Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (igy) kháng trực khuẩn mủ xanh

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TIM SUNNARY NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY) KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TIM SUNNARY NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY) KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch Mã số: 62.72.01.09 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS LÊ VĂN ĐÔNG TS. LÊ THU HỒNG HÀ NỘI NĂM 2013 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng các thầy cô ở Bộ môn Miễn dịch, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y. Các số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một luận án, luận văn nào khác. TÁC GIẢ LUẬN ÁN Tim Sunnary LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: TS Lê Văn Đông, TS Lê Thu Hồng, TS Nguyễn Đặng Dũng đã hết lòng động viên, tận tình giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám đốc Học Viện Quân Y, Ban giám đốc Bệnh viện 103, Phòng đào tạo Sau đại học, Phòng quản lý nghiên cứu khoa học Học viện Quân y; Đại Sự Quán đặc mệnh toàn quyền và Tuỳ Viên Quân Sự Vương quốc Căm-Pu-Chia tại Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nhân viên các đơn vị: Hệ Quốc Tế, Bộ môn Miễn Dịch, Phòng Protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y đã tận tình hướng dẫn và hỗ trợ kỹ thuật cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài nghiên cứu của luận án. Cảm ơn các anh các chị và các bạn đồng nghiệp đã thân ái giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập; Cảm ơn mọi người thân và gia đình đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án. NGHIÊN CỨU SINH Tim Sunnary DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN BCTT Bạch cầu trung tính ĐVDT Đơn vị diện tích ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay (thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym) HGKT Hiệu giá kháng thể HT Huyết thanh HTKTKMX Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh IgY Yolk Immunoglobin (globulin miễn dịch IgY hay kháng thể IgY) KDa Kilo Dalton NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện NKH Nhiễm khuẩn huyết NMSL Nước muối sinh lý SLVK Số lượng vi khuẩn TKMX Trực khuẩn mủ xanh TN Thí nghiệm WB Western blot MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các từ viết tắt sử dụng trong luận án Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ . 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. TRỰC KHUẨN MỦ XANH 3 1.1.1 Đặc điểm hình thể . 3 1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy 3 1.1.3. Khả năng gây bệnh . 5 1.1.4. Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh 6 1.1.5. Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh 6 1.2. NHIỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH 7 1.2.1. Tình hình nhiễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh . 7 1.2.2. Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở bệnh nhân bỏng 8 1.2.3. Một số đặc điểm của nhiễm khuẩn tại vết bỏng do . 9 1.3. CÁC BIỆN PHÁP MIỄN DỊCH TRONG PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH . 10 1.3.1. Vắc-xin trực khuẩn mủ xanh . 10 1.3.2. Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh . 12 1.3.3. Kết hợp vắc-xin, huyết thanh và kháng sinh trong phòng và điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh 15 1.4. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI THU KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU TỪ TRỨNG GÀ 16 1.4.1. Hệ thống miễn dịch của gà 16 1.4.2. Kháng thể IgY . 18 1.4.3. Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY . 19 1.5. ỨNG DỤNG CỦA IgY 22 1.5.1. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán 22 1.5.2. Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh . 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 25 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU . 25 2.1.2. Động vật để gây bỏng thực nghiệm và lây nhiễm trực khuẩn mủ xanh . 26 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU . 26 2.2.1. Trực khuẩn mủ xanh . 26 2.2.2. Hoá chất sinh phẩm . 26 2.2.3. Thiết bị máy móc 27 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.2. Gây miễn dịch . 28 2.3.3. Tách chiết, tinh sạch IgY từ trứng gà . 29 2.3.4.Điện di SDS-PAGE phân tích thành phần protein kháng nguyên của trực khuẩn mủ xanh và độ tinh sạch của chế phẩm IgY 31 2.3.5. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà . 32 2.3.6. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot 33 2.3.7. Thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn . 33 2.3.8. Thử nghiệm tạo vòng kháng khuẩn in vitro trên môi trường đặc . 34 2.3.9. Đánh giá độ ổn định của kháng thể IgY trong quá trình bảo quản . 34 2.3.10. Gây bỏng thỏ thực nghiệm 35 2.3.11. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng . 36 2.3.12. Điều trị vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh . 37 2.3.13. Xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương . 37 2.3.14. Xét nghiệm mô bệnh học 39 2.3.15. Phương pháp xử lý số liệu 41 2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU . 41 2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU . 41 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ . 42 3.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH . 42 3.1.1. Kết quả gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh 42 3.1.2. Tách chiết, tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà 48 3.1.3. Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau . 56 3.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC 58 3.2.1. Hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh trên in vitro 58 3.2.2. Kết quả điều trị vết bỏng thực nghiệm trên thỏ nhiễm bằng chế trực khuẩn mủ xanh phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 61 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN . 69 4.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH . 69 4.1.1. Về gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu ở gà mái đẻ trứng 69 4.1.2. Về tách chiết, tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà . 74 4.1.3. Về độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY . 75 4.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC 77 4.2.1. Về hoạt tính in vitro của chế phẩm kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 77 4.2.2. Về kết quả điều trị vết bỏng nhiễm bằng trực khuẩn mủ xanh chế phẩm kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh 79 KẾT LUẬN 83 KIẾN NGHỊ . 84 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1. Một số kết quả lâm sàng của huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh . 14 1.2. Tính ưu việt của IgY so với IgG . 20 3.1. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng. 55 3.2. Hoạt tính ngưng kết từng chủng của trực khuẩn mủ xanh IgY kháng trực khuẩn mủ xanh . 59 3.3. Tỷ lệ % các loài vi khuẩn phân lập trên vết bỏng thỏ nhiễm trực khuẩn mủ xanh chủng 6P11 . 64 3.4. Tổn thương mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị 66 4.1. Khuyến cáo cách gây miễn dịch . 71 . tài Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng trực khuẩn mủ xanh với các mục tiêu: 1. Chế tạo globulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng gà. DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y TIM SUNNARY NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY) KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH Chuyên ngành: Dị