Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ñố i kháng

L ỜI CAM ð OAN

2.3.9.Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ñố i kháng

4. ðố it ượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài

2.3.9.Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ñố i kháng

- đánh giá khả năng tương tác của các chủng VSV ựối kháng tuyển chọn

ở ựiều kiện hỗn hợp trong chế phẩm dạng lỏng và bột, thông qua việc xác

ựịnh mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh sinh học của chúng ở dạng ựơn lẻ và dạng hỗn hợp trong chế phẩm.

+ Các chủng VSV lựa chọn sau thời gian nuôi cấy 48 h ựược nhiễm vào chất mang dạng lỏng (môi trường dinh dưỡng tự nhiên hoặc nhân tạo,

ựảm bảo mật ựộ tế bào của các chủng vi khuẩn lựa chọn 108- 109CFU/ml(g)); hoặc dạng bột (than bùn) với mật ựộ tương ựương nhau. Kiểm tra xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh sinh học của chúng bằng cách nêu trên sau các thời gian khác nhau.

+ Phương pháp Koch: ựể xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV (ựếm số lượng khuẩn lạc trên ựĩa môi trường ựể xác ựịnh ựơn vị hình thành khuẩn lạc: CFU/ml).

+Nghiên cứu các ựiều kiện nuôi cấy thắch hợp cho từng chủng VSV: nguồn dinh dưỡng, pH, nhiệt ựộ, kiểu nuôi cấy, chếựộ cấp khắ, thời gian nuôi cấy.

+ Lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV từ các nguồn vật liệu rẻ

tiền, dễ kiếm song phải ựảm bảo cho VSV sinh trưởng phát triển tốt.

+ Lên men thử nghiệm, xác ựịnh các thông số kỹ thuật cho nhân sinh khối VSV trên thiết bị lên men chìm qui mô 3lắt/mẻ.

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng. Nghiên cứu ựiều kiện bảo quản sản phẩm.

+ Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất gồm:Nghiên cứu tỉ lệ phối trộn sinh khối vi sinh vật, các chất khoáng và nguyên liệu hữu cơ khác nhau như: than bùn, gỉựường và phụ gia ựể chọn quy trình phù hợp.

+ Nghiên cứu ựiều kiện bảo quản sản phẩm: Chế phẩm tạo ra sẽ ựược bảo quản bằng các phương pháp khác nhau: giữ ở nhiệt ựộ phòng, nhiệt ựộ

lạnh 40C, bổ sung chất bảo quản...; kiểm tra sự sống sót và hoạt tắnh sinh học của các chủng VSV sau các thời gian bảo quản từ 1- 6 tháng.

2.3.10. Xử lý số liệu

Số liệu của các thắ nghiệm và thử nghiệm ựược xử lý theo phần mềm IRISTAR; phương pháp thắ nghiệm và thống kê sinh học.

CHƯƠNG III Ờ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng R. solanasearum từ các mẫu bệnh thu thập ựược và xác ựịnh ựộc tắnh của chúng

Tại Nghệ An, chúng tôi tiến hành lấy mẫu R. solanasearum tại xã Nghi Long, huyện Nghi Lộc và xã Minh Thành, huyện Yên Thành. Tại ựây tình hình sâu bệnh hại lạc diễn ra rất phức tạp, trong ựó bệnh héo xanh là một trong những nguyên nhân gây hại nặng nhất dẫn ựến năng suất và chất lượng lạc bị giảm ựi ựáng kể.

Tại ựây chúng tôi ựã tiến hành lấy mẫu cây bệnh và ựất trồng. Cây lạc khi bị bệnh héo xanh thì biểu hiện chung là các lá non ở phắa ngọn héo rủ

xuống vì mất nước, tiếp theo, bệnh phát triển, phần héo lan nhanh xuống phắa dưới, dẫn ựến toàn bộ cây bị héo và chết.

3.1.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn R. solanacearum

để phân lập chắnh xác vi khuẩn gây bệnh héo xanh chỉ nên thu thập những cây mới thể hiện triệu chứng bệnh (có 3 ựến 4 lá trên ngọn bị héo xanh). Bởi vì những cây trồng ngoài ựồng ựã bị nhiễm bệnh lâu ngày thường khó hoặc không thể phân lập ựược vi khuẩn gây bệnh ựắch thực, vì nó thường bị tạp nhiễm thêm nhiều loại vi sinh vật hoại sinh khác.

Chúng tôi ựã thu thập ựược 15 mẫu cây lạc bị bệnh ở các ựịa ựiểm khác nhau tại xã Nghi Long, huyện Nghi Lộc và xã Minh Thành, huyện Yên Thành, tỉnh Nghệ An. Mẫu thu ngày nào thì ựược xử lý ngay ngày hôm ựó ựể

tránh làm giảm sức sống của vi khuẩn gây bệnh. Không thể chỉ dựa vào các biểu hiện triệu chứng bệnh mà nhận biết ựược loài vi khuẩn gây bệnh. Vì cùng một loại triệu chứng hoặc những triệu chứng giống nhau lại có thể do

những loài vi khuẩn khác nhau gây ra. Do ựó, khi chẩn ựoán bệnh và xác ựịnh loài vi khuẩn gây bệnh chỉ căn cứ vào triệu chứng là chưa ựủ. Cần thiết phải phân lập, xác ựịnh tác nhân gây bệnh và khẳng ựịnh tắnh gây bệnh của vi khuẩn phân lập ựược.

Từ mỗi mẫu cây bệnh thu một ống dịch vi khuẩn, dịch này ựược cấy trên môi trường nhận biết TTC và nuôi ở nhiệt ựộ 28 0C ọ 30 0C, sau 48 giờsẽ

chọn ra những dạng hình thái khuẩn lạc ựặc trưng - màu trắng kem hoặc trắng sữa, thể chảy lỏng, khoanh tròn không chuẩn mực với màu phớt hồng ở tâm.

đại diện của mỗi dạng khuẩn lạc ựược giữ trong dung dịch bảo quản ựể sử

dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Các chủng vi khuẩn này ựã ựược làm thuần bằng cách cấy truyền các khuẩn lạc tách rời nhau khi phát triển trên môi trường TTC. Sau 3 lần cấy truyền liên tiếp từ 1 khuẩn lạc thu ựược chủng vi khuẩn thuần. đại diện của mỗi dạng hình thái khuẩn lạc của chủng thuần ựược giữ trong nước cất vô trùng ựể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả thu ựược 7 chủng vi khuẩn thuần khác nhau từ 15 mẫu cây bệnh ban ựầu.

Bảng 3.1. đặc ựiểm sinh học ựiển hình của một số chủng R. solanacearum thu thập ựược (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

STT Ký hiệu chủng

Nguồn gốc phân lập Cây ký chủ

đặc ựiểm hình thái (trên môi trường

TTC)

Tỷ lệ

(%) gây chết cây

a b c d e f

1 NL1 Nghi Long - Nghi Lộc - Nghệ An

Lạc Dạng chảy lỏng, hồng nhạt ở tâm

75 2 YT1 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Dạng tròn nhỏ, chấm ựỏở tâm

a b c d e f 3 YT2 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Tròn to hồng nhày

ở tâm

75 4 NA1 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Dạng chảy lỏng, màu trắng kem

100 5 NA2 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Khuẩn lạc tròn nhỏ, dạng vòm lồi nhày chấm ựổ nhỏở tâm

100

6 NA3 Nghi Long - Nghi Lộc - Nghệ An

Lạc Dạng chảy lỏng, màu trắng kem

100 7 NA4 Nghi Long - Nghi Lộc

- Nghệ An Lạc Khuẩn lạc tròn nhỏ, dạng vòm lồi nhày chấm ựổ nhỏở tâm 100 Ảnh 3.1: Hình thái khuẩn lạc

của một số chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh

Ảnh 3.1 và số liệu bảng 3.1 cho thấy, hình thái, mầu sắc và kắch thước của các khuẩn lạc vi khuẩn gây ra triệu chứng bệnh héo xanh trên lạc là rất

khác nhau, qua ựó chúng ta có thể nhận thấy rằng quần thể vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc ở các ựịa ựiểm thu mẫu là rất ựa dạng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Kắch thước khuẩn lạc ựược quan sát ở thời ựiểm sau 48 giờ phát triển dao ựộng từ 0,8 mm ựến 3,0 mm và ựa số khuẩn lạc có kắch thước nằm trong khoảng 1,0 mm ọ 1,8 mm.

độc tắnh của các chủng này ựược kiểm tra bằng khả năng gây bệnh trên cây lạc khi cây có 3 - 6 lá thật.

Trong số 7 chủng vi khuẩn R. solanacearum có 5 chủng gây chết héo 100 % cây lạc (NA1, NA2, NA3, NA4, YT1); 2 chủng (YT2, NL1) gây chết lạc 75 %.

3.1.2. đánh giá ựộc tắnh của những chủng R. solanacearum phân lập ựược

Từ những chủng VK R. solanasearum phân lập ựược, ựã tiến hành xác

ựịnh ựộc tắnh của chúng bằng phương pháp cắm tăm ựể gây ựộc nhân tạo; kiểm tra số cây chết và sống sót theo thời gian, dựa vào kết quả ựể ựánh giá tắnh ựộc của VK R. solanasearum.

Kết quả, ựã tuyển chọn ựược 3 chủng R. solanasearum có ựộc tắnh mạnh với cây lạc. đa số các chủng này khuẩn lạc có dạng tròn nhỏ, chấm ựỏ ở tâm, một số có dạng chảy lỏng hay dạng vòm lồi nhày. Các chủng này ựược bảo quản ựể sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3.2: Các chủng R. solanasearum có ựộc tắnh mạnh với lạc

STT Ký hiệu

chủng Nguồn gốc phân lập Ký chCây ủ

đặc ựiểm hình thái (trên môi trường

TTC)

Tỷ lệ

(%) gây chết

cây 1 YT1 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Dạng tròn nhỏ, chấm ựỏở tâm

100 2 NA2 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Khuẩn lạc tròn nhỏ, dạng vòm lồi nhày

chấm ựổ nhỏở tâm 5 NA4 Nghi Long - Nghi

Lộc - Nghệ An

Lạc Khuẩn lạc tròn nhỏ, dạng vòm lồi nhày chấm ựổ nhỏở tâm

100

3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng với R. solanacearum và xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng xác ựịnh hoạt tắnh ựối kháng

3.2.1. Tuyển chọn vi khuẩn ựối kháng từ nguồn có sẵn

Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng là phải có hoạt lực ựối kháng cao, tác dụng trên nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh, ổn ựịnh lâu dài và không gây bệnh trên ựộng vật máu nóng. đã tiến hành lựa chọn các chủng vi khuẩn ựối kháng có sẵn tại Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, các chủng này có nhiều nguồn gốc khác nhau, trong ựó tập trung chủ yếu ở các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Tĩnh, Hà Nội, Nghệ An và Thanh Hóa.

Bảng 3.3.đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn ựối kháng lựa chọn

TT Chủng Nguồn gốc đặc ựiểm hình thái khuẩn lạc (trên môi trường KB) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

a b c d

1 DH1 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia Ờ Thanh Hóa

Dạng vòm lồi, màu trắng, nhày

2 DH5 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia - Thanh Hóa

Tròn to, bề mặt nhăn, màu trắng sữa, dai

3 DH6 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia - Thanh Hóa

Tròn to, dạng lồi, màu nâu, dạng bột

4 DH11 Mẫu ựất tại

Tĩnh Gia - Thanh Hóa

Tròn nhỏ, hơi lồi, màu vàng xanh, nhớt 5 NC1 Cây vừng khỏe tại Thạch Thành - Thanh Hóa Tròn nhỏ, Trắng sữa, dạng vòm lồi, nhớt

6 NC9 Cây vừng khỏe tại Thạch Thành - Thanh Hóa Tròn nhỏ, màu trắng sữa, hơi nhày 7 STS1 Mẫu cây Lạc khỏe tại Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội Tròn dẹt, màu trắng ngà, dạng bột a b c d 8 STS3 Mẫu cây Lạc khỏe tại Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn to, màu vàng nhạt, nhày

9 STS5 Mẫu cây Lạc khỏe tại Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội

Tròn nhỏ li ti, màu trắng, nhày

10 STS7 Mẫu cây lạc khỏe tại Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội Tròn to, dạng vòm lồi, mép vàng trong 11 STS9 Mẫu cây lạc khỏe tại Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội Tròn, bề mặt nhăn, màu vàng rơm, dạng bột. 12 STS11 Mẫu cây lạc khỏe tại Nam Sơn- Sóc Sơn- Hà Nội Tròn dẹt màu trắng mép có khắa. 13 Tb2 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc

Tròn to, dạng vòm lồi, màu vàng, nhày

14 Tb4 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc

Tròn to, dạng vòm lồi, mép răng cưa, màu trắng, dai

15 Tb6 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc

Tròn nhỏ li ti, màu trắng sữa, nhày

16 T15 Mẫu cây lạc khỏe tại Tiền Phong-Mê LinhỜVĩnh Phúc

Tròn to, dạng vòm lồi, màu trắng ngà, nhày

17 Tb12 Mẫu cây lạc khỏe tại

Tiền Phong - Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Dạng chảy lỏng, màu trắng xám, nhày

18 HS8 Mẫu cây vừng khỏe tại Tân Lộc - Can Lộc - Hà Tĩnh Tròn, dạng vòm lồi, màu vàng cam, nhày 19 HS10 Mẫu cây vừng khỏe tại Tân Lộc - Can Lộc - Hà Tĩnh

Tròn to, lồi bóng, màu vàng nâu, nhày

a b c d

20 HS13 Mẫu cây vừng khỏe tại Tân Lộc-Can Lộc-Hà Tĩnh

Tròn nhỏ, dẹt, màu da cam, dai

21 Pb8 Mẫu cây lạc khỏe tại Hương Sơn Ờ Hà Tĩnh Tròn to, hơi dẹt, màu vàng, mép trong, hơi nhày 22 C4 Mẫu cây cà chua khỏe tại Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc Tròn to, bề mặt nhăn nheo, mầu trắng ựục tiết sắc tố nâu 23 CRT Mẫu cây cà chua khỏe tại Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc Tròn nhỏ, lồi màu vàng, nhày 24 TS6 Rễ cây hành tại Mê Linh Ờ Vĩnh Phúc

Tròn to, dẹt, mầu xanh nhạt, nhày

25 CX

1 Khuẩn lạc tròn to, bẹt, mép có răng cưa, màu trắng, dạng bột 26

CX5

Khuẩn lạc tròn kắch thước trung bình, tâm hơi nhăn, mép trơn, màu xám nhạt, dạng bột 27 CX 6 Khuẩn lạc tròn nhỏ bóng, màu vàng, hơi nhày 28 CX8 Khuẩn lạc dạng hình ovan, trắng, chảy nhớt 29 CX 10 Khuẩn lạc tròn nhỏ, hơi lồi màu ựỏ, nhày 30 CX 13 đất và cây lạc, vừng khỏe tại huyện Nghi Lộc, Nghệ An Khuẩn lạc tròn to, bẹt, mép có răng cưa, vàng cam, dạng bột 31

PX1 Khuẩn lạc tròn to, lồi bóng, màu xám, sắc tố màu nâu, nhày

32

PX7

đất và cây lạc, vừng khỏe tại huyện Yên Thành,

Nghệ An Khulạc tròn lẩn lạc tròn to, bồi, màu trắềng s mặt khuữa, hẩơn i nhày

33

PX9

Dạng không chuẩn mực, vòm lồi, mép khuẩn lạc không màu, bẹt, trắng, nhày

34

PX12

Khuẩn lạc kắch thước trung bình, dẹt trong, bề mặt phẳng nhẵn, màu xanh ựen, nhày

(Nguồn: Bộ môn Vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá)

Từ 34 chủng vi khuẩn ựối kháng có sẵn tại Bộ môn Vi sinh vật ựã lựa chọn

ựược 4 chủng ựối kháng mạnh nhất và ựiển hình, ngoài ra cũng lựa chọn thêm chủng Ba5.1 từ nguồn khác ựể tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.

+ Trong ựó chủng vi khuẩn TS6 và CX10 không chỉ có khả năng ựối kháng với vi khuẩn R. solanacearum và nấm F. oxysporum mà còn có khả

năng ức chế sự phát triển của nấm S. rolfsii và A. niger (nguồn: Bộ môn vi sinh vật - Viện Thổ nhưỡng Nông hoá). đây là những chủng có tiềm năng ựể

sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng sử dụng trong phòng chống bệnh héo xanh lạc.

+ Chủng T15 chỉ có khả năng ựối kháng với vi khuẩn R. solanacearum (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

trên lạc.

Hoạt lực ựối kháng của các chủng vi khuẩn ựược thể hiện ở bảng 4. Kắch thước vòng vô khuẩn dao ựộng trong khoảng 4 mm - 20 mm.

Ảnh 3.3. Hình dạng tế bào của một số chủng vi khuẩn ựối kháng

ởựộ phóng ựại 1.000 lần

Các khuẩn lạc có mầu sắc và hình thái tế bào khác nhau (ảnh 3.2 và 3.3), khuẩn lạc có xu hướng màu vàng, vàng nhạt, phớt hồng, bề mặt nhăn nheo, nhẵn bóng, nhày và to nhỏ khác nhau.

Bảng 3.4. Hoạt lực ựối kháng của các chủng vi khuẩn lựa chọn với vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc

Hoạt lực ựối kháng (kắch thước vòng vô khuẩn D-d (mm) ựối với vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc

(R.solanacearum) TT

Chủng

ựối kháng

NA1 YT1 NA2 NA3 NA4

1 T15 20 20 18 20 16

2 Pb8 16 16 18 16 18

3 TS6 12 12 20 16 -

4 CX10 14 16 16 18 20

3.2.2. Nghiên cứu các ựặc ựiểm sinh học và phân loại các chủng vi khuẩn

ựối kháng

Tất cả 4 chủng vi khuẩn ựối kháng tuyển chọn ựã ựược ựánh giá hoạt tắnh sinh học ựể tiếp tục chọn lọc những chủng có các ựặc tắnh mong muốn. Kết quảựược minh họa ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. đặc ựiểm sinh học của các chủng vi khuẩn ựối kháng

TT hiKý ệu chủng

Gram trSinh ưởng hiếu khắ Sinh trưởng kị khắ Màu sắc