Nghiên cứu chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở nghệ an

Luận văn, thạc sỹ, tiến sĩ, cao học, kinh tế, nông nghiệp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

HOÀNG CÔNG SÁNG

Tên ñề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM VI SINH VẬT

PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN HẠI

LỜI CẢM ƠN

để hoàn thành bản luận văn này, ngoài nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận ựược rất nhiều sự quan tâm giúp ựỡ của thầy cô, ựồng nghiệp, bạn bè và người thân

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Như Kiểu - Viện phó Viện Thổ nhưỡng Nông Hoá, ựã tận tình hướng dẫn tôi về khoa học cũng như suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban đào tạo Sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ khoa học Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông Hoá ựã tạo mọi ựiều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện các nghiên cứu ựể hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ựến các cán bộ công nhân viên Trung tâm Nghiên cứu Phân bón và Dinh dưỡng cây trồng ựã tạo mọi ựiều kiện cho tôi trong quá trình công tác và thực hiện luận văn này

Tôi chân thành cảm ơn các hộ nông dân tại xã Nghi Long, huyện Nghi Lộc và xã Thọ Hợp, huyện Quỳ Hợp, tỉnh Nghệ An ựã tạo ựiều kiện, giúp ựỡ tôi thực hiện các thắ nghiệm ựồng ruộng tại ựây

Hà Nội, ngày 20 tháng 4 năm 2010

Tác giả luận văn

Hoàng Công Sáng

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, kết quả của luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất cứ công trình nào khác

Các kết quả nghiên cứu là nỗ lực của chính tác giả, các trích dẫn của các tác giả khác và ñồng nghiệp ñều ñược chú thích rõ ràng

Tác giả luận văn

Hoàng Công Sáng

MỤC LỤC

Trang

TRANG PHỤ BÌA i

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM đOAN iii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ SƠ đỒ ix

MỞ đẦU 1

1 Tắnh cấp thiết của ựề tài 10

2 Mục tiêu của ựề tài 12

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài 12

4 đối tượng và phạm vi nghiên cứu của ựề tài 13

CHƯƠNG I Ờ TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 14

CỦA đỀ TÀI 14

1.1 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu 14

1.2 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan ựến ựề tài 15

1.2.1 Kết quả nghiên cứu trên thế giới 15

1.2.2 Kết quả nghiên cứu trong nước 19

CHƯƠNG II Ờ VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu nghiên cứu 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 24

Theo TCVN 5297 - 1995; 5960-95; 10TCN 367-99 25

2.3.3 Phương pháp phân lập Ralstonia solanacearum 25

2.3.4 Phương pháp xác ựịnh ựộc tắnh của các chủng R.solanacearum 26

2.3.5 Phương pháp xác ựịnh ựộ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật ựối kháng 27

2.3.6 Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi sinh vật ựối kháng ựối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum 28

2.3.7 đánh giá hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi khuẩn ựối kháng với R.solanacearum trong ựiều kiện nhà lưới 28

2.3.8 Phương pháp bố trắ thắ nghiệm ựồng ruộng diện hẹp 29

2.3.9 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng30 2.3.10 Xử lý số liệu 31

CHƯƠNG III Ờ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng R solanasearum từ các mẫu bệnh thu thập ựược và xác ựịnh ựộc tắnh của chúng 32

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R solanacearum 32

3.1.2 đánh giá ựộc tắnh của những chủng R solanacearum phân lập ựược 35

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng với R solanacearum và xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng 36

3.2.1 Tuyển chọn vi khuẩn ựối kháng từ nguồn có sẵn 36

3.2.2 Nghiên cứu các ựặc ựiểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn ựối kháng 31

3.2.3 đánh giá ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn ựối kháng trên cây trồng 32

3.2.4 đánh giá ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn ựối kháng trên chuột bạch .36

3.3 Nghiên cứu quy trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phòng chống bệnh héo xanh cây lạc .40

3.3.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật ựối kháng bệnh héo xanh cây lạc 40

3.3.2 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật ựối kháng bệnh héo xanh lạc 5 0 3.3.3 đánh giá chế phẩm vi sinh vật ựối kháng bệnh héo xanh cây lạc trong nhà lưới, phạm vi hẹp ngoài cánh ựồng và mô hình trình diễn 5 1 3.3.4 đánh giá mức ựộ sống sót của các chủng vi sinh vật trong chế phẩm .6 0 3.3.5 đánh giá hiệu quả kinh tế của chế phẩm ngoài ựồng ruộng 6 2 3.3.6 Quy trình sử dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc 6 4 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.2 Kiến nghị 66

PHỤ LỤC 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

Tiếng Việt 87

Tiếng Anh 89

9 ðKVK & N ðối kháng vi khuẩn và nấm

10 IAA Idol Acetic Acid

11 VƯC Vòng ức chế vi khuẩn/nấm gây bệnh

12 KTSTTV Kích thích sinh trưởng thực vật

14 VPGKT Vòng phân giải kitin

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1: ñặc ñiểm sinh học ñiển hình của một số chủng R 24

solanacearum thu thập ựược

5 Bảng 3.5: đặc ựiểm sinh học của các chủng vi khuẩn ựối kháng 32

6 Bảng 3.6: đánh giá ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn ựối kháng

với cây lạc quy mô nhà lưới

9 Bảng 3.9: đánh giá khả năng gây ựộc bán trường diễn của các chủng

vi khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch sau 30 ngày

53

18 Bảng 3.18: Khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn của chế phẩm CP1 trên cây lạc - giống MD7 ở ựiều kiện nhà lưới (Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, vụ hè thu năm 2008)

54

19 Bảng 3.19: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ựến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống MD7 ở ựiều kiện nhà lưới (Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, vụ hè thu năm 2008)

55

20 Bảng 3.20: Hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn của chế 57

phẩm CP1 trên cây lạc - giống L14 tại xã Nghi Long, Nghi Lộc, Nghệ An- vụ xuân năm 2009

21 Bảng 3.21: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống L14 tại xã Nghi Long, Nghi Lộc, Nghệ An- vụ xuân năm 2009

58

22 Bảng 3.22: Khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn của chế phẩm CP1 trên lạc - giống L14 tại xã Thọ Hợp, Quỳ Hợp, Nghệ An- vụ hè thu năm 2009

59

23 Bảng 3.23: Ảnh hưởng của chế phẩm CP1 ñến sinh trưởng, phát triển và năng suất lạc - giống L14 tại xã Thọ Hợp, Quỳ Hợp, NghệAn- vụ hè thu năm 2009

62

27 Bảng 3.27: Hiệu quả kinh tế của mô hình bón chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc tại xã Nghi Long – Nghi Lộc- Nghệ An - vụ xuân 2009

63

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, BIỂU ðỒ VÀ SƠ ðỒ

1 Ảnh 3.1: Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn gây

4 Ảnh 3.4 Hoạt lực ựối kháng của các chủng vi khuẩn kháng R

solanacearum

31

5 Ảnh 3.5: đánh giá hoạt lực ựối kháng vi khuẩn R

solanacearum gây bệnh héo xanh lạc

34

6 Ảnh 3.6 Nuôi cấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cùng môi

trường dinh dưỡng

35

7 Ảnh 3.7: đánh giá tắnh ựộc của hỗn hợp các chủng vi khuẩn ựối

kháng trong chế phẩm CP1 trên cây lạc

35

8 Ảnh 3.8 Ảnh hưởng của hỗn hợp các chủng vi khuẩn ựối kháng

trong chế phẩm CP1 với bệnh héo xanh lạc - giống MD7

36

9 Ảnh 3.9 Lô chuột thắ nghiệm sau 30 ngày xử lý 39

10 Ảnh 3.10 Hình ảnh mẫu gan chuột ở công thức thắ nghiệm 39

11 SƠ đỒ 3.1: QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV đỐI

KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY LẠC

47

12 Ảnh 3.11 Chế phẩm vi sinh ựối kháng bệnh héo lạc 51

13 Ảnh 3.12 Ảnh hưởng của chế phẩm VSV ựối kháng với bệnh

héo xanh lạc- giống L02 53

14 Ảnh 3.13: đánh giá chế phẩm vi sinh ựối kháng diện hẹp ngoài

ựồng ựối với cây lạc 56

15 Ảnh 3.14: Mô hình ựánh giá chế phẩm vi sinh ựối kháng bệnh

héo xanh lạc vụ hè thu năm 2009 tại tại HTX Thọ Sơn - Thọ

Hợp, Quỳ Hợp - Nghệ An -Vụ hè thu 2009

59

MỞ ðẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị dinh

dưỡng cao và ý nghĩa kinh tế lớn Hiện nay lạc ñược trồng phổ biến ở hơn

100 quốc gia trên thế giới với tổng diện tích 24,671 triệu ha, năng suất bình quân ñạt 14 tạ/ha, cho tổng sản lượng là 34 triệu tấn/năm Ở nhiều nước trên thế giới lạc là mặt hàng ñem lại kim ngạch xuất khẩu cao (ở Xênêgan giá trị

từ lạc chiếm ½ tổng thu nhập, 80% giá trị xuất khẩu và con số này ở Nigiêria

là 60% Ở nước ta lạc là sản phẩm quan trọng ñể xuất khẩu và sản xuất dầu ăn (hiện nay nước ta còn phải nhập khẩu) [1], [11]

Năng suất lạc của nước ta so với một số nước trên thế giới còn thấp, năng suất lạc ở Mỹ là 2,99 tấn/ha, Trung Quốc là 2,94 tấn/ha trong khi ñó ở

Việt Nam là 1,44 tấn/ha năm 1999 [Nguồn: Production Estimates and Crop

Assessment Division, FAS, USDA] Một trong những nguyên nhân dẫn ñến năng suất lạc của nước ta thấp là do các loại sâu bệnh phá hại Các loại ñối tượng sâu bệnh hại luôn là cản trở lớn cho hoạt ñộng sản xuất nông nghiệp, chúng không chỉ làm giảm năng suất mà còn ảnh hưởng xấu ñến chất lượng nông sản, làm tăng chi phí sản xuất do các hoạt ñộng phòng trừ chúng Trong

ñó bệnh héo xanh vi khuẩn là một trong những bệnh hại nghiêm trọng làm giảm năng suất lạc Cùng với hàng loạt các tiến bộ khoa học kỹ thuật ñược áp dụng trong sản xuất, ñặc biệt là các cuộc cách mạng về giống và phân bón, sản xuất nông nghiệp nước ta trong những năm gần ñây ñã phát triển vượt bậc, vươn lên trở thành một trong những nước xuất khẩu hàng ñầu thế giới về lúa gạo, cà phê, ñiều v.v…

Tuy vậy, vấn ựề ựặt ra cho sản xuất nông nghiệp của nước ta là ựi ựôi với việc tăng năng suất, vấn ựề chất lượng sản phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm ựang trở nên cấp bách ựược cả xã hội quan tâm Việc áp dụng biện pháp hóa học trong bảo vệ thực vật ựã gây ra hàng loạt vấn ựề về sức khỏe, về môi trường sinh thái, về ựa dạng quần thể sinh vật và cân bằng sinh học tự nhiên [19], [20]

Bệnh héo xanh vi khuẩn (Bacterial wilt disease) hại lạc và nhiều loại

cây trồng khác rất phổ biến ở châu Mỹ, châu Phi, châu Úc Bệnh gây hại nghiêm trọng và là một trở ngại lớn cho sản xuất lạc ở nước ta, Trung Quốc, Inựônêxia, Malayxia, UganựaẦỞ nước ta và các nước đông Nam Á, thiệt hại

về năng suất do bệnh gây ra trong khoảng 5 - 80%, trung bình hàng năm từ 10

- 40% [23]

Việc sử dụng các biện pháp phòng trừ bệnh này bằng thuốc hóa học chưa ựem lại hiệu quả mong muốn Hơn nữa nó còn ảnh hưởng nghiêm trọng ựến các quần thể sinh vật sống trong ựất, ựể lại một lượng tồn dư trong ựất, nước và các sản phẩm nông sản, ảnh hưởng xấu ựến môi trường sinh thái và sức khỏe con người Theo Trần Thị Lệ Hà và Nguyễn Hữu Thành những loại thuốc có chứa hoạt chất Dimethoat, Fenvalerate, Cypermethrin có thời gian tồn tại trong ựất và trong sản phẩm từ 7 - 10 ngày [6]

Các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước những năm qua ựã chỉ

ra rằng một số vi sinh vật có hoạt tắnh ựối kháng ựối với một số vi khuẩn gây bệnh, kết quả này ựã mở ra khả năng ứng dụng tắnh ựối kháng trong phòng một số bệnh cho cây trồng [7], [9], [10], [18], [26] Do vậy việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc sinh học, trong ựó các loại chế phẩm ựược sản xuất từ các vi sinh vật ựối kháng có nhiều ưu ựiểm như thời gian cách ly ngắn,

an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường ñang ngày càng ñược quan tâm nghiên cứu và phát triển [16]

Trong thời gian qua, các nhà khoa học ñã ñi sâu nghiên cứu ñặc tính ñối kháng của các chủng vi sinh vật trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cà chua, ớt, khoai tây v…v…và ñạt nhiều kết quả khả quan Từ khả năng có thể ứng dụng ñặc tính ñối kháng của các vi sinh vật trong phòng trừ bệnh héo

xanh vi khuẩn nên chúng tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu và sử dụng chế

phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ở Nghệ An”

2 Mục tiêu của ñề tài

Sản xuất ñược chế phẩm vi sinh vật ñối kháng bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây lạc Các chủng vi sinh vật ñuợc ứng dụng ñể sản xuất chế phẩm phải

có ñộ an toàn sinh học cao

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài

- Ý nghĩa khoa học:

Tuyển chọn ñược những chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum có

ñộc tính cao ở những ñịa ñiểm tiến hành thu mẫu và nghiên cứu ðây là các chủng vi khuẩn có ý nghĩa khoa học cho việc nghiên cứu tiếp theo

Tuyển chọn ñược các chủng vi sinh vật có hoạt tính ñối kháng mạnh với bệnh héo xanh trên cây lạc ñể làm vật liệu khởi ñầu nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ một số bệnh phổ biến trong sản xuất lạc nói riêng và sản xuất nông nghiệp nói chung

- Ý nghĩa thực tiễn:

Phòng trừ bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc có hiệu quả, góp phần giảm thiểu sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học trong phòng trừ bệnh héo xanh trên cây lạc, nâng cao năng suất và chất lượng lạc, góp phần làm trong sạch môi trường ở vùng nghiên cứu

4 ðối tượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài

ðối tượng nghiên cứu: bệnh héo xanh vi khuẩn trên các giống lạc ñang trồng phổ biến tại Nghệ An

Thu thập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật ñối kháng từ nguồn gen

vi sinh vật có sẵn tại Phòng vi sinh Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, từ các mẫu ñất, cây họ cà và vùng rễ cây trồng tại nơi nghiên cứu

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC

CỦA ðỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu

Trong tự nhiên các sinh vật chịu tác ñộng ñồng thời của nhiều yếu tố,

về cơ bản là yếu tố vô sinh và yếu tố hữu sinh trong quá trình sinh sống của mình Yếu tố hữu sinh gồm các cơ thể sống như thực vật, ñộng vật, vi sinh vật

và tất cả các mối quan hệ giữa các sinh vật với nhau Các sinh vật ñều trực tiếp hay gián tiếp ảnh hưởng ñến nhau Các loài sinh vật luôn luôn tồn tại trong các dạng quan hệ, về cơ bản ñều thuộc năm dạng quan hệ: cạnh tranh, cộng sinh, ký sinh, kìm hãm và vật ăn thịt - con mồi [20]

Quan hệ hãm sinh là kiểu quan hệ mà một sinh vật kìm hãm sự phát triển của một sinh vật khác bằng cách tiết vào môi trường các chất ñộc cho loài khác Chẳng hạn, một số loài nấm có khả năng tiết ra chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Khá nhiều loài thực vật cũng có khả năng này, rễ của chúng tiết ra chất gọi là Phytoxit có tác dụng kìm hãm sự phát triển của các loài thực vật khác, ñặc tính này cũng ñã ñược ứng dụng trong thực tế, như việc sử dụng các chất tiết của nấm ñể làm thuốc kháng sinh Penicilin; chế phẩm Bt trong phòng trừ sâu bệnh hại cây nông nghiệp…

ðất trồng không chỉ thuần túy là tập hợp của các nguyên tố hóa học, mà

ẩn chứa bên trong nó là một thế giới sống vô cùng phong phú và phức tạp ðất là nơi trú ngụ và sinh sống của hàng triệu loài vi sinh vật khác nhau và ở

ñó luôn luôn xẩy ra các phản ứng lý, hóa và sinh học Thông qua các phản ứng ñó và các hoạt ñộng sống của vi sinh vật ñất trồng mới có ñiều kiện ñể phục hồi và cân bằng thông qua các qui luật của tự nhiên ðất trồng cũng là

nơi tồn tại của nhiều loại vi sinh vật gây bệnh hại cây trồng ðể phát triển nền nông nghiệp bền vững các nhà khoa học trên thế giới và trong nước ñã và ñang rất quan tâm ñến các giải pháp tổng hợp vừa có tác dụng cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, vừa có tác dụng cải tạo, bồi bổ ñất cũng như giảm thiểu

sự gây hại của các ñối tượng sâu bệnh hại

Một số nghiên cứu của các tác giả ñã chỉ ra nhiều vi sinh vật có khả năng ña hoạt tính sinh học, trong ñó có những vi sinh vật vừa có khả năng tạo nguồn dinh dưỡng cho cây, sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật ñồng thời cũng có khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh vùng rễ cây trồng [21], [31], [33], [34], [35], [36], [37] Một số nghiên cứu khác cũng ñã chứng minh chế phẩm vi sinh vật làm phân bón nhưng lại có tác dụng hạn chế bệnh do vi khuẩn hoặc nấm gây nên [26], [29], [30], [38], [39]

Các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước ñã mở ra một hướng mới trong công tác phòng trừ bệnh hại, ñó là sử dụng các dạng chế phẩm ñược sản xuất từ các vi sinh vật có hoạt tính ñối kháng

1.2 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan ñến ñề tài

1.2.1 Kết quả nghiên cứu trên thế giới

Từ lâu, các nhà khoa học trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về các loại chế phẩm mang bản chất sinh học ñể phòng trừ nhiều loại sâu bệnh hại cây trồng và ñã ñạt ñược nhiều thành tựu quan trọng, góp phần không nhỏ trong việc nâng cao năng suất cây trồng, giảm tác hại của thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc hóa học

Các loại chế phẩm ñược sản xuất từ các loại vi sinh vật khác nhau cũng

ñã ñược sản xuất Ở Mỹ, ñã ứng dụng nấm bạch cương Beauveria globulifera

ñể trừ bọ xít hại lúa mì, nấm ñược sản xuất với khối lượng lớn, phát cho các trang trại (Coppel et al…, 1977; Weiser, 1966) [28] Ngoài ra tiềm năng ñối

kháng của các vi sinh vật với nhau cũng ñược các nhà khoa học sử dụng trong

công tác bảo vệ thực vật Người ta ñã thử nghiệm sử dụng nấm Trichoderma

ñể trừ bệnh cho cà chua, dưa chuột, ớt, cải tím, rau diếp…Ở Ấn ðộ, nấm

T.viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh R.solani gây ra trên khoai tây,

hiệu lực ức chế tối ña lên ñến 83,4 % (Sing et al, 1991)

Năm 1978, Cuppels và cs ñã kết luận rằng, nhiều chủng vi khuẩn có

khả năng sản sinh bacteriocin và một số chủng sinh bacteriocin không ñộc có

khả năng giảm bệnh héo xanh của cà chua

Bệnh héo xanh do R.solanacearum là một trong 5 bệnh cây trồng thuộc

ñối tượng quan tâm nhất của chương trình phòng trừ tổng hợp của FAO (Lê

Như Kiểu, 2004) Nó là loại bệnh chịu sự kiểm soát chặt chẽ của kiểm dịch quốc tế, nhất là ở các nước thuộc cộng ñồng Châu Âu

Năm 1892, Halsted là người khởi ñầu nghiên cứu bệnh héo xanh cà chua Càng về sau này càng có nhiều công trình nghiên cứu về các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hoá, di truyền, sinh học phân tử và phân tích genome của vi

khuẩn R.solanacearum

Năm 1896, E.F Smith ñã nghiên cứu bệnh héo xanh do vi khuẩn ở khoai tây, cà chua và cà tím, năm 1909 ông lại phát hiện thấy bệnh này ở thuốc lá

Kelman ñã công bố rằng chính polysacarit ngoại bào tạo ra bởi

R.solanacearum là chất gây nên bệnh héo xanh Cook và Sequeira ñã tách thành công những gen phức tạp ñiều khiển quá trình sinh tổng hợp

Exopolisacarits EPS R.solanacearum tạo ra ít nhất 3 polygalacturonaza ngoại

bào Một endo-PG của pI 9.2 (PehA) ñã ñược tạo ra một lượng lớn khi

R.solanacearum phát triển trên môi trường giàu dinh dưỡng, nó thể hiện vai trò chính trong sự phát triển bệnh

Năm 1986, Aspiras R.B và Cruz A R cho rằng Bacillus polymyxa và P

fluorescens có khả năng giảm bệnh héo xanh cà chua ở ñiều kiện nhà kính Năm 1990, Tanaka và cs ñã phát hiện ñược các thực khuẩn thể không ñộc có

vai trò tiềm tàng trong phòng trừ sinh học ñối với R.solanacearum

Năm 1993, Hsu ñã cho rằng cải tạo ñất bằng một hỗn hợp theo công thức ammonium sulphat, bột xương, bột hải ly, cua, glixerin, sỉ silic và valin

ñã làm tăng tần xuất tạo khuẩn lạc của các chủng P.fluorescens ở ñầu rễ, chính vì vậy ñã làm tăng khả năng phòng chống bệnh héo xanh cho cây trồng

ở các thực nghiệm trong chậu

Năm 1993, Elphinstone và Aley ñã chỉ ra một loài khác là P.cepacia

ñược phân lập từ rễ ngô có khả năng ñối kháng với vi khuẩn gây bệnh héo xanh trong phòng thí nghiệm và trong chậu

Trigalet, Frey và Demery ñã ñưa ra một bức tranh toàn cảnh gồm các công trình nghiên cứu của nhiều tác giả về biện pháp phòng trừ sinh học bệnh

héo xanh do R.solanacearum như sau:

Khi sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học ñều cho thấy mức ñộ

giảm quần thể R.solanacearum một cách hiệu quả, mặc dù hầu hết các kết quả

ñều ở phạm vi phòng thí nghiệm, nhà kính và quy mô ñồng ruộng nhỏ Các

chất giống như kháng sinh sinh ra bởi Pseudomonas cepacia và Pseudomonas

glumae, cần ñược nghiên cứu kỹ hơn ñể ñánh giá vai trò tiềm tàng của chúng

trong việc phòng chống R.solanacearum ở trên ñồng ruộng

Tanaka ñã phát hiện ñược các thực khuẩn thể không ñộc có vai trò tiềm

tàng trong phòng trừ sinh học bệnh héo xanh Wall ñã phát hiện thấy tần suất

thực khuẩn thể không ñộc cao hơn ở những ruộng không có cây bị nhiễm bệnh, khi so với những ruộng bị nhiễm kề cạnh Vi khuẩn ñối kháng với

R.solanacearum có thể ñược phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, chẳng hạn

từ những vùng ñất và rễ cây họ cà, ớt và hành không có mầm bệnh

Trong hầu hết các trường hợp thì các thực nghiệm trên ñồng ruộng vẫn còn nhiều hạn chế, có thể do sự xâm nhiễm của các nhân tố phòng trừ sinh học vào trong rễ cây còn quá yếu, hoặc do sự phụ thuộc quá nhiều vào các ñiều kiện tự nhiên Một số tác giả ñã phát hiện ñược một số chủng vi sinh vật

có khả năng ñối kháng với R.solanacearum thể hiện ở bảng sau

Các chủng vi sinh vật ñối kháng với R.solanacearum

Chủng vi sinh vật Tác giả nghiên cứu

Ciampi-Panno và cs (1989) Gallardo và cs (1989) Anuratha và Gnanamanickam (1990)

Hara và Ono (1991)

B F Hu ñã phân lập ñược 2 chủng vi khuẩn ñối kháng Pseudomonas

sp (P751) và Bacillus cereus (B752) từ lá thông Chúng có khả năng ức chế

sinh trưởng và phát triển của 9 loài nấm và côn trùng, 2 chủng này an toàn ñối

với người, thực vật và ñộng vật, ức chế bệnh và tăng năng suất cây trồng như lúa, lúa mì, thuốc lá, trà, rau và cỏ

Ciampi-Panno ñã tách ñược chủng P.fluorescens BC8 có thể ức chế

mạnh vi khuẩn gây bệnh héo xanh ở khoai tây, ñặc biệt khi hạt ñược bao bọc

một lớp vỏ vi khuẩn P.fluorescens BC8 Dường như vi khuẩn này có thể xâm

nhập ñược vào cây chủ qua hệ thống rễ, song hiệu qủa kháng bệnh chưa cao, thực tế sự nhiễm bệnh ở củ vẫn xảy ra

Thực tế, trên thế giới nhiều dạng chế phẩm vi sinh vật tổng hợp khác như E.2001, Super life, Phytobacter…[40], [41], [42], [43] ñã ñược nghiên cứu sản xuất và trở thành sản phẩm thương mại Chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu (Effective microorganisms - EM (do giáo sư Teruo Higa Nhật Bản nghiên cứu), ñây là chế phẩm trộn lẫn một nhóm các loài vi sinh vật có ích trong ñó vi khuẩn axit lactic, một số nấm men, một số xạ khuẩn, vi khuẩn quang hợp,…Nó tác dụng: cải tạo lý hóa tính và ñặc tính sinh học của ñất, làm giảm mầm mống sâu bệnh trong ñất, làm tăng hiệu quả của phân bón hữu

cơ [2], [22]

Những thành tựu nghiên cứu về các dạng chế phẩm vi sinh vật ñối kháng trên thế giới ñã ñược ứng dụng và ñem lại nhiều lợi ích quan trọng trong phòng trừ một số loại sâu bệnh hại cây trồng, cũng như góp phần bảo vệ sức khỏe cho con người và môi trường sinh thái

1.2.2 Kết quả nghiên cứu trong nước

Trong những năm qua, ở nước ta có nhiều nghiên cứu, ứng dụng các dạng chế phẩm có nguồn gốc là các vi sinh vật cũng ñã có nhiều thành tựu ñáng kể, góp phần không nhỏ trong phòng trừ sâu bệnh hại

Trường ðại học Sư phạm I - Hà Nội ñã nghiên cứu chủng xạ khuẩn

Streptomyces V6 có khả năng sinh kháng sinh chống nấm và vi khuẩn R

solanacearum Viện Công nghệ Sinh học cũng ựã sản xuất các chế phẩm Bt

và một số chế phẩm sinh học khác có nguồn gốc từ vi khuẩn, xạ khuẩn và vi nấm v.v Các chế phẩm này ựã có tác dụng trong phòng chống một số sâu,

bệnh hại cây trồng [8], [14] Nấm Trichoderma và một số xạ khuẩn cũng có

tác dụng trừ bệnh hại cây trồng như bệnh héo rũ lạc, bệnh khô vằn ngô, lúa

(Nguồn: khoa học ựại chúng phục vụ Nông nghiệp và Nông thôn)

Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (cũ) ựã nghiên cứu tạo chế phẩm phân bón vi sinh trên cơ sở một tập hợp ựa chủng vi sinh vật, trong

ựó có vi khuẩn ựối kháng, sản phẩm ựược sử dụng trong trồng trọt vừa có tác dụng kắch thắch sinh trưởng của cây, vừa có khả năng ức chế một số bệnh thực vật gây ra bởi vi khuẩn hoặc nấm [26], [27], [38]

Các kết quả nghiên cứu trong thời gian gần ựây ở nước ta ựã cho những kết quả nhất ựịnh về ựặc tắnh ựối kháng của các chủng vi sinh vật đã xác ựịnh ựược 3 chủng Burkholderia có khả năng kháng nấm Fusarium gây bệnh

vùng rễ cây trồng cạn, nhiều chủng Bacillus và Pseudomonas có khả năng ựối

kháng vi khuẩn héo xanh ở cả cà chua, khoai tây và lạc, trong ựó một số

chủng Bacillus còn có thể ức chế cả nấm Fusarium gây bệnh lở cổ rễ cây

trồng cạn [26] Các nghiên cứu khác cũng cho thấy khi sử dụng chế phẩm có

chứa tổ hợp vi khuẩn ựối kháng Azotobacter và Bacillus trên cây cà chua tỷ lệ

chết do bệnh héo xanh chỉ còn 2% so với 70 - 80% khi không dùng chế phẩm

và tỷ lệ này là 0% ựối với tổ hợp vi sinh vật Enterobacter, Burkholderia,

Bacillus , Azotobacter [26] Trên lạc cũng cho kết quả tương tự, làm giảm tỷ lệ

chết do bệnh héo xanh vi khuẩn từ 70 - 80% xuống còn 2% và 0% [26] Trên khoai tây tỷ lệ này là 5% xuống còn 3,3% đối với cây lâm nghiệp và công nghiệp các tổ hợp vi sinh vật trên có tác dụng ngăn chặn bệnh lở cổ rễ

Fusarium (từ 75% còn 0% ñối với bông, cà phê; 95,6% xuống 0% ñối với thông và từ 11 - 14% xuống 0% ñối với keo lai và keo tai tượng)

Một số kết quả nghiên cứu khác cũng ñã chứng minh hoạt tính ñối

kháng của vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ñối với nấm Fusarium

oxysporum schlecht gây bệnh héo vàng (Lê Lương Tề, Master M Benchabane) [25]

Các kết quả nghiên cứu trên cho thấy rằng, ñối với các bệnh vùng rễ cây các tổ hợp vi sinh vật khác nhau có tác dụng ngăn chặn, giảm tỷ lệ bệnh xuống một cách ñáng kể ðiều này mở ra triển vọng áp dụng trong sản xuất thông qua các chế phẩm ñược sản xuất từ các chủng vi sinh vật nói trên

Cùng với chế phẩm BT, các chế phẩm sử dụng chất kháng sinh cũng ñược sử dụng trong phòng trừ nhiều loại bệnh cây trồng như: streptomycin và cyloheximit trừ vi khuẩn hại cây ăn quả, thuốc lá, ngô, cây cảnh và bệnh ñạo

ôn trên lúa (do xạ khuẩn Streptomyces griseus sản sinh ra); Kasugamycin trừ khô vằn và các bệnh trên rau (do xạ khuẩn Streptomyces Kasugaesis sản sinh

ra) v.v… và nhiều loại kháng sinh khác như Tretracyxlin chống bệnh mycoplasma; Validamycin là thuốc ñặc hiệu trừ bệnh khô vằn trên lúa và các

cây trồng khác do nấm Rhizoctonia solani gây ra Xeloxilin là sản phẩm của

Streptomyces chibaensis, kháng sinh này ñặc hiệu trừ bệnh bạc lá lúa do

Xanthomonas oryzae gây ra [14], [19], [27]

Ở nước ta các nghiên cứu sâu về bệnh héo xanh vi khuẩn vẫn còn ít ñược quan tâm Trong thực tế sản xuất, bệnh này ñã phát sinh ở hầu hết các ñịa phương trồng lạc như các tỉnh, thành phố: Hà Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Bắc Giang, Hải Dương, Hải Phòng, Hà Tây, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên v.v… [1]

Những năm gần ựây, công tác nghiên cứu bệnh cây ngày càng ựược

quan tâm nhiều hơn Riêng vi khuẩn R.solanacearum ựã có nhiều nhà khoa

học trong nước quan tâm và ựưa ra những hướng nghiên cứu mới Trường đại học Nông nghiệp I - Hà Nội, Trung tâm công nghệ sinh học - đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện nghiên cứu Rau qủa, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Viện Vi sinh vật ựã nghiên cứu nhiều về nguyên nhân gây bệnh, quy luật phát sinh trên ựồng ruộng của bệnh héo xanh cũng như các yếu tố sinh thái khác có ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh trên một số cây chủ như khoai tây, lạc, ớt, cà chuaẦv.v đã phân lập và tuyển chọn những chủng vi khuẩn có tắnh ựộc ựể chọn tạo giống cây trồng [4], [12], [17], [24]

Nhìn chung, những nghiên cứu về bệnh héo xanh do R.solanacearum

gây ra ở nước ta còn chưa nhiều, chưa toàn diện và chưa sâu, song bước ựầu

ựã ựóng góp một phần quan trọng vào việc tìm hiểu loài R.solanacearum ở Việt Nam và cũng có một số ứng dụng nhất ựịnh trong thực tiễn sản xuất cũng như trong nghiên cứu khoa học

Xuất phát từ thực tế về bệnh héo xanh lạc ở Việt Nam, các biện pháp phòng trừ sinh học bệnh này ựã và ựang ựược sự quan tâm của nhiều nhà khoa học cũng như nhiều phòng thắ nghiệm ở nước ta trong nhiều thập kỷ qua

Trường đại học Khoa học Tự nhiên ựã nghiên cứu khả năng sinh kháng

sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh của Streptomyces arabicuss 112 và chế phẩm sinh học Fluorecent từ Pseudomonas fluorescens Sản phẩm có khả

năng phòng trừ bệnh thối thân, thối rễ và vàng lá ở một số loài cây nhất ựịnh

Phòng Di truyền và Công nghệ Vi sinh - Viện Di truyền Nông nghiệp

ựã phân lập ựược một tập hợp các chủng vi khuẩn ựối kháng có khả năng ức

chế sinh trưởng và phát triển của R.solanacearum Nghiên cứu và sử dụng vi

sinh vật ñối kháng với R.solanacearum kết hợp với một số biện pháp canh tác

khác nhau là một hướng ñi rất có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn

Người ta sử dụng kỹ thuật phân tử cũng ñã xác ñịnh ñược 3 chủng vi

sinh vật Bacillus flexus, Bacillus subtilis và Bacillus subtilis thuộc nhóm vi khuẩn có ñộ an toàn sinh học cao Ba chủng Bacillus có khả năng kiểm soát bệnh héo xanh vi khuẩn trong ñiều kiện lây nhiễm nhân tạo Nhiễm Bacillus hoặc hỗn hợp Bacillus-Rhizobium làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây lạc Phân vi sinh chứa Bacillus và hỗn hợp Bacillus-Rhizobium

có khả năng hạn chế bệnh héo xanh vi khuẩn trên ñồng ruộng, giảm tỷ lệ

nhiễm bệnh so với bón phân chuồng Phân vi sinh chứa Bacillus có khả năng

nâng cao năng suất cây lạc, không ảnh hưởng ñến chất lượng lạc [7]

Tóm lại, các dạng chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính ñối kháng ñối với các loại sâu bệnh hại nói chung và bệnh héo xanh lạc nói riêng ñã và ñang ngày càng góp phần quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật, cũng như góp phần bảo vệ môi trường, phát triển nền nông nghiệp bền vững ở nước ta

CHƯƠNG II Ờ VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các chủng Ralstonia solanacearum thu thập ựược từ các ựịa

ựiểm ở vùng nghiên cứu

2.1.2. Các chủng vi sinh vật ựối kháng có sẵn tại Bộ Môn vi sinh vật Viện Thổ nhưỡng Nông hóa

2.1.3. Các giống lạc ựang trồng phổ biến tại các ựịa ựiểm tiến hành thử nghiệm hiệu lực của các chế phẩm vi sinh vật

2.1.4. Hoá chất, vi sinh vật chuẩn và các thiết bị cần thiết

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng R.solanacearum từ các mẫu bệnh thu thập ựược và xác ựịnh ựộc tắnh của chúng

2.2.2. Tuyển chọn các vi sinh vật có hoạt tắnh ựối kháng mạnh với

2.2.5. đánh giá hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi khuẩn ựối kháng

với R.solanacearum trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm, nhà lưới và xác ựịnh

hiệu quả phòng trừ bệnh héo xanh lạc của chế phẩm trên ựiều kiện ựồng ruộng tại Nghệ An

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu ñất và chuẩn bị mẫu ñất

Theo TCVN 5297 - 1995; 5960-95; 10TCN 367-99

2.3.2 Phương pháp thu mẫu bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây lạc

Phương pháp thu mẫu bệnh: mẫu bệnh ñể thu là những cây lạc mới chớm bị héo ở phần ngọn, hoặc có thể ở vài cành phía ngọn cây, ở thời ñiểm này số lượng vi khuẩn gây bệnh bên trong mô cây nhiễm bệnh ñạt mật ñộ cao nhất

Cách thu mẫu: mỗi thửa ruộng (khoảng 200m2) thu 2 ÷ 5 cây nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn, thu một ñoạn thân khoảng 3 cm sát gốc, giữ trong túi nilon Ghi thời gian thu mẫu (ngày, tháng, năm), ñịa ñiểm, giống cây,…Sau mỗi lần cắt, kéo phải ñược tẩy trùng ñể tránh lây lan vi khuẩn gây bệnh giữa

các mẫu với nhau (Lê Như Kiểu, 2004)

ðể thu ñược những vi khuẩn có tính ñại diện cao, chúng tôi tiến hành thu mẫu trên các giống lạc ñang ñược trồng phổ biến tại Nghệ An

2.3.3 Phương pháp phân lập Ralstonia solanacearum

Sau khi ñược rửa sạch bằng nước máy và sát trùng bề mặt bằng cồn 70%, các mẫu bệnh (những ñoạn thân cây sát cổ rễ, ñiểm này có mật ñộ vi khuẩn gây bệnh héo xanh cao nhất) ñược bổ dọc và cắt những phần bị nhiễm bệnh (có màu nâu nhạt), ngâm trong ống eppendorf chứa 1 ml nước cất vô trùng, ñể ở nhiệt ñộ phòng Sau 5 - 10 phút có thể quan sát thấy một dòng dịch vi khuẩn màu trắng sữa thôi ra từ mẫu bệnh Sau 20 phút loại bỏ ñoạn thân nhiễm bệnh ra khỏi ống dịch thôi vi khuẩn Những ống dịch này ñược bảo quản ở nhiệt ñộ 200C

Phân lập R.solanacearum theo Kelman Tiến hành pha loãng dịch thôi

vi khuẩn sao cho có thể thu ñược các khuẩn lạc riêng biệt sau khi cấy gạt trên

môi trường TTC, ủ ở nhiệt ñộ 28°C ± 2°C, theo dõi và ghi kết qủa sau 24, 48

và 72 giờ Từ mỗi nhóm hình thái khuẩn lạc tiến hành chọn 3 ñến 5 khuẩn lạc

ñể cấy vạch trên môi trường 523 Sau 24 - 48 giờ ủ ở nhiệt ñộ 28°C ± 2°C, tiến hành chọn những khuẩn lạc có kiểu hình thái ñiển hình của loài

R.solanacearum và giữ trong nước cất vô trùng ñể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.4 Phương pháp xác ñịnh ñộc tính của các chủng R.solanacearum

Sử dụng phương pháp cắm tăm ñể gây ñộc nhân tạo, kiểm tra số cây

chết và sống sót theo thời gian phân ñịnh mức ñộ ñộc của R.solanacearum Theo Winstead và Kelman (1952) mức ñộ ñộc của R.solanacearum ñược

phân ñịnh thành 5 mức ñộ sau

0 không có triệu chứng

1 một lá héo hoặc héo từng phần

2 hai tới ba lá héo hoặc héo từng phần

Sau khi cấy trên môi trường 523, vi khuẩn R.solanacearum ñược nhiễm

vào những cây lạc có 5 - 6 lá thật bằng phương pháp cắm tăm (dùng tăm nhọn

vô trùng lấy một ít tế bào cắm vào nách lá cây lạc), cây ñược chăm sóc ở ñiều kiện tự nhiên, nhiệt ñộ trung bình 280C - 300C, ghi kết qủa số cây chết và sống sót hàng ngày Dựa vào kết qủa về mức ñộ chết của cây lạc ñể ñánh giá mức ñộ ñộc của chủng vi khuẩn cần nghiên cứu

2.3.5 Phương pháp xác ñịnh ñộ an toàn sinh học của các chủng vi sinh vật

B subtilis trong men tiêu hóa làm ñối chứng dương, mỗi chủng vi khuẩn kiểm

ñịnh ñược tiến hành trên 15 con và chia thành 3 lô, mỗi lô ñược bố trí ăn thức

ăn ñã ñược trộn với dịch vi khuẩn ñối kháng tương ứng với các nồng ñộ 2.107; 2.108 và 2.109 tb/g thức ăn Theo dõi các triệu chứng bất thường của chuột trong vòng 24 giờ ñể ñánh giá mức ñộ gây ñộc cấp tính và theo dõi khả năng gây ñộc bán trường diễn trong 30 ngày của các chủng vi khuẩn ñối kháng Nếu có chuột chết thì mổ ra quan sát tổng thể phủ tạng, tính tỷ lệ chuột chết

và xác ñịnh LD50 theo công thức Karber-Behrens :

LD50 = Df - Sab/n

Df : Liều làm chết 100% súc vật

a : Trị số trung hình của tổng số súc vật chết ở 2 liều kế tiếp

b : Hiệu số giữa 2 liều kế tiếp

n : Số súc vật chết ở mỗi liều hoặc số trung bình các lô

2.3.6 Phương pháp xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi sinh vật

ựối kháng ựối với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Chủng vi khuẩn ựối kháng cần kiểm tra ựược cấy bằng tăm vô trùng lên ựiểm giữa của bề mặt môi trường KB (môi trường ựặc), ựể vi khuẩn phát triển

ở 280C ọ 300C trong 24 ọ 48 giờ, các tế bào phát triển thành cụm khuẩn lạc hình tròn

- Dùng bông vô trùng loại bỏ các tế bào trong cụm khuẩn lạc

- Xử lý những tế bào còn sống sót bằng cách xông hơi chloroform từ 45 ựến 60 phút

- Phun dung dịch vi khuẩn gây bệnh héo xanh ựạt mật ựộ 107ọ108 tế bào/ml kắn bề mặt môi trường

- Ủ ở nhiệt ựộ 280C ọ 300C, sau 48 giờ quan sát khả năng ựối kháng của

vi khuẩn ựược thể hiện qua hiện tượng có hay không có vòng ức chế

- Dựa vào kắch thước vòng ức chế ựể ựánh giá hiệu lực ựối kháng của chúng đó là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc (ựối với trường hợp cấy ựiểm) hoặc lỗ thạch (ựối với trường hợp khoan lỗ thạch), nơi mà vi sinh vật gây bệnh không sinh trưởng ựược [5]

2.3.7 đánh giá hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi khuẩn ựối kháng với R.solanacearum trong ựiều kiện nhà lưới

Thắ nghiệm ựược bố trắ theo phương pháp ngẫu nhiên (Phạm Chắ Thành, 1972) [5], 2 công thức, mỗi công thức 6 xô, 6 cây/xô, lặp lại 3 lần

CT1 (ựối chứng): đất nhiễm R.solanacearum;

CT2: ðất nhiễm R solanacearum + chế phẩm CP1;

Cách xử lý chế phẩm: Hạt lạc ñược ủ ẩm qua ñêm (ñã nứt nanh) rồi ngâm trong chế phẩm CP1 trước khi gieo 30 phút Bổ sung 5 - 10ml dịch chế phẩm với mật ñộ 108cfu/ml/hốc ñất trước gieo hạt Theo dõi tỷ lệ bệnh héo xanh sau 10, 20, 30 và 40 ngày ðo các chỉ tiêu sinh trưởng như chiều cao cây, trọng lượng tươi, khô và năng suất

ðể ñánh giá khả năng phòng trừ bệnh héo xanh của chế phẩm, chúng tôi dựa vào chỉ tiêu:

• Tỷ lệ bệnh:

Tổng số cây bị bệnh

Tỷ lệ cây bị bệnh (%) = Tổng số cây ñiều tra x 100

• ðiều tra trên tất cả các cây sử dụng trong thí nghiệm

2.3.8 Phương pháp bố trí thí nghiệm ñồng ruộng diện hẹp

Diện tích 500m2 chia thành 2 công thức:

CT1 (ðối chứng): không nhiễm chế phẩm vi sinh vật;

CT2: nhiễm chế phẩm CP1

Cách xử lý chế phẩm lần 1: Hạt lạc ñược ủ ẩm qua ñêm (ñã nứt nanh) rồi trộn ñều trong chế phẩm CP1 (với mật ñộ khoảng 108CFU/g) trước khi gieo 30 phút Chế phẩm ñược rải ñều trên mặt rãnh, gieo hạt theo tỉ lệ nhất ñịnh, lấp nhẹ một lớp ñất lên trên

Cách xử lý chế phẩm lần 2: chế phẩm ựược bổ sung vào quanh gốc khi cây ở giai ựoạn chuẩn bị vun Theo dõi tỷ lệ bệnh héo xanh sau 24, 31, 38 và

45 ngày đo các chỉ tiêu sinh trưởng và theo dõi tỷ lệ bệnh như thắ nghiệm trong nhà lưới

Các thử nghiệm diện hẹp tiến hành ngoài ựồng ruộng ựược bố trắ ngẫu

(theo Phạm Chắ Thành (1988), Giáo trình phương pháp thắ nghiệm ựồng

ruộng, trường đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội)

2.3.9 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng

- đánh giá khả năng tương tác của các chủng VSV ựối kháng tuyển chọn

ở ựiều kiện hỗn hợp trong chế phẩm dạng lỏng và bột, thông qua việc xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh sinh học của chúng ở dạng ựơn lẻ và

dạng hỗn hợp trong chế phẩm

+ Các chủng VSV lựa chọn sau thời gian nuôi cấy 48 h ựược nhiễm vào chất mang dạng lỏng (môi trường dinh dưỡng tự nhiên hoặc nhân tạo, ựảm bảo mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn 108- 109CFU/ml(g)); hoặc dạng bột (than bùn) với mật ựộ tương ựương nhau Kiểm tra xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh sinh học của chúng bằng cách nêu trên sau các thời gian khác nhau

+ Phương pháp Koch: ựể xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV (ựếm số lượng

khuẩn lạc trên ựĩa môi trường ựể xác ựịnh ựơn vị hình thành khuẩn lạc:

CFU/ml)

- Nghiên cứu sản xuất sinh khối VSV hữu hiệu

+ Nghiên cứu các ñiều kiện nuôi cấy thích hợp cho từng chủng VSV: nguồn dinh dưỡng, pH, nhiệt ñộ, kiểu nuôi cấy, chế ñộ cấp khí, thời gian nuôi cấy

+ Lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV từ các nguồn vật liệu rẻ tiền, dễ kiếm song phải ñảm bảo cho VSV sinh trưởng phát triển tốt

+ Lên men thử nghiệm, xác ñịnh các thông số kỹ thuật cho nhân sinh khối VSV trên thiết bị lên men chìm qui mô 3lít/mẻ

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ñối kháng Nghiên cứu ñiều kiện bảo quản sản phẩm

+ Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất gồm: Nghiên cứu tỉ lệ phối

trộn sinh khối vi sinh vật, các chất khoáng và nguyên liệu hữu cơ khác nhau như: than bùn, gỉ ñường và phụ gia ñể chọn quy trình phù hợp

+ Nghiên cứu ñiều kiện bảo quản sản phẩm: Chế phẩm tạo ra sẽ ñược

bảo quản bằng các phương pháp khác nhau: giữ ở nhiệt ñộ phòng, nhiệt ñộ lạnh 40C, bổ sung chất bảo quản ; kiểm tra sự sống sót và hoạt tính sinh học của các chủng VSV sau các thời gian bảo quản từ 1- 6 tháng

2.3.10 Xử lý số liệu

Số liệu của các thí nghiệm và thử nghiệm ñược xử lý theo phần mềm IRISTAR; phương pháp thí nghiệm và thống kê sinh học

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng R solanasearum từ các mẫu bệnh

thu thập ñược và xác ñịnh ñộc tính của chúng

Tại Nghệ An, chúng tôi tiến hành lấy mẫu R solanasearum tại xã Nghi

Long, huyện Nghi Lộc và xã Minh Thành, huyện Yên Thành Tại ñây tình hình sâu bệnh hại lạc diễn ra rất phức tạp, trong ñó bệnh héo xanh là một trong những nguyên nhân gây hại nặng nhất dẫn ñến năng suất và chất lượng lạc bị giảm ñi ñáng kể

Tại ñây chúng tôi ñã tiến hành lấy mẫu cây bệnh và ñất trồng Cây lạc khi bị bệnh héo xanh thì biểu hiện chung là các lá non ở phía ngọn héo rủ xuống vì mất nước, tiếp theo, bệnh phát triển, phần héo lan nhanh xuống phía dưới, dẫn ñến toàn bộ cây bị héo và chết

3.1.1 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R solanacearum

ðể phân lập chính xác vi khuẩn gây bệnh héo xanh chỉ nên thu thập những cây mới thể hiện triệu chứng bệnh (có 3 ñến 4 lá trên ngọn bị héo xanh) Bởi vì những cây trồng ngoài ñồng ñã bị nhiễm bệnh lâu ngày thường khó hoặc không thể phân lập ñược vi khuẩn gây bệnh ñích thực, vì nó thường

bị tạp nhiễm thêm nhiều loại vi sinh vật hoại sinh khác

Chúng tôi ñã thu thập ñược 15 mẫu cây lạc bị bệnh ở các ñịa ñiểm khác nhau tại xã Nghi Long, huyện Nghi Lộc và xã Minh Thành, huyện Yên Thành, tỉnh Nghệ An Mẫu thu ngày nào thì ñược xử lý ngay ngày hôm ñó ñể tránh làm giảm sức sống của vi khuẩn gây bệnh Không thể chỉ dựa vào các biểu hiện triệu chứng bệnh mà nhận biết ñược loài vi khuẩn gây bệnh Vì cùng một loại triệu chứng hoặc những triệu chứng giống nhau lại có thể do

những lồi vi khuẩn khác nhau gây ra Do đĩ, khi chẩn đốn bệnh và xác định lồi vi khuẩn gây bệnh chỉ căn cứ vào triệu chứng là chưa đủ Cần thiết phải phân lập, xác định tác nhân gây bệnh và khẳng định tính gây bệnh của vi khuẩn phân lập được

Từ mỗi mẫu cây bệnh thu một ống dịch vi khuẩn, dịch này được cấy trên mơi trường nhận biết TTC và nuơi ở nhiệt độ 28 0C ÷ 30 0C, sau 48 giờ sẽ

chọn ra những dạng hình thái khuẩn lạc đặc trưng - màu trắng kem hoặc trắng sữa, thể chảy lỏng, khoanh trịn khơng chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm ðại diện của mỗi dạng khuẩn lạc được giữ trong dung dịch bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

Các chủng vi khuẩn này đã được làm thuần bằng cách cấy truyền các khuẩn lạc tách rời nhau khi phát triển trên mơi trường TTC Sau 3 lần cấy truyền liên tiếp từ 1 khuẩn lạc thu được chủng vi khuẩn thuần ðại diện của mỗi dạng hình thái khuẩn lạc của chủng thuần được giữ trong nước cất vơ trùng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo Kết quả thu được 7 chủng vi khuẩn thuần khác nhau từ 15 mẫu cây bệnh ban đầu

Bảng 3.1 ðặc điểm sinh học điển hình của một số chủng R solanacearum

Tỷ lệ (%) gây chết cây

100

Ảnh 3.1: Hình thái khuẩn lạc

của một số chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Ảnh 3.1 và số liệu bảng 3.1 cho thấy, hình thái, mầu sắc và kích thước

của các khuẩn lạc vi khuẩn gây ra triệu chứng bệnh héo xanh trên lạc là rất

khác nhau, qua ựó chúng ta có thể nhận thấy rằng quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở các ựịa ựiểm thu mẫu là rất ựa dạng

Kắch thước khuẩn lạc ựược quan sát ở thời ựiểm sau 48 giờ phát triển dao ựộng từ 0,8 mm ựến 3,0 mm và ựa số khuẩn lạc có kắch thước nằm trong khoảng 1,0 mm ọ 1,8 mm

độc tắnh của các chủng này ựược kiểm tra bằng khả năng gây bệnh trên cây lạc khi cây có 3 - 6 lá thật

Trong số 7 chủng vi khuẩn R solanacearum có 5 chủng gây chết héo

100 % cây lạc (NA1, NA2, NA3, NA4, YT1); 2 chủng (YT2, NL1) gây chết lạc 75 %

3.1.2 đánh giá ựộc tắnh của những chủng R solanacearum phân lập ựược

Từ những chủng VK R solanasearum phân lập ựược, ựã tiến hành xác

ựịnh ựộc tắnh của chúng bằng phương pháp cắm tăm ựể gây ựộc nhân tạo; kiểm tra số cây chết và sống sót theo thời gian, dựa vào kết quả ựể ựánh giá

tắnh ựộc của VK R solanasearum

Kết quả, ựã tuyển chọn ựược 3 chủng R solanasearum có ựộc tắnh

mạnh với cây lạc đa số các chủng này khuẩn lạc có dạng tròn nhỏ, chấm ựỏ

ở tâm, một số có dạng chảy lỏng hay dạng vòm lồi nhày Các chủng này ựược bảo quản ựể sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo

1 YT1 Nghi Long - Nghi

100

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng với R solanacearum và

xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng

3.2.1 Tuyển chọn vi khuẩn ựối kháng từ nguồn có sẵn

Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng là phải có hoạt lực ựối kháng cao, tác dụng trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh, ổn ựịnh lâu dài và không gây bệnh trên ựộng vật máu nóng đã tiến hành lựa chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng có sẵn tại Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, các chủng này

có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong ựó tập trung chủ yếu ở các tỉnh Vĩnh Phúc,

Hà Tĩnh, Hà Nội, Nghệ An và Thanh Hóa

Bảng 3.3 đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn ựối kháng lựa

chọn

TT Chủng Nguồn gốc đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc

(trên môi trường KB)

1 DH1 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia Ờ Thanh Hóa

Dạng vòm lồi, màu trắng, nhày

2 DH5 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia - Thanh Hóa

Tròn to, bề mặt nhăn, màu trắng sữa, dai

3 DH6 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia - Thanh Hóa

Tròn to, dạng lồi, màu nâu, dạng bột

4 DH11 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia - Thanh Hóa

Tròn nhỏ, hơi lồi, màu vàng xanh, nhớt

5 NC1 Cây vừng khỏe tại

Thạch Thành - Thanh Hóa

Tròn nhỏ, Trắng sữa, dạng vòm lồi, nhớt

6 NC9 Cây vừng khỏe tại

Thạch Thành - Thanh Hóa

Tròn nhỏ, màu trắng sữa, hơi nhày

7 STS1 Mẫu cây Lạc khỏe tại

Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn dẹt, màu trắng ngà, dạng bột

8 STS3 Mẫu cây Lạc khỏe tại

Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn to, màu vàng nhạt, nhày

9 STS5 Mẫu cây Lạc khỏe tại

Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn nhỏ li ti, màu trắng, nhày

10 STS7 Mẫu cây lạc khỏe tại

Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn to, dạng vòm lồi, mép vàng trong

11 STS9 Mẫu cây lạc khỏe tại

Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn, bề mặt nhăn, màu vàng rơm, dạng bột

12 STS11 Mẫu cây lạc khỏe tại

Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn dẹt màu trắng mép có khía

13 Tb2 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh – Vĩnh Phúc

Tròn to, dạng vòm lồi, màu vàng, nhày

14 Tb4 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh – Vĩnh Phúc

Tròn to, dạng vòm lồi, mép răng cưa, màu trắng, dai

15 Tb6 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh – Vĩnh Phúc

Tròn nhỏ li ti, màu trắng sữa, nhày

16 T15 Mẫu cây lạc khỏe tại Tiền

Phong-Mê Linh–Vĩnh Phúc

Tròn to, dạng vòm lồi, màu trắng ngà, nhày

17 Tb12 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh – Vĩnh Phúc

Dạng chảy lỏng, màu trắng xám, nhày

18 HS8 Mẫu cây vừng khỏe tại

Tân Lộc - Can Lộc - Hà Tĩnh

Tròn, dạng vòm lồi, màu vàng cam, nhày

19 HS10 Mẫu cây vừng khỏe tại

Tân Lộc - Can Lộc - Hà Tĩnh

Tròn to, lồi bóng, màu vàng nâu, nhày

20 HS13 Mẫu cây vừng khỏe tại

Tân Lộc-Can Lộc-Hà Tĩnh

Tròn nhỏ, dẹt, màu da cam, dai

21 Pb8 Mẫu cây lạc khỏe tại

An

Khuẩn lạc tròn to, bẹt, mép có răng cưa, vàng cam, dạng bột

31

PX1 Khuẩn lạc tròn to, lồi bóng, màu

xám, sắc tố màu nâu, nhày

32

PX7

ðất và cây lạc, vừng khỏe tại huyện Yên Thành, Nghệ An Khuẩn lạc tròn to, bề mặt khuẩn lạc tròn lồi, màu trắng sữa, hơi

nhày

33

PX9

Dạng không chuẩn mực, vòm lồi, mép khuẩn lạc không màu, bẹt, trắng, nhày

34

PX12

Khuẩn lạc kích thước trung bình, dẹt trong, bề mặt phẳng nhẵn, màu xanh ñen, nhày

(Nguồn: Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá)

Từ 34 chủng vi khuẩn ñối kháng có sẵn tại Bộ môn Vi sinh vật ñã lựa chọn ñược 4 chủng ñối kháng mạnh nhất và ñiển hình, ngoài ra cũng lựa chọn thêm chủng Ba5.1 từ nguồn khác ñể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

+ Trong ñó chủng vi khuẩn TS6 và CX10 không chỉ có khả năng ñối

kháng với vi khuẩn R solanacearum và nấm F oxysporum mà còn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm S rolfsii và A niger (nguồn: Bộ môn vi

sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá). ðây là những chủng có tiềm năng ñể sản xuất chế phẩm vi sinh ñối kháng sử dụng trong phòng chống bệnh héo xanh lạc

+ Chủng T15 chỉ có khả năng ñối kháng với vi khuẩn R solanacearum

Ảnh 3.3 Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn ñối kháng

ở ñộ phóng ñại 1.000 lần

Các khuẩn lạc có mầu sắc và hình thái tế bào khác nhau (ảnh 3.2 và 3.3), khuẩn lạc có xu hướng màu vàng, vàng nhạt, phớt hồng, bề mặt nhăn nheo, nhẵn bóng, nhày và to nhỏ khác nhau

Bảng 3.4 Hoạt lực ñối kháng của các chủng vi khuẩn lựa chọn với vi khuẩn gây

bệnh héo xanh lạc

Hoạt lực ñối kháng (kích thước vòng vô khuẩn D-d

(mm) ñối với vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc