạt tính Hoạt tính sinh học Ức chế vi khuẩn Sinh tổng hợp gây bệnh AIA + + + - + + Chủng CX6 thuộc nhóm vi khuẩn (gram -) sống hiếu khí, ni cấy mơi trường thạch King B cho khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, trung bình, nhày, vàng chanh, sau ngày ni cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,5 - 1,8 mm Chủng H7 thuộc nhóm vi khuẩn (gram +) sống hiếu khí, ni cấy mơi trường thạch King B cho khuẩn lạc có màu trắng ngà, dẹt, bề mặt nhăn Sau ngày nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,5 - 2,0 mm Chủng C10 thuộc nhóm vi khuẩn (gram +) sống hiếu khí, nuôi cấy môi trường thạch King B cho khuẩn lạc có màu trắng ngà, nhăn, tâm lồi tạo múi, nhày Sau ngày nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 2,0 - 2,5 mm Kết kiểm tra hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật tổng hợp bảng Hình Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn Bảng Hoạt tính sinh học chủng vi sinh vật Ký hiệu chủng Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn Ức chế vi khuẩn gây bệnh Sinh tổng hợp AIA CX6 (đường kính vòng ức chế,D-d, mm) 24 (hàm lượng AIA hình thành, µgAIA/ml) 24,55 H7 26 - C10 24 30,61 Qua kết bảng cho thấy, chủng vi khuẩn có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cao với đường kính vòng ức chế dao động từ 24 - 26 mm, chủng có hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cao chủng H7 với đường kính vòng ức chế đạt 26 mm; hai chủng CX6 C10 có hoạt tính ức chế đạt 24 mm Ngồi hoạt tính ức chế bệnh héo xanh chủng vi khuẩn lựa chọn có khả sinh tổng hợp AIA, với hàm lượng AIA hình thành mơi trường sau ngày ni cấy dao động từ 24,55 – 30,61 µgAIA/ml Tính chất đa hoạt tính sinh học chủng có ý nghĩa việc làm tăng hiệu chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh sau 3.1.2 Đánh giá khả tổ hợp chủng vi khuẩn lựa chọn A Mối quan hệ chủng vi sinh vật Trong tự nhiên, chủng vi sinh vật có khả bổ trợ cho nhau, sản phẩm trao đổi chất chủng chất cho chủng kia, chúng sinh trưởng tốt Tuy nhiên, chúng có kìm hãm, ức chế sinh trưởng phát triển lẫn Hiện tượng ức chế xảy trình sinh trưởng phát triển, chủng vi sinh vật thải môi trường sống sản phẩm trao đổi chất gây ức chế sinh trưởng phát triển chủng khả sinh trưởng phát triển chủng vi sinh vật chủng nên cạnh tranh dinh dưỡng môi trường sống nên bị ức chế Do đó, xác định mối quan hệ chủng vi khuẩn hữu ích trước đưa vào sản xuất chế phẩm việc làm cần thiết Trên sở đánh giá mối tương tác chủng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu quần thể vi sinh vật đất nói chung lồi vi sinh vật hữu ích nói riêng, xác định mối quan hệ chủng vi khuẩn lựa chọn, theo phương pháp cấy vạch tiếp xúc chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu Kết tổng hợp bảng Hình Sự kìm hãm sinh trưởng phát triển lẫn chủng vi sinh vật Bảng Mối quan hệ giữu chủng vi sinh vật lựa chọn CX6 CX6 H7 - C10 - H7 C10 - - - Ghi chú: (-) không ức chế nhau; (+) ức chế Qua kết bảng cho thấy chủng vi khuẩn dùng nghiên cứu có khả sinh trưởng phát triển mơi trường dinh dưỡng khơng thấy có tượng ức chế sinh trưởng phát triển lẫn Do đó, sử dụng hỗn hợp chủng vi khuẩn để sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh khoai tây B Khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn mơi trường dịch thể Để xác định xác khả sinh trưởng phát triển môi trường sống chủng vi khuẩn lựa chọn Đã tiến hành đánh giá khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn môi trường dịch thể Các chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi cấy riêng lẻ hỗn hợp môi trường dịch đặc hiệu Sau 48 đánh giá khả sinh trưởng phát triển chủng theo phương pháp nêu Kết tổng hợp bảng Bảng Khả sinh trưởng phát triển chủng môi trường dịch thể STT Ký hiệu chủng Mật độ tế bào chủng vi khuẩn hữu ích (x 107 CFU/ml) Riêng lẻ Hỗn hợp CX6 110 320 H7 80 120 C10 95 190 Kết bảng cho thấy, tất thí nghiệm cho kết tương tự Khi nuôi chủng số chủng vi khuẩn hữu hiệu dạng hỗn hợp cho kết tốt nuôi dạng riêng rẽ Điều chứng tỏ nuôi dạng hỗn hợp, chủng vi khuẩn lựa chọn có tác dụng bổ trợ lẫn tiết hệ enzym đầy đủ để sử dụng chất môi trường sử dụng sản phẩm trao đổi chất Sản phẩm trao đổi chất chủng nguồn kích thích sinh trưởng chủng khác C Khả sinh trưởng phát triển tổ hợp chủng vi sinh vật chất mang Để xác định xác khả sinh trưởng phát triển môi trường sống chủng vi khuẩn lựa chọn Đã tiến hành đánh giá khả tồn phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn chất mang than bùn khử trùng Ba chủng vi khuẩn cấy theo tỷ lệ 1% vào túi than bùn khử trùng Nuôi 30 0C, tiến hành kiểm tra mật độ tế bào chủng sau 15, 30 45 ngày Kết tổng hợp bảng Hình Khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn dạng riêng lẻ hỗn hợp Bảng Khả tồn chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi chất vô trùng theo thời gian Ngày Hình thức ni cấy Mật độ tế bào chủng vi khuẩn (× 105 CFU /g) CX6 H7 C10 Hỗn hợp 25 55 45 Riêng lẻ 15 55 40 15 30 45 Hỗn hợp 2950 2450 2650 Riêng lẻ 1250 1400 2000 Hỗn hợp 2100 2150 2300 Riêng rẽ 1000 1750 1420 Hỗn hợp 1220 1860 1650 Riêng rẽ 650 790 650 Qua số liệu bảng cho thấy mật độ tế bào chủng vi khuẩn nuôi hỗn hợp riêng lẻ điều kiện chất vô trùng tăng thời gian 15 ngày đầu Sau 30 ngày mật độ tế bào chủng vi khuẩn lựa chọn giảm dần Điều xảy chủng vi khuẩn ni túi chất không gian hẹp, chất dinh dưỡng không truyền theo mao dẫn để cung cấp thường xun ngồi mơi trường, nên cạn dần theo thời gian Qua bảng cho thấy, tốc độ giảm mật độ tế bào nuôi riêng lẻ nhanh so với nuôi hỗn hợp Điều lần chứng tỏ nuôi dạng hỗn hợp, chủng vi khuẩn lựa chọn có tác dụng bổ trợ lẫn tiết hệ enzym đầy đủ để sử dụng chất môi trường sử dụng sản phẩm trao đổi chất D Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi cấy dạng riêng lẻ hỗn hợp dịch thể chất mang Cùng với khả tồn điều kiện hỗn hợp họat tính sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn đóng vai trò quan trọng định chất lượng chế phẩm Các chủng vi khuẩn tuyển chọn tồn chất mang khơng có ý nghĩa hoạt tính sinh học chúng khơng yếu Vì vậy, việc trì nâng cao hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn chế phẩm việc làm cần thiết mang tính định Đã tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn song song với việc đánh giá mật độ tế bào q trình ni hỗn hợp riêng rẽ Hoạt tính chủng mơi trường dịch kiểm tra sau ngày nuôi cấy, chất khử trùng kiểm tra sau 15 ngày Các chủng phân lập lại xác định hoạt tính sinh học theo phương pháp nêu Kết tổng hợp bảng Hình Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn Bảng Hoạt tính sinh học chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi cấy dịch thể chất STT Ký hiệu Điều kiện chủng nuôi cấy CX6 H7 C10 Ức chế vi khuẩn gây bệnh Sinh tổng hợp AIA (mm) (µgAIA/ml) Riêng lẻ Hỗn hợp Riêng lẻ Hỗn hợp Dịch thể 24 26 24,55 25,15 Cơ chất 24 24 24,52 24,79 Dịch thể 26 27 - - Cơ chất 26 26 - - Dịch thể 24 25 30,61 31,11 Cơ chất 24 24 30,60 30,84 Qua số liệu bảng cho thấy, giống mật độ tế bào, chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi cấy dạng hỗn hợp cho hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh khả sinh tổng hợp AIA luôn cao nuôi cấy dạng riêng lẻ Điều chứng tỏ trình sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn lựa chọn có tương tác bổ trợ định với để làm tăng mật độ hoạt tính sinh học chúng Qua bảng thấy, chủng vi khuẩn lựa chọn nuôi cấy môi trường dinh dưỡng dạng dịch cho hoạt tính sinh học cao so với nuôi chất vô trùng Điều sau ngày nuôi cấy mơi trường dịch sinh trưởng phát triển chủng cuối pha log, đầu pha ổn định nên mật độ tế bào hoạt tính sinh học giai đoạn cao ổn định nên hoạt tính sinh học chúng cao nuôi cấy sau 15 ngày chất vô trùng, với nguồn dinh dưỡng ngày cạn dần Qua kết cho thấy, chủng vi khuẩn lựa chọn có khả sinh trưởng phát triển môi trường sống Khi sinh trưởng phát triển môi trường sống chúng có tác động bổ trợ lẫn nhau, giúp cho mật độ tế bào hoạt tính sinh học cao hẳn sống đơn lẻ Như vậy, sử dụng chủng vi khuẩn lựa chọn để sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh khoai tây 3.1.3 Đánh giá tác động tổ hợp chủng vi lựa chọn đến sinh trưởng, phát triển khả hạn chế bệnh héo xanh khoai tây quy mô nhà lưới Để sử dụng chủng vi khuẩn đối kháng tác nhân biện pháp phòng trừ sinh học chúng phải thể hoạt lực đối kháng cao điều kiện tự nhiên, theo số nghiên cứu cho thấy, số chủng vi khuẩn thể hoạt lực đối kháng với R solanacearum điều kiện phòng thí nghiệm, lại khơng thể thể yếu chủ ngồi tự nhiên Vì vậy, chủng vi khuẩn đối kháng cần thử nghiệm khoai tây điều kiện nhà lưới A Ảnh hưởng tổ hợp vi khuẩn lựa chọn tới khả sinh trưởng, phát triển khoai tây Đã tiến hành đánh giá tác động tổ hợp chủng vi khuẩn đối kháng tuyển chọn đến khả sinh trưởng phát triển khoai tây quy mô nhà lưới theo phương pháp nêu Kết thu giá trị trung bình sau lần lặp lại thể bảng Hình Ảnh hưởng tổ hợp vi khuẩn đối kháng tới khả sinh trưởng, phát triển hạn chế bệnh héo xanh khoai tây Bảng Ảnh hưởng tổ hợp vi sinh vật đối kháng tới khả sinh trưởng, phát triển khoai tây Công thức Chiều cao (cm) Số thân/khóm Diện tích tán (%) CT1 55,9 3,4 94,7 CT2 52,8 3,4 94,0 CT3 65,4 3,4 97,0 Kết theo dõi thu trình bày bảng cho thấy, cơng thức thí nghiệm đối chứng có thay đổi số sinh trưởng, phát triển khoai tây Tuy nhiên mức độ sai khác diện tích tán cơng thức thí nghiệm cơng thức đối chứng có thay đổi khơng đáng kể Sự thay đổ mà kết thu thay đổi chiều cao khoai tây Trong cơng thức chiều cao trung bình công thức thấp đạt 52,8 cm thấp so với công thức 3,1 cm, thấp công thức 12,6 cm Với điều kiện chăm sóc cơng thức có chiều cao thấp hẳn cơng thức khác cơng thức có chủng vi sinh vật gây bệnh héo xanh, số nguyên nhân mà chưa gây bệnh cho làm hạn chế sinh trưởng phát triển Còn cơng thức 3, có vi khuẩn gây bệnh chiều cao đạt cao bổ sung thêm tổ hợp chủng vi khuẩn đối kháng, khơng làm hạn chế phát triển vi khuẩn gây bệnh mà sinh chất kích thích sinh trưởng Như vậy, theo số liệu bảng cho thấy tổ hợp vi khuẩn đối kháng có ảnh hưởng định đến khả sinh trưởng, phát triển khoai tây Tuy nhiên, mức độ thông qua số tiêu định Để xác định rõ ảnh hưởng loại phân bón này, cần theo dõi tiêu khác B Ảnh hưởng tổ hợp vi khuẩn đối kháng tới khả hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn khoai tây Để đánh giá khả hạn chế phòng ngừa bệnh héo xanh vi khuẩn, tiến hành theo dõi tình hình héo xanh vi khuẩn khoai tây Kết thu giá trị trung bình sau lần lặp lại thể bảng Bảng Khả hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn khoai tây tổ hợp vi khuẩn đối kháng Số Số sống sót sau 30 ngày Lần Lần Lần 20 20 20 Tỷ lệ STT Cơng thức 1 thí nghiệm 60 2 60 10,0 3 60 18 18 19 91,6 sống (%) 100 3.1.4 Phân loại chủng vi khuẩn lựa chọn Phân loại vi khuẩn lựa chọn phương pháp giải trình tự gen phần tử 16S rARN theo Ludwig Schleifer (2000) Kết đọc trình tự xử lý phần mềm Clustal W 1.83 Trình tự gen lắp ráp so sánh chương trình NCBI BLAST với ADN GenBank Kết chọn kết có Max Ident (phần trăm trình tự dùng để so sánh với sở liệu) Querry coverage (phần trăm trình tự tương đồng với sở liệu) cao Kết thu sau: * Trình tự 16S rARN chủng vi khuẩn đối kháng CX6 GCGAGCGGCGGACGGGTGAGtAATGCCTAGGAATCTGCCTAGTAGTGGGGGATA ACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGA TCTTCGGACCTCACGCTATTAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGG TAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCAC ACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT GGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTC GGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTTACCTAATACGTGATTGT TTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGtAAAGCGCGCGTAGGT GGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAA AACTGGCAAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGAT ACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA GTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGCCTTGAGCTCTTAGTGGC GCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAA GCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCAATGAACTTTCTAGAGATAGA TTGGTGCCTTCGGGAACATTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCA GCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTAC AATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAAC CGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCG CCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGG AGGACGGTTACCACGGTGTGATTCAT Trình tự gen 16S rARN chủng CX6 tương đồng 99,9% (1448/1450 bp) với đoạn 16S vi khuẩn Pseudomonas fluorescens tương đồng 99,4% (1441/1450 bp) với đoạn 16S rARN vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Vị trí phân loại chủng vi khuẩn CX6 thể hình 7: 69 Pseudomonas ficuserectae_ AB021378 77 Pseudomonas syringae_AY574913 59 Pseudomonas congelans_AJ492828 54 Pseudomonas savastanoi_DQ318862 54 Pseudomonas tremae_AJ492826 89 Pseudomonas meliae_AB021382 77 Pseudomonas cannabina_AJ492827 63 Pseudomonas mandelii_AF058286 Pseudomonas aurantiaca_DQ682655 100 Pseudomonas veronii_AB056120 Pseudomonasaeruginosa_DQ683361 100 CX6 87 Pseudomonasfluorescens_AJ278812 Burkholderia cocovenenans_ AB021389 Hình Vị trí phân loại chủng vi khuẩn CX6 lồi có quan hệ họ hàng gần Giải thích quy trình Chủng giống vi sinh vật Chủng giống vi sinh vật bao gồm: Pseudomonas fluorescens CX6; Bacillus polyfermenticus H7; Bacillus subtilis C10 phân lập, tuyển chọn từ mẫu đất thu vùng chuyên canh rau màu Hà Nội Các chủng giống vi lưu giữ bảo dạng ống thạch nghiêng bảo quản điều kiện lạnh Giống vi sinh vật phải đảm bảo độ chủng, hoạt tính sinh học Trước sử dụng chủng vi sinh vật phải hoạt hóa, kiểm tra độ chủng hoạt tính sinh học Nhân giống cấp Lên men cấp trình nhân sinh khối chủng vi sinh vật qui mô nhỏ nhằm tạo số lượng định vi sinh vật khởi động lên men sinh khối lớn vi sinh vật Trong lên men cấp môi trường nhân sinh khối vi sinh vật pha chế theo thành phần cho, phân vào bình tam giác khử trùng 121 0C 20 phút Sau khử trùng môi trường để nguội đến 40 0C ÷ 450C cấy vi sinh vật từ ống giống gốc Thao tác thực điều kiện vô trùng Nuôi vi sinh vật điều kiện 30 0C máy lắc tốc độ 150 vòng/phút thời gian 48 Nhân giống cấp Môi trường nhân sinh khối vi sinh vật trình lên men cấp pha chế theo thứ tự hoá chất thành phần cho theo loại chủng giống vi sinh vật Sau phân phối vào nồi lên men chuẩn bị trước Khử trùng môi trường 121 0C 20 phút Làm nguội môi trường đến 40 0C ÷ 450C cấy chuyền sinh khối vi sinh vật từ bình tam giác chuẩn bị bước nhân sinh khối cấp với tỷ lệ 1/10 Điều chỉnh thông số kỹ thuật hệ thống lên men cho phù hợp với điều kiện sinh trưởng phát triển chủng cụ thể sau: Bảng 22 Thông số kỹ thuật lên men chủng vi khuẩn thiết bị lên men chìm quy mơ cơng nghiệp Thông số kỹ thật pH Nhiệt độ lên men (0C) Thời gian lên men (giờ) Tỷ lệ giống gốc (%) Mơi trường lên men Tốc độ cánh khuấy (vòng/giờ) Lưu lượng cấp khơng khí (m3 khơng khí/1m3 mơi trường) CX6 7,0 30 35 10 SX3 350 0,75 Chủng vi sinh vật H7 6,5-7,0 30± 36 10 SX3 350 0,75 C10 6,5-7,0 30± 36 10 SX3 350 0,75 Xử lý nâng cao mật độ vi sinh vật lựa chọn sinh khối vi sinh vật Dịch vi sinh vật sau lên men đưa vào máy ly tâm tiến hành tách nước tự Vận tốc ly tâm ban đầu 5000 vòng/phút sau tăng từ từ để đạt vận tốc 15.000 vòng/phút Mật độ sinh khối vi sinh vật sau ly tâm xác định thơng qua phương pháp đếm pha lỗng kính hiển vi Nhằm sử dụng triệt để sinh khối vi sinh vật, cần kiểm tra mật độ vi sinh vật lựa chọn phần nước tự bị tách Nếu mật độ vi sinh vật lựa chọn cao, tiến hành li tâm lần 2, vận tốc ly tâm nên để mức độ cao (18.000 – 20.000 vòng/phút) Yêu cầu mật độ sinh khối vi sinh vật tập hợp bảng 23 Bảng 23 Yêu cầu mật độ tế bào chủng vi khuẩn sau ly tâm Ký hiệu chủng CX6 H7 C10 Yêu cầu mật độ (CFU/ml) 5,0 x 1010 5,0 x 109 5,0 x 109 Chuẩn bị chất mang - Chất mang sử dụng qui trình sản xuất than non phơi khô nghiền mịn với kích thước hạt khơng lớn 0,1mm Để đảm bảo cho chất mang có đầu đủ dinh dưỡng cho vi sinh vật sinh trưởng phát triển, bổ sung thêm vào chất mang: 2% bột đậu tương, 3% rỉ đường, 0,2% N, 0,1% P2O5, 0,2% K2O Chất mang khử trùng phương pháp sau: + Hơi nóng khơ nhiệt độ từ 1700C đến 1800C, khơng giờ; + Hơi nước bão hồ áp suất 1at (1210C), khơng 1,5 - Chất mang phải bảo đảm điều kiện sau: + Hàm lượng cacbon hữu lớn 60% + Không chứa chất độc hại vi sinh vật, đất trồng + Hàm lượng muối khống hồ tan khơng vượt q 1% + Khơng chứa vi sinh vật tập, kể bào tử Phối trộn Hiệu lực chế phẩm phụ thuộc vào mật độ mức độ tương hỗ chủng vi khuẩn hỗn hợp Phối trộn sinh khối sau ly tâm với chất mang với tỷ lệ 1:10 Sản phẩm tạo cần đạt độ đồng quần thể vi sinh vật mặt vật lý Xử lý tạo chế phẩm vi sinh vật đậm đặc Hỗn hợp sau phối trộn ni ủ vòng ngày sau đưa vào hệ thống sấy nhiệt độ thấp (không vượt 400C) để tiếp tục loại bỏ nước tự Độ ẩm cuối sản phẩm cần đạt 15% Kiểm tra chất lượng Sản phẩm cuối qui trình sản xuất sản phẩm tạo công đoạn qui trình phải kiểm tra đánh giá chất lượng tiêu mật độ vi sinh vật lựa chọn mức độ tạp nhiễm Bảo quản sử dụng Sản phẩm sau sấy khơ bao gói chất liệu polyetylen với khối lượng 1, kg tuỳ thuộc vào yêu cầu người sử dụng Chế phẩm cần bảo quản nơi khơ, thống mát, cách xa nơi để hoá chất độc hại, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ nơi có nhiệt độ cao 3.2.4 Sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh * Sản xuất chế phẩm vi sinh vật * Đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh Trước đươc đưa vào sử dụng chế phẩm vi sinh vật kiểm tra, đánh giá Kết đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh vật tổng hợp bảng ? Kết bảng cho thấy, mật độ tế bào vi sinh vật hữu ích sản phẩm đạt 109 CFU/g Như vậy, sản phẩm đạt TCVN phân hữu vi sinh vật 3.3 Đánh giá chất lượng hiệu chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh đến sinh trưởng, phát triển, suất khoai tây khả hạn chế bệnh héo xanh Thí nghiệm tiến hành đồng ruộng với giống khoai tây KT3 gồm 02 công thức Kết theo dõi tập hợp bảng 18 Bảng 18 Ảnh hưởng chế phẩm vi sinh tới khả sinh trưởng phát triển khoai tây Công thức Tỷ lệ mọc Chiều cao (cm) Số thân/khóm Diện tích tán (%) CT1 74,7 52,8 3,4 94,0 CT2 75,3 65,4 3,4 97,0 Tuy nhiên mức độ sai khác tỷ lệ mọc diện tích tán cơng thức thí nghiệm cơng thức đối chứng có thay đổi khơng đáng kể Sự thay đổ mà kết thu thay đổi chiều cao khoai tây công thức đối chứng, chiều cao trung bình đạt 52,8cm thấp so với công thức 12,6 cm Như vậy, theo số liệu bảng 18 cho thấy công thức có xử lý chế phẩm VKĐK có ảnh hưởng đến khả sinh trưởng, phát triển khoai tây Tuy nhiên, mức độ thông qua số tiêu định Để xác định rõ ảnh hưởng loại chế phẩm này, cần theo dõi tiêu khác Kết đánh giá ảnh hưởng chế phẩm vi sinh đến suất khoai tây tổng hợp bảng 19 Bảng 19 Ảnh hưởng chế phẩm vi sinh tới suất khoai tây Công thức Năng suất (kg/5m2) Tỷ lệ tăng so với đối chứng (%) Công thức 12,2 Công thức 16,2 32,78 LSD 5% 1,3 Kết thí nghiệm bảng 19 cho thấy, suất khoai tây công thức đối chứng thu đạt thấp đạt 12,2kg/ơ thí nghiệm Các công thức sử dụng chế phẩm VKĐK cho suất cao so với công thức đối chứng, cụ thể sau: công thức suất cao so với đối chứng 4,0 kg/ô đạt tỷ lệ tăng suất 32,78% Ngoài ý nghĩa sản phẩm cung cấp dinh dưỡng cho trồng, chức chủ yếu chế phẩm hạn chế phòng ngừa bệnh héo xanh vi khuẩn Để đánh giá khả hạn chế phòng ngừa bệnh héo xanh vi khuẩn, đề tiến hành theo dõi tình hình héo xanh vi khuẩn khoai tây Trên thí nghiệm trồng 50 khóm khoai tây, điều tra tỷ lệ số khóm khoai tây bị bệnh héo xanh vi khuẩn gây thí nghiệm Kết điều tra theo dõi thu trình bày bảng 20 Bảng 20 Khả hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn khoai tây chế phẩm vi sinh Công thức Số khóm bị bệnh Tỷ lệ bệnh (%) Cơng thức 11,7 23,4 Công thức 2,7 5,4 LSD 5% 1,02 2,11 Kết thu cho thấy, cơng thức số khóm bị bệnh héo xanh 11,7 khóm/50 khóm điều tra, chiếm tỷ lệ bị bệnh héo xanh vi khuẩn 23,4% Ở công thức số khóm bị bệnh héo xanh 2,7 khóm/50 khóm điều tra, chiếm tỷ lệ bị bệnh héo xanh 9,4 So sánh tỷ lệ bị bệnh héo xanh cơng thức thí nghiệm cho thấy, cơng thức đối chứng không sử dụng chế phẩm, tỷ lệ bị bệnh cao nhất, cơng thức có sử dụng chế phẩm, tỷ lệ bị bệnh thấp nhiều, cụ thể công thức tỷ lệ bị bệnh thấp so với công thức đối chứng 18%, So sánh kết nảy biểu đồ cho thấy tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn công thức đối chứng 100% sử dụng chế phẩm vi sinh, khả bị bệnh héo xanh khoảng 23,1% (giảm 79,6 % so với đối chứng) * Xây dựng mơ hình trình diễn ứng dụng chế phẩm vi sinh sản xuất khoai tây Để kết có độ xác tin cậy cao, tiến hành xây dựng mơ hình ứng dụng chế phẩm vi sinh cho khoai tây Tỷ lệ phân bón, chăm sóc áp dụng theo tiêu chuẩn ngành nông nghiệp Địa điểm tiến hành thí nghiệm: xã Hà Hồi – Thường Tín - Hà Nội Chế phẩm nghiên cứu bổ sung 02 lần Lần 1: Bổ sung bắt đầu trồng luống (khoai tây) Lần 2: Bổ sung khoai tây bắt đầu xuất chùm hoa Thời gian tiến hành thí nghiệm: Từ tháng 11/2010 đến tháng 02/2011 Diện tích mơ hình thí nghiệm: 0,5 Trong q trình thực mơ hình, tiến hành theo dõi tỷ lệ chết, suất thu hoạch m2 công thức cho lần lặp Hình 21 Mơ hình trình diễn ứng dụng chế phẩm vi sinh sản xuất khoai tây Bảng 22 Khả phòng chống bệnh héo xanh chế phẩm vi sinh ruộng Công thức Tỷ lệ bệnh sau 65 ngày theo dõi Tỷ lệ bệnh giảm so với đối chứng (%) (%) Công thức 16,80 - Công thức 6,67 39,7 LSD 5% 5,20 Kết bảng 33 cho thấy: chế phẩm có khả kiểm sốt tốt bệnh héo xanh khoai tây Chế phẩm CP tỷ lệ chết giảm tới 15,0 % (với cà chua) 10,03 % (với khoai tây) so với công thức đối chứng điều kiện Không vậy, tất cơng thức có sử dụng chế phẩm cho suất thu hoạch cao công thức không sử dụng chế phẩm so với công thức đối chứng điều kiện nguồn bệnh bình thường kết thể bảng 23 Bảng 23 Ảnh hưởng chế phẩm vi sinh đến suất khoai tây Cơng thức Cơng thức Năng suất trung bình (kg/5m2) 11,31 Năng suất so với đối chứng ( %) - Công thức 15,21 LSD 5% 1,27 38,48 Điều dễ dàng lý giải rằng: cơng thức có sử dụng chế phẩm làm tăng cường, trì tỷ lệ sống sót khoai tây, thông qua diện quần thể vi khuẩn đối kháng có đất qua giai đoạn phát triển trồng IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ V TÀI LIỆU THAM KHẢO A Phần tiếng Việt Cục Bảo vệ thực vật (1987), Phương pháp điều tra phát sâu bệnh hại trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 138 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Phạm Minh Hương, Ngơ Đình Bính Nguyễn Văn Tuất (2003) Một số kết nghiên cứu sản xuất ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học BT điều kiện Việt Nam Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, tr 178 – 183 Nguyễn Hoàng Chiến, Vương Trọng Hào (2001) Nghiên cứu khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chống vi khuẩn gây héo xanh cà chua chủng xạ khuẩn Streptomyces albogriseolus V6 Tạp chí sinh học, tập 23-3b, tr 96 – 101 Đỗ Tấn Dũng (2002) Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum Smith) hại số trồng ngoại thành Hà Nội vùng phụ cận Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I – Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu Vi sinh vật học NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1975), Vi sinh vật học tập 1, NXB Đại học THCN, Hà nội Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Liễu (1993) “Một số kết nghiên cứu bệnh hại cà chua xác định gen chống chịu bệnh héo miền Bắc Việt Nam” Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học Bảo vệ thực vật 24-25 tháng 3-1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 16-17 Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Văn Liễu, Nguyễn Thị Yến, Phạm Huy Chương (1995) Nghiên cứu chọn tạo giống cà chua kháng bệnh héo xanh vi khuẩn Kết nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991-1995, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 133-137 Nguyễn Xuân Hồng, Nguyễn Thị Yến, Nguyễn Văn Liễu (1997) Kết nghiên cứu đặc điểm phân bố, tác hại bệnh héo xanh cà chua xác định biovar vi khuẩn (Pseudomonas solanacearum Smith) miền Bắc Việt Nam Tạp chí Bảo vệ thực vật, 6, tr 27-31 10 Lê Như Kiểu, Phạm Công Minh, Trần Quang Minh Nguyễn Ngọc Cường, 2005 Quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn đối kháng vk58 phòng chống bệnh héo xanh cà chua Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 43, số 5, tr 47-54 11 Lê Như Kiểu, Lê Thị Thanh Thủy, Trần Quang Minh, Nguyễn Thị Kim Thoa, Trần Thị Lụa, Nguyễn Văn Huân, 2009 Ảnh hưởng chế phẩm vi sinh đối kháng tới bệnh héo xanh suất lạc, vừng nhà lưới đồng ruộng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam, số 02(11).2009 tr 54-60 12 Phạm Chí Thành (1988) Giáo trình Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng, tr 31-134 13 Phạm Văn Toản (2003) Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, tr 127-131 14 Phạm Văn Ty, Đào Thị Lương (2003) Khả sinh kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh Streptomyces arabicus 112 Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, tr 145-149 15 Phạm Thị Thùy, Nguyễn Văn Tuất (2003) Phân lập tuyển chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae có độc tính cao bọ hại dừa tỉnh phía Nam Proceedings Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc, tr 123 – 131 B PHẦN TIẾNG ANH Ito, S;Y Ushuima, T.Fujii, S Tanaka, M Kameya-Iwaki, S Yoshiwara and F.Kishi (1998) Detection of Viable Cells of Ralstonia solanacearum in Soil Using a Semiselective Medium and a PCR Technique J Phytopathology Volume 146, Issue 8-9, pp 379–384 Kelman A (1954), The relationship of pathogenicity in P solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium, Phytopathology 44, pp 693-695 Opina, N et al: A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum) As Pac J Mol Biol Biotechnol 5: 19-33 Chae Gun Phae., Makoto Shoda., Nobuhiro Kita (1992): Control of crown and root rot and bacterial wilt of tomato by Bacillus subtilis NB22”, Phytopath Soc Japan 58, pp 329 – 339 Chen W and Echandi E (1984): Effects of avirulent bacteriocin-producing strains of Pseudomonas solanacearum on the control of bacterial wilt of tobacco, Plant Pathology 33, pp 245 – 253 Cook D., Sequeira L (1991): Gentic and biochemical characterization of a Pseudomonas cluster required for the extracellular polysaccharide production and virulence, Journal of Bacteriology 173, pp 1654 – 1662 10 Cuppels A., Hanson R., Kelman A.(1978): Isolation and characterization of a bacteriocin produced by Pseudomonas solanacearum, Journal of Genral Microbiology 109, pp 295 – 303 11 Geels and Schippers (1983): Selection of Antagonistic Fluorescent Pseudomonas sp and their Root Colonization and Persistance following Treatment of Seed Potato, Phytopath Z, 108, pp 193 – 206 12 Hayward A C (1960): Characteristics of Pseudomonas solanacearum Journal of Applied Bacteriology 27, pp 265 – 277 13 He L.Y., SequeiraL., and Kelman A (1983): Characteristics of strains of Pseudomonas solanacearum from China, Plant Disease 67, pp 1357 - 1362 14 Kelman A (1954): The relationship of pathogenicity in P.solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium Phytopathology 44, pp 693 – 695 15 Kelman A., Hartman C.L, and Hayward A.C (1994): Introduction in Bacterial wilt Hayward A.C and Hartman G.L (Eds), CAB, pp – 16 Kelman A., Sequeira L (1965): Root-to-root spread of Pseudomonas solanacearum Phytopathol 55, pp 304 – 309 17 Kemp J., and Sequeira L (1983): Biological control of bacterial wilt of potatoes: Attempts to induce resistance by treating tubers with bacteria Plant Dis 647, pp 499 – 503 18 Latour X., T Corberand, G Laguerre, F Allard and P Lemanceau (1996): The composition of fluorescent pseudomonad populations associated with roots is influenced by plant and soil type Appl Environ Microbial 62, pp 2449 – 2456 19 Li W R., Chen C R., Xu Z.Y (1981): Studies on Bacterial wilt of peanut II Investigation of disease epidemiology in East Hubei Oil crops of China 1, pp 43 – 47 20 Mc Laughlin R J and Sequeira L (1988): Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato, American Potato Journal 65, pp 255 – 268 21 Mehan V K., Liao B S., and Tan Y J., Robinson A., Smith., Donald D Mc., Hayward A C (1994): Bacterial wilt groundnut, ICRISAT information bulletin 35, pp 23 ICRISAT, Hyderabad, India 22 Tan Y J., Duan N X., Liao B S and Zeng D F (1994): ACIAR bacterial wilt, Newsletter 10, pp 23 Trigalet A and Trigalet - Demery D., (1990): Use of avirulent mutants of Pseudomonas solanacearum for the biological control of bacterial wilt of tomato plants, Physiological and Molecular Plant Pathology 36, pp 27 – 38 24 Trigalet A., Frey P., and Trigalet – Demery D (1994): Biological control of Bacterial Wilt caused by Pseudomonas solanacearum: State of the Art and understanding Bacterial wilt: The disease and its causative agent, Pseudomonas solanacearum, Journal of Genral Plant Pathology 36, pp 225 – 233 25 Wang., J.S.Hou and Hu B.J (1983): Studies on the control of bacterial wilt of peanut Acta phytophylactica 10, pp 79 – 84 26 Winstead N.N and Kelman A (1952): Inoculation techniques for evaluating resistance to Pseudomonas solanacearum” Phytopathology 42, pp 628 – 634 16 AVRDC Internal Review and Planning Workshop (2000), 5-7 December, 2000 at Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan 741, Taiwan 17 Amalia Gheorghe, 2003 Biological Control Of Phytopathogen Microorganisms With Antagonist Bacteria, National Research and Development Institute for Chemistry and Petrochemistry-ICECHIM, Spl Independentei 202, Bucharest, Romania 18 B Li, L.H Xu, M.M Lou, F Li, Y.D Zhang and G.L Xie, 2008 Isolation and characterization of antagonistic bacteria against bacterial leaf spot of Euphorbia pulcherrima, Proceeding of Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou, China pp.21-28 19 Challis, G L (2005) "A widely distributed bacterial pathway for siderophore biosynthesis independent of nonribosomal peptide synthetases" ChemBioChem 6: 601– 611 doi:10.1002/cbic.200400283 20 Cornelis, P; Andrews, SC (editor) (2010) Iron Uptake and Homeostasis in Microorganisms Caister Academic Press ISBN 978-1-904455-65-3 21 Franziska Faltin, Jana Lottmann, Rita Grosch, and Gabriele Berg, 2004 Strategy to select and assess antagonistic bacteria for biological control of Rhizoctonia solani Kühn Can J Microbiol 50(10): 811–820 22 Geels and Schippers (1983), Selection of Antagonistic Fluorescent Pseudomonas sp and their Root Colonization and Persistance following Treatment of Seed Potato, Phytopath Z, 108, pp 193-206 23 J Kadir, M.A Rahman, M.M Begum, R Abdul Rahman and T.M.M Mahmud, 2007 Screening of Antagonistic Bacteria for Biocontrol Activities on Colletotrichum gloeosporioides in Papaya Volume: Issue: Page No.: 12-20 24 Jaime R Montealegre, 2003 Selection of bioantagonistic bacteria to be used in biological control of Rhizoctonia solani in tomato, Sci Technol., 18 (Suppl 1): 39-48 25 Julian A Ferreras, Jae-Sang Ryu, Federico Di Lello, Derek S Tanand Luis E N Quadri (2005) "Small-molecule inhibition of siderophore biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis and Yersinia pestis" Nature Chemical Biology 1: 29–32 doi:10.1038/nchembio706 26 Kelman A (1954), The relationship of pathogenicity in P solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium, Phytopathology 44, pp 693-695 27 Mostafa Niknejad Kazempour, 2009 Isolation of Fusarium fujikuroi antagonistic bacteria and cloning of its phenazine carboxylic acid genes African Journal of Biotechnology Vol (23), pp 6506-6510 28 Nobutaka Someya, 2008 Biological control of fungal plant diseases using antagonistic bacteria, ournal of General Plant Pathology, Volume 74, Number 459-460 29 Opina, N et al: A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying B.solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum) As Pac J Mol Biol Biotechnol 5: 19-33 29 Punja, Z.K 1985 The biology, ecology, and control of Sclerotium rolfsii Ann Rev Phytopathol 23:97-127 30 Suparman, Maman, 2004 Antagonistic Bacteria For Controlling Fusarium Wilt Of Tomato Caused By Fusarium Oxysporum F Sp Lycopersici Masters thesis, Universiti Putra Malaysia 31 Tilcher, R.; Schmidt, C.; Lorenz, D and Wolf, G A 2002 About the use of antagonistic bacteria and fungi Biological control of Fusarium graminearum on wheat by antagonistic bacteria Songklanakarin J Sci Technol., 2006, 28 (Suppl 1): 29-38 ... 3.2.4 Sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh * Sản xuất chế phẩm vi sinh vật * Đánh giá chất lượng chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh Trước đươc đưa vào sử dụng chế phẩm vi sinh. .. chủng vi sinh vật; kết cho thấy, chủng vi sinh vật lựa chọn nằm nhóm an toàn cấp độ 3.2 Nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh 3.2.1 Nghiên cứu sản xuất sinh khối chủng vi. .. Kiểmhéo traxanh chấtkhoai lượng xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh tây với sơ đồ sau: QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO XANH TÂY Sấy khơ đếnKHOAI độ ẩm 15% Đóng gói Bảo quản