L ỜI CAM ð OAN
4. ðố it ượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài
3.3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật ñố i kháng bệnh
phòng chống bệnh héo xanh cây lạc
3.3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật ựối kháng bệnh héo xanh cây lạc héo xanh cây lạc
Trên cơ sở nguồn chủng giống VSV tuyển chọn, ựề tài tiến hành nghiên cứu nhân sinh khối các chủng VSV. Trước tiên, tiến hành các nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp ựể nhân sinh khối VSV, nhằm ựạt sinh khối vi sinh vật tối ựa khi lên men, hoạt tắnh sinh học ựược ổn ựịnh và giá thành rẻ, ựáp
ứng với yêu cầu của sản xuất. Sau ựó, ựề tài tiến hành xác ựịnh ảnh hưởng của các ựiều kiện môi trường nuôi cấy (pH, nhiệt ựộ, chế ựộ cấp khắ...) ựến sinh trưởng, phát triển và hoạt tắnh sinh học của các chủng VSV. đồng thời nghiên cứu lựa chọn, xử lý chất mang, ựiều kiện bảo quản phù hợp ựể từựó xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng phòng trừ bệnh héo xanh lạc.
A. Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV
Vi sinh vật luôn có nhu cầu sử dụng các nguồn dinh dưỡng khác nhau
ựể duy trì hoạt ựộng sống của cơ thể. Các chất dinh dưỡng ựược vi sinh vật thu nhận từ môi trường và sử dụng chúng làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình trao ựổi chất và sinh tổng hợp các thành phần của tế bào.
đề tài ựã sử dụng các nguồn dinh dưỡng tổng hợp và nguồn dinh dưỡng tự nhiên dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy nhân sinh khối các chủng
VSV. Kết quả so sánh mật ựộ các chủng VSV và hoạt tắnh của chúng trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau ựược thể hiện trong các bảng 3.10 và 3.11:
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ựến sự phát triển của các chủng vi khuẩn
Mật ựộ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường
TT Kắ hiệu chủng King Pseu SX1 SX2 SX3 SX4 1 Ps1 2,2x 108 1,6 x109 2,4 x 108 2,9 x 108 4,2 x 109 9,8 x 107 2 TS6 3,1 x108 1,3 x109 2,0 x 108 5,2 x 108 3,4 x 109 7,8 x 107 3 BK1 4,4 x108 2,5x 108 1,2 x 107 2,6 x 107 6,0 x 108 4,0 x 107 4 Ba5.1 6,0 x108 1,1 x108 1,8 x108 8,3 x108 6,9 x108 1,1 x108 5 T15 2,1 x109 1,4 x108 8,5 x107 4,2 x109 3,8 x109 1,4 x108
Chú thắch: * SX1, SX2, SX3, SX4: là các môi trường chứa gỉ ựường mắa, dịch nước chiết ựậu, có bổ sung một số chất dinh dưỡng và khoáng chất. * KingB, Pseu: là hai môi trường ựặc hiệu cho nuôi cấy các chủng thuộc chi Bacillus và Pseudomonas.
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ựến hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi khuẩn
đường kắnh vòng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc (D-d)(mm)
TT
Kắ hiệu
1 Ps1 11 12 11 11 12 10 2 TS6 12 12 11 12 12 10 3 BK1 16 14 14 14 16 14 4 Ba5.1 15 14 15 15 15 14 5 T15 18 20 18 18 19 18 Số liệu bảng 3.10, 3.11 cho thấy, các chủng VSV nghiên cứu ựều phát triển tốt trong môi trường ựặc hiệu cho từng chủng và các môi trường có nguồn gốc tự nhiên (nước chiết ựậu, gỉựường). Trên môi trường sản xuất SX3 thì tất cả các chủng ựều có mật ựộ tế bào cao hoặc tương ựương khi nuôi cấy chúng trên môi trường ựặc hiệu. Kết quả tương tự khi so sánh hoạt tắnh sinh học của các chủng VSV nghiên cứu trên các môi trường nuôi cấy khác nhau.
Như vậy, có thể lựa chọn môi trường SX3 ựể nhân sinh khối các chủng VSV lựa chọn cho sản xuất chế phẩm vi sinh phòng bệnh héo xanh cây lạc.
B. Nghiên cứu các ựiều kiện sản xuất sinh khối VSV
đề tài ựã sử dụng phương pháp lên men chìm trong thiết bị lên men dung tắch 3lắt/mẻ (ở quy mô phòng thắ nghiệm) ựể nhân sinh khối vi sinh vật,
ựây là phương pháp phổ biến trong quy trình lên men công nghiệp, vì có thể
kiểm soát ựược toàn bộ quá trình lên men một cách dễ dàng. Với phương pháp lên men chìm, vi sinh vật ựược nuôi cấy trong môi trường dịch thể, chúng sẽ phát triển theo chiều ựứng của cột môi trường.
đã tiến hành nghiên cứu các ựiều kiện tối thắch cho nhân sinh khối các
lạc là CP1 (gồm PS1, TS6, BK1, Ba51, T15). Các thông số kỹ thuật cơ bản trong lên men nhân sinh khối VSV ựược thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Thông số kỹ thuật trong lên men nhân sinh khối vi khuẩn (sử dụng
sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng bệnh héo xanh cây lạc)
Ký hiệu chủng vi khuẩn TT Thông số kỹ thuật
PS1 TS6 Ba5.1 BK1 T15 1 pH tối ưu 6,5-7,5 6,5-7,5 6,8-7,0 6,5-7,0 6,5 Ờ 7,0 2 Nhiệt ựộ lên men tối ưu
(0C)
28-30 28-30 28-30 28-30 28 - 30 3 Môi trường lên men SX3 SX3 SX3 SX3 SX3 4 Tốc ựộ cánh khuấy (vòng/phút) 350 350 350 350 350 5 Lưu lượng cấp khắ (lắt không khắ/lắt môi trường/phút) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
6 Thời gian nhân sinh khối (giờ)
36 - 42 36 - 42 42 - 48 42 - 48 42 - 48
Quá trình nhân sinh khối VSV sử dụng ựể sản xuất chế phẩm ựược thực hiện qua các giai ựoạn: nhân giống cấp 1 từ chủng gốc trong bình tam giác 250 ml chứa môi trường KingB (giống gốc ựược lưu giữ bảo quản trong tủ
lạnh và ựược hoạt hóa trước khi nhân giống cấp 1); nhân giống cấp 2 trong thiết bị lên men dung tắch 10 lắt/mẻ với 2 loại môi trường riêng rẽ (King B và SX3), tỉ lệ tiếp giống là 5 %. Nhiệt ựộ lên men 300C, tốc ựộ lắc 350 vòng/phút. pH môi trường lên men 6,5 -7,0. Lưu lượng cấp khắ là 0,75 (lắt không khắ/lắt môi trường/phút). Sau các khoảng thời gian nuôi cấy xác ựịnh mật ựộ tế bào VSV và hoạt tắnh ựối kháng R. solanacearum.
Số liệu ựược thể hiện trong bảng 3.13 và cho thấy, thời gian thu sinh khối tốt nhất của các chủng PS1, TS6 là sau 36 giờ lên men; các chủng BK1, Ba51, T15 là sau 42 giờ lên men.
Bảng 3.13. Mật ựộ tế bào của các chủng VKđK trong hai loại môi trường nghiên cứu
Mật ựộ tế bào VSV (CFU/ml) Môi
trường
Thời gian
lên men PS1 TS6 BK1 Ba5.1 T15 24 4,0x108 3,5x108 1,3x106 3,5x106 1,1x106 30 2,2x109 1,2x109 1,2x107 3,2x107 3,4x107 36 3,9x109 4,4x109 3,9x108 2,4x108 2,9x108 42 3,1x109 3,6x109 4,5x108 3,6x108 3,5x108 KingB 48 1,5x109 2,9x109 3,8x108 2,9x108 1,8x108 24 2,0x108 2,6x108 2,5x106 1,1x106 1,5x106 30 1,8x109 1,0x109 1,8x107 4,1x107 6,2x107 36 3,1x109 3,3x109 2,7x108 2,3x108 2,5x108 42 3,0x109 2,7x109 3,5x108 2,9x108 3,7x108 SX3 48 2,5x109 2,1x109 2,6x108 1,7x108 2,6x108
để có một lượng sinh khối lớn, các chủng VKđK phải ựược lên men trong nồi lên men có dung tắch lớn, vì vậy chúng tôi tiến hành lên men thu sinh khối ựại diện hai nhóm Bacillus và Pseudomonas là chủng PS1 và BK1 trong nồi lên men 100 lắt/mẻ với các ựiều kiện sau: Môi trường SX3, nhiệt ựộ
lên men 300C, tốc ựộ cánh khuấy 150 vòng/phút, tỉ lệ bổ sung giống gốc là 5 %. Mật ựộ tế bào của các chủng BK1 và PS1 ựược kiểm tra sau các thời gian lên men khác nhau. Kết quả minh họa ở bảng 3.14.
Bảng 3.14. Mật ựộ của chủng PS1 và BK1 trong thiết bị lên men dung tắch 100 lắt/mẻ Thời gian (giờ) 24 30 36 42 48 Mật ựộ tế bào chủng BK1 (CFU/ml) 1,5x106 1,8x107 2,6x108 4,5x108 3,6x108 Mật ựộ tế bào chủng PS1 (CFU/ml) 3,0x108 1,8x109 3,5x109 2,0x109 1,1x109 Kết quả kiểm tra lên men trong hệ thống lên men 100 lắt/mẻ cho thấy, có thể sử dụng môi trường SX3 ựể lên men nhân sinh khối chủng BK1 và PS1, mật ựộ tế bào chủng PS1 là cao nhất ựạt ựược 2x109CFU/ml sau khoảng thời gian 36 giờ và chủng BK1 sau 42 giờựạt 4,5x108CFU/ml.
C. Nghiên cứu lựa chọn chất mang
Chất mang là giá thể mà ở ựó vi sinh vật trú ngụ và phát triển ựể ựảm bảo ựạt mật ựộ tế bào theo yêu cầu trong quá trình từ sau khi sản xuất ựến lúc sử dụng, tạo ựiều kiện thuận lợi cho vận chuyển, bảo quản và sử dụng chế
phẩm vi sinh. Chất mang không ựược chứa chất có hại cho người, ựộng thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản. đề tài tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng tồn tại của các chủng VSV tuyển chọn trên các nền chất mang khác nhau như: than bùn, than bùn bổ sung xơ dừa, phân giun, phân compost, mai cua, ựất xạ hiếm. Trên cơ sở ựó ựã lựa chọn ựược loại chất mang phù hợp ựể sản xuất chế phẩm VSV ựối kháng cho cây lạc là than bùn có bổ sung gỉựường và ựất hiếm.
Chất mang sử dụng làm chế phẩm ựược xử lý qua các công ựoạn:
Nghiền nhỏ Trung hòa pH Phối trộn gỉựường ựất xạ hiếm
ựiều chỉnh ựộẩm đóng gói Khử trùng
Chất mang ựược nghiền nhỏ và rây qua rây với kắch thước 0,25 mm. Hạt chất mang càng mịn càng tốt. Sau ựó ựược trung hòa bằng bột CaCO3 ựể ựạt pH từ 6,5-7,0. Chất mang ựược bổ sung thêm gỉ ựường (3 %) và ựất xạ
mang trước khử trùng (20 %) vừa ựảm bảo cho VSV phát triển tốt mà không bị tạp nhiễm sau thời gian bảo quản.
Bảng 3.15. Một số chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh cây lạc
Chất mang ựã xử lý ở trên ựược ựóng vào các túi nilon chịu nhiệt có ựộ
dày 0,02 mm, mỗi túi 50 g-100 g. Các túi ựược hàn kắn, ngoại trừ một lỗ nhỏ
có ựường kắnh khoảng 1cm ựược nút kắn bằng bông có tác dụng tăng cường hiệu quả khử trùng. Túi chất mang ựược khử trùng ở nhiệt ựộ 1210C với thời gian 60 phút trong 2 ngày liên tiếp. Sau khi ựể nguội các túi chất mang ựược hàn kắn và sẵn sàng cho việc nhiễm dung dịch vi sinh vật.
D. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm
Trên cơ sở tổng hợp các kết quả nghiên cứu về công nghệ sản xuất chế
phẩm: tuyển chọn bộ chủng giống vi sinh vật sử dụng cho sản xuất chế phẩm, lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV, các ựiều kiện lên men nhân sinh khối, lựa chọn, xử lý chất mang. đề tài ựã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh héo xanh cây lạc.
Chỉ tiêu chất lượng đơn vịựo Mức chất lượng
độẩm % 29,0 pH - 6,5 -7,0 Hàm lượng hữu cơ % 21,42 Nitơ tổng số % 0,695 Phospho tổng số % 0,186 Kali tổng số % 1,187 Phospho dễ tiêu mg P2O5/100g 11,03 Kali dễ tiêu mg K2O/100g 36,47
Gỉựường % 3,0 đất xạ hiếm % 0,3 Mật ựộ tế bào vi khuẩn ựối kháng R. solanacearum và F. oxysporum CFU/g 1,0 x 109 Tỷ lệ hạn chế bệnh héo xanh % > 60
Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm VSV phòng trừ bệnh héo xanh cây lạc quy mô phòng thắ nghiệm ựược tóm tắt trong sơựồ 3.1.
SƠ đỒ 3.1: QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV đỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY LẠC * Nội dung qui trình + Thiết bị và dụng cụ - Thiết bị khử trùng:
Nồi hấp khử trùng: Áp suất tối thiểu 1,6 bar (tương ựương nhiệt ựộ
khử trùng 1210C); tủ sấy: Nhiệt ựộ từ 40 ựến 2600C. Kiểm tra tế bào VSV tạp nhiễm Chủng giống V Lên men cấp 1 Lên men cấp 2 Thu sinh khối Chất mang Xử lý thô (nghiền, sàng, loại bỏ tạp chất) Trung hòa pH Trộn gỉựường, nguyên tố ựất hiếm, phụ gia Kiểm tra tạp nhiễm Phối trộn Chế phẩm CP1 đóng gói, khử trùng Bảo quản và sử dụng
- Thiết bị nuôi cấy vi sinh vật:
Tủ ấm: Nhiệt ựộ tối ựa 600C; buồng cấy vô trùng.
Máy lắc ổn nhiệt: Tốc ựộ 150 vòng/phút, nhiệt ựộ tối ựa 600C.
- Thiết bịựo lường:
Cân phân tắch (d:0,001); cân kỹ thuật (d:0,1); máy ựo pH; máy ựếm khuẩn lạc; Micropipet: 50-200ộl; 200-1000ộl; 500-5000ộl.
- Máy cất nước 2 lần. - Dụng cụ thuỷ tinh.
Bình tam giác: 250 ml; cốc thuỷ tinh: 100,250, 500,1000 ml; cốc
ựịnh lượng: 50, 100,500 ml; petri: ụ 90mm; ống nghiệm: 18x180mm.
- Thiết bị lên men qui mô 3 lắt/ mẻ môi trường.
+ Hoá chất (đức hoặc Trung Quốc) Cao nấm men Pepton Cao thịt Glyxerin K2HPO4 MgS04.7H20 Casein hydrolysate K2SO4 MgCl2 Penicilium Rỉựường đậu (nước chiết) CaCO3 + Chuẩn bị - Khử trùng dụng cụ
Các dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và xác ựịnh hoạt tắnh của vi sinh vật phải ựược khử trùng bằng cách:
Sấy ở nhiệt ựộ 170 Ờ 1750C không ắt hơn 1 giờ trong tủ sấy hoặc giữ ở áp suất 1,0 Atmotphe (tương ựương 1210C) không ắt hơn 30 phút trong nồi hấp khử trùng.
- Môi trường nuôi cấy
a. Môi trường nuôi cấy (nhân giống cấp 1) vi khuẩn thuộc chi Bacillus
Môi trường ựặc hiệu: Môi trường King B
Thành phần môi trường (gam/lắt)
Thành phần Hàm lượng Cao nấm men 5,0 Pepton: 20,0 Glyxerin: 5,0 K2HPO4: 1,5 MgS04.7H20: 1,5 Nước cất: 1 lắt pH: 7,0 Ờ 7,2
b. Môi trường nuôi cấy (nhân giống cấp 1) vi khuẩn thuộc chi
Pseudomonas
Môi trường ựặc hiệu: Môi trường Pseudomonas
Thành phần môi trường (gam/lắt)
Thành phần Hàm lượng Pepton: 16,0 Casein hydrolysate: 10,0 K2SO4: 10,0 MgCl2: 1,4 Glyxerin: 10,0 Penicilium: 12,0 Nước cất: 1 lắt pH: 7,0 Ờ 7,4
c. Môi trường nuôi cấy (nhân giống cấp 2) vi khuẩn thuộc chi Bacillus,
Thành phần môi trường (gam/lắt) Thành phần Hàm lượng Rỉựường: 10,0 Bột nấm men: 5,0 đậu (nước chiết): 10,0 CaCO3: 1,4 Nước cất: 1 lắt pH: 6,8 Ờ 7,0
d. Môi trường sử dụng kiểm tra VSV tạp nhiễm Môi trường Thạch- Thịt-Pepton
Thành phần môi trường (gam/lắt)
Thành phần Hàm lượng Pepton: 10,0 Cao thịt: 3,0 Thạch: 15,0 Nước cất: 1 lắt pH: 6,5-7,5
(pH môi trường ựược ựiều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)