L ỜI CAM ð OAN
4. ðố it ượng và phạm vi nghiên cứu của ñề tài
3.2.3. ánh giá ñộ c tính của các chủng vi khuẩn ñố i kháng trên cây trồng
Các chủng vi sinh vật nghiên cứu khi ựưa ra ngoài môi trường tự nhiên phải ựảm bảo ựầy ựủ các yếu tố như: không gây bệnh cho thực vật và ựộng vật, ổn ựịnh hoạt tắnh ựối kháng trong thời gian dài... Bởi vậy, ựánh giá
ựộc tắnh của các chủng vi sinh vật ựối kháng với cây trồng là yêu cầu bắt buộc
ựể có thể tiếp tục tiến hành các thắ nghiệm tiếp theo.
Các chủng vi khuẩn ựối kháng ựược ựánh giá ựộc tắnh trên lạc trong nhà lưới với quy mô nhỏ, bằng cách bổ sung trực tiếp dịch lên men các chủng vi khuẩn nghiên cứu vào ựất với mật ựộ 107 - 108 tb/gam ựất, trồng cây, theo dõi sau 4 tuần và ghi kết quả tổng số cây bị chết, thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần. Số liệu ở bảng 6 cho thấy, hầu như tất cả các chủng vi khuẩn chọn lọc
ựều không gây bệnh trên cây lạc.
Những công thức bổ sung các chủng vi khuẩn ựối kháng ựều không gây chết cây, riêng công thức bổ sung chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh như: chủng TH3 (thuộc biovar 3) thì 100 % số cây lạc thắ nghiệm bị chết, ựiều này cho thấy kết quảựánh giá là rất chắnh xác, vì chủng TH3 có tắnh ựộc rất mạnh với lạc. Riêng chủng CX10 ngoài khả năng ựối kháng chúng còn có khả năng kắch thắch sinh trưởng cho cây lạc nên ựược chọn ựể sử dụng cho các thắ nghiệm tiếp theo.
Như vậy, các chủng vi khuẩn ựối kháng ựều không gây ựộc với cây trồng và có thể sử dụng ựể sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng phòng chống bệnh héo xanh lạc. Chủng Bacillus subtillis (thành phần chủ yếu trong chế phẩm men tiêu hóa dùng cho người) dùng làm ựối chứng vi khuẩn không
ựộc.
Bảng 3.6. đánh giá ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn ựối kháng với cây lạc quy mô nhà lưới
Tỷ lệ cây chết (%) Tỷ lệ cây chết (%) Tỷ lệ cây chết (%) TT Ký hich ệu
ủng lần 1 lần 2 lần 3
2 T15 0 0 0
9 TS6 0 0 0
14 CX10 0 0 0
20 B.subtilis 0 0 0
21 TH3 100 100 100
Chú thắch: chủng B. subtilis là thành phần chủ yếu trong men tiêu hóa dùng cho người; TH3: chủng R. solanacearum gây bệnh lạc.
Kết quả này chứng tỏ các chủng vi khuẩn thắ nghiệm ựều không ảnh hưởng xấu ựến sự sinh trưởng và phát triển của lạc.
Bảng 3.7. Tổ hợp các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế
phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc
Chế
phẩm vi khuTên loài ẩn hiKý ệu Hosinh hạt tắnh ọc ựo hođơn vạt lịự c Holựạc t
Cây lạc - CPI Pseudomonas fluorescens Pseudomonas stutzeri Bacillus sp. Bacillus subtilis Bacillus megaterium Ps1 TS6 BK1 Ba5.1 T15 đKVK& N gây bệnh héo đKVK& N gây bệnh héo đKVK& N gây bệnh héo đKVK& N gây bệnh héo, KTSTTV, PG kitin đKVK gây bệnh héo đường kắnh VƯC (mm) đường kắnh VƯC (mm) đường kắnh VƯC (mm) đường kắnh VƯC (mm) IAA: ộg/ml đường kắnh VPGKT (mm) đường kắnh VƯC (mm) 12; 12 12; 10 16; 16 15; 15,5 182 32
Các chủng trên ựã ựược dùng làm vật liệu trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trong phòng trừ bệnh héo xanh lạc. Các chủng vi khuẩn lựa chọn thuộc các chi Pseudomonas và Bacillus ựều có hoạt tắnh ựối
kháng cao với vi khuẩn R. solanacearum gây héo lạc và ổn ựịnh hoạt lực sau nhiều lần thắ nghiệm. Kết quả minh họa trên ảnh 3.5.
Ảnh 3.5. đánh giá hoạt lực ựối kháng VK R. solanacearum gây héo lạc
Tiến hành xác ựịnh sự ựối kháng giữa các chủng nghiên cứu bằng phương pháp cấy vạch tiếp xúc giữa các chủng vi khuẩn trên môi trường
thạch. Kết quả cho thấy, các chủng vi khuẩn tuyển chọn ựều phát triển tốt trên cùng một môi trường dinh dưỡng, không có biểu hiện kìm hãm sinh trưởng giữa các chủng nghiên cứu. Kết quả minh họa trên ảnh 3.6.
Ảnh 3.6. Nuôi cấy các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cùng môi trường dinh dưỡng
Ảnh 3.7: đánh giá tắnh ựộc của hỗn hợp các chủng vi khuẩn ựối kháng trong chế phẩm CPI trên cây lạc
Tiến hành các thắ nghiệm ựánh giá tắnh ựộc của 2 tổ hợp chủng vi khuẩn tuyển chọn trên cây trồng trong nhà lưới ựể xác ựịnh tắnh an toàn của chúng. Kết quảựược minh họa ởảnh 3.7 và ảnh 3.8.
Ảnh 3.8. Ảnh hưởng của hỗn hợp các chủng vi khuẩn ựối kháng trong chế phẩm CPI với bệnh héo xanh lạc - giống MD7
Như vậy, các chủng vi khuẩn ựối kháng nghiên cứu có ựủ ựiều kiện
ựể sản xuất chế phẩm vi sinh sử dụng trong phòng chống bệnh héo xanh lạc. Nhiễm R. Solanacearum Nhiễm F. oxysporum Nhiễm hỗn hợp VKđK Nhiễm hỗn hợp VKđK
3.2.4. đánh giá ựộc tắnh của các chủng vi khuẩn ựối kháng trên chuột bạch
Chuột bạch có trọng lượng 18 g/con ựược nuôi ổn ựịnh trong 3 ngày, sau ựó phân thành các công thức tương ứng với số lượng vi khuẩn ựối kháng thắ nghiệm và chủng B.subtilis trong men tiêu hóa làm ựối chứng dương, mỗi chủng vi khuẩn kiểm ựịnh ựược tiến hành trên 15 con và chia thành 3 lô, mỗi lô ựược bố trắ ăn thức ăn ựã ựược trộn với dịch vi khuẩn ựối kháng tương ứng với các nồng ựộ 2.107; 2.108 và 2.109 tb/g thức ăn. Theo dõi các triệu chứng bất thường của chuột trong vòng 24 giờ ựểựánh giá mức ựộ gây ựộc cấp tắnh và theo dõi khả năng gây ựộc bán trường diễn trong 30 ngày của các chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Kết quả cho thấy, sau 24h theo dõi tất cả số chuột thắ nghiệm ựều phát triển bình thường (số liệu trình bày ở bảng 9) không có hiện tượng ngộ ựộc cấp tắnh xảy ra. Chủng Bacillus subtilis là loại ựược sử dụng trong men tiêu hóa ựược làm chủng vi khuẩn ựối chứng không ựộc. Ở công thức đC chuột
ựược ăn thức ăn bình thường không trộn vi khuẩn nghiên cứu.
Bảng 3.8. đánh giá khả năng gây ựộc tắnh cấp của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên chuột, thắ nghiệm sau 24h
Các triệu chứng quan sát theo thời gian (h) TT Chủng vi khuẩn bào/1g Số tế thức ăn 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 a b c d e f g h i j k l m n o p 1 PS1 2.107 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.108 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt
2.109 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2 TS6 2.107 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.108 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.109 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 3 BK1 2.107 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.108 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.109 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 4 Ba5.1 2.107 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.108 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.109 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 5 T15 2.107 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt a b c d e f g h i j k l m n o p 2.108 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.109 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 6 B.subtilis 2.107 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.108 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2.109 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 7 đC 0 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt
Chú thắch: (bt): bình thường (không có triệu chứng lạ)
Tuy nhiên, ựể ựánh giá chắnh xác tác ựộng lâu dài của các chủng vi khuẩn nghiên cứu, chúng tôi ựã tiến hành cho chuột ăn và uống trực tiếp dịch vi khuẩn với các liều lượng có nồng ựộ vi khuẩn cao nhất (2.109tb/ml dịch uống và 2.109tb/g thức ăn) trong 30 ngày tiếp theo và theo dõi sự thay ựổi của các hiện tượng sinh lý (trọng lượng, các triệu chứng phát sinh không bình thường) và giải phẫu các mẫu cơ quan nội tạng của chuột, chủ yếu là gan.
Bảng 3.9. đánh giá khả năng gây ựộc bán trường diễn của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên chuột bạch sau 30 ngày
Các triệu chứng quan sát theo thời gian (ngày) STT Chủng vi khuẩn 0 2 4 6 8 110 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 1 Ps1 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2 TS6 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 3 BK1 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 4 Ba5.1 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 5 T15 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 6 B. subtilis bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 7 đC bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt
Chú thắch: (bt): bình thường (không có triệu chứng lạ)
Số liệu bảng 3.10 cho thấy, tất cả số chuột thắ nghiệm ựều phát triển bình thường sau 30 ngày, không thể hiện bất kỳ một triệu trứng khác thường nào.
Ảnh 3.10. Hình ảnh mẫu gan chuột ở công thức thắ nghiệm
Kết quả cho thấy sau 30 ngày xử lý, các mẫu gan của chuột ở các lô thắ nghiệm và lô ựối chứng có trọng lượng và kắch thước tương ựương nhau và không có hiện tượng xuất huyết hay hoại tử (ảnh 3.9 và 3.10).
Căn cứựộựộc tắnh cấp của thuốc, tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Việt Nam phân chia các loại thuốc thành 5 nhóm ựộc khác nhau. độc tắnh cấp LD50 qua miệng ở thể rắn:
- Nhóm I rất ựộc: Giá trị LD50 (mg/kg) là 5-50 - Nhóm II ựộc trung bình: Giá trị LD50 là 50-500 - Nhóm III ắt ựộc: Giá trị LD50 là 500-2000 - Nhóm IV rất ắt ựộc: Giá trị LD50 là > 2000
Kết quả cho thấy, tất cả số chuột thắ nghiệm vẫn sống bình thường, không có bất kỳ một hiện tượng nào xảy ra trong quá trình thắ nghiệm, giá trị
LD50 của chuột thắ nghiệm ựối với các dạng của chế phẩm vi khuẩn ựối kháng bằng cả hai phương pháp: uống trực tiếp dung dịch vi khuẩn ựối kháng và trộn chế phẩm vào thức ăn thì giá trị LD50 là không xác ựịnh ựược Ờ không có liều gây chết (không có con chuột nào bị ốm hoặc chết sau 30 ngày thắ nghiệm - ngay cả khi cho ăn ở nồng ựộ vi khuẩn rất cao 2.109tb/g thức ăn).
Như vậy, các chủng vi khuẩn ựối kháng này là rất an toàn, không gây ựộc cho ựộng vật máu nóng tức là cũng không gây ựộc cho người và
ựộng vật. Do ựó, có thể sử dụng các chủng vi khuẩn này trong sản xuất chế
phẩm sinh học.
3.3. Nghiên cứu quy trình sản xuất và ứng dụng chế phẩm vi sinh vật phòng chống bệnh héo xanh cây lạc phòng chống bệnh héo xanh cây lạc
3.3.1. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật ựối kháng bệnh héo xanh cây lạc héo xanh cây lạc
Trên cơ sở nguồn chủng giống VSV tuyển chọn, ựề tài tiến hành nghiên cứu nhân sinh khối các chủng VSV. Trước tiên, tiến hành các nghiên cứu lựa chọn môi trường phù hợp ựể nhân sinh khối VSV, nhằm ựạt sinh khối vi sinh vật tối ựa khi lên men, hoạt tắnh sinh học ựược ổn ựịnh và giá thành rẻ, ựáp
ứng với yêu cầu của sản xuất. Sau ựó, ựề tài tiến hành xác ựịnh ảnh hưởng của các ựiều kiện môi trường nuôi cấy (pH, nhiệt ựộ, chế ựộ cấp khắ...) ựến sinh trưởng, phát triển và hoạt tắnh sinh học của các chủng VSV. đồng thời nghiên cứu lựa chọn, xử lý chất mang, ựiều kiện bảo quản phù hợp ựể từựó xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh ựối kháng phòng trừ bệnh héo xanh lạc.
A. Nghiên cứu lựa chọn môi trường nhân sinh khối VSV
Vi sinh vật luôn có nhu cầu sử dụng các nguồn dinh dưỡng khác nhau
ựể duy trì hoạt ựộng sống của cơ thể. Các chất dinh dưỡng ựược vi sinh vật thu nhận từ môi trường và sử dụng chúng làm nguyên liệu cung cấp cho quá trình trao ựổi chất và sinh tổng hợp các thành phần của tế bào.
đề tài ựã sử dụng các nguồn dinh dưỡng tổng hợp và nguồn dinh dưỡng tự nhiên dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy nhân sinh khối các chủng
VSV. Kết quả so sánh mật ựộ các chủng VSV và hoạt tắnh của chúng trên các môi trường có thành phần dinh dưỡng khác nhau ựược thể hiện trong các bảng 3.10 và 3.11:
Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ựến sự phát triển của các chủng vi khuẩn
Mật ựộ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường
TT Kắ hiệu chủng King Pseu SX1 SX2 SX3 SX4 1 Ps1 2,2x 108 1,6 x109 2,4 x 108 2,9 x 108 4,2 x 109 9,8 x 107 2 TS6 3,1 x108 1,3 x109 2,0 x 108 5,2 x 108 3,4 x 109 7,8 x 107 3 BK1 4,4 x108 2,5x 108 1,2 x 107 2,6 x 107 6,0 x 108 4,0 x 107 4 Ba5.1 6,0 x108 1,1 x108 1,8 x108 8,3 x108 6,9 x108 1,1 x108 5 T15 2,1 x109 1,4 x108 8,5 x107 4,2 x109 3,8 x109 1,4 x108
Chú thắch: * SX1, SX2, SX3, SX4: là các môi trường chứa gỉ ựường mắa, dịch nước chiết ựậu, có bổ sung một số chất dinh dưỡng và khoáng chất. * KingB, Pseu: là hai môi trường ựặc hiệu cho nuôi cấy các chủng thuộc chi Bacillus và Pseudomonas.
Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng ựến hoạt tắnh ựối kháng của các chủng vi khuẩn
đường kắnh vòng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh lạc (D-d)(mm)
TT
Kắ hiệu
1 Ps1 11 12 11 11 12 10 2 TS6 12 12 11 12 12 10 3 BK1 16 14 14 14 16 14 4 Ba5.1 15 14 15 15 15 14 5 T15 18 20 18 18 19 18 Số liệu bảng 3.10, 3.11 cho thấy, các chủng VSV nghiên cứu ựều phát triển tốt trong môi trường ựặc hiệu cho từng chủng và các môi trường có nguồn gốc tự nhiên (nước chiết ựậu, gỉựường). Trên môi trường sản xuất SX3 thì tất cả các chủng ựều có mật ựộ tế bào cao hoặc tương ựương khi nuôi cấy chúng trên môi trường ựặc hiệu. Kết quả tương tự khi so sánh hoạt tắnh sinh học của các chủng VSV nghiên cứu trên các môi trường nuôi cấy khác nhau.
Như vậy, có thể lựa chọn môi trường SX3 ựể nhân sinh khối các chủng VSV lựa chọn cho sản xuất chế phẩm vi sinh phòng bệnh héo xanh cây lạc.
B. Nghiên cứu các ựiều kiện sản xuất sinh khối VSV
đề tài ựã sử dụng phương pháp lên men chìm trong thiết bị lên men dung tắch 3lắt/mẻ (ở quy mô phòng thắ nghiệm) ựể nhân sinh khối vi sinh vật,
ựây là phương pháp phổ biến trong quy trình lên men công nghiệp, vì có thể
kiểm soát ựược toàn bộ quá trình lên men một cách dễ dàng. Với phương pháp lên men chìm, vi sinh vật ựược nuôi cấy trong môi trường dịch thể, chúng sẽ phát triển theo chiều ựứng của cột môi trường.
đã tiến hành nghiên cứu các ựiều kiện tối thắch cho nhân sinh khối các