Nhận xét:
- Chế phẩm IgY thu được với hoạt tính mạnh nhất ở pH 6,0. Điều này cũng phù hợp với đặc tính ổn định của IgY trong điều kiện pH từ 3,5 đến 11,0.
- Ở pH 3,0 hoạt tính của IgY rất yếu có thể do pH quá acid này làm biến tính IgY.
- Ở pH cao hơn (8,0 đến 9,0) cũng làm ảnh hưởng tới hoạt tính của IgY. - pH 6,0 tỏ ra là pH tối ưu để tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng. Điều này cũng phù hợp với những qui tắc chung trong thao tác với các phân tử kháng thể.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY
Lòng đỏ trứng gà sau khi được tách chiết bằng nước với tỷ lệ 1:9, pH 6,0 được tủa với muối sulphat amoni ở các nồng độ từ 20% đến 60%. Chế phẩm thu được tiến hành phản ứng ELISA trong cùng điều kiện thí nghiệm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối sulphat amoni đến hiệu quả tách chiết IgY được thể hiện trong Hình 3.7.
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách chiết IgY.
Nhận xét:
- Kết tủa IgY bằng muối sulphat amoinở nồng độ 40% bão hoà cho hoạt tính kháng thể thu được là mạnh nhất.
- Ở nồng độ muối thấp (20 đến 30%) có thể chưa kết tủa hết IgY còn ở nồng độ muối cao (50 đến 60%) lại có thể tạp lẫn các protein khác không phải IgY vào hỗn hợp protein thu được.
3.1.2.4. Phân tích và tinh sạch sản phẩm IgY bằng sắc ký trao đổi ion
Phân đoạn protein tủa ở 40% sulphat amoni bão hòa sau thẩm tích loại muối được phân tách tiếp bằng sắc ký trao đổi ion. Sắc ký đồ sắc ký trao đổi ion của chế phẩm kháng thể thu được sau kết tủa với sulphat amoni được trình bày trong Hình 3.8. Hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với TKMX trong các phân đoạn sắc ký được kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA và được trình bày trong Hình 3.9.
Hình 3.8: Sắc ký đồ trao đổi ion sản phẩm sau tủa bằng sulphat amoni.
Nhận xét:
- Sắc ký đồ ở Hình 3.8 cho thấy có 2 đỉnh protein. Đỉnh 1 là các protein không bám vào cột và được đẩy ra cùng với dung dịch đệm ở giai đoạn nạp mẫu và rửa cột với dung dịch đệm A có nồng độ muối thấp. Đỉnh 2 là phân đoạn protein được đẩy ra khỏi cột bằng dung dịch đệm B có nồng độ muối cao.
Hình 3.9: Kết quả phân tích bằng ELISA kiểm tra hoạt tính kháng thể ở các phân đoạn sắc ký. Mỗi phân đoạn được pha loãng ở một hàng theo
chiều từ trên xuống dưới
Nhận xét:
- Kết quả khảo sát hoạt tính kháng thể đặc hiệu kháng TKMX ở Hình 3.9 cho thấy phân đoạn ở đỉnh 1 không có hoạt tính kháng thể, có thể thấy đây là các protein tạp. Phân đoạn ở đỉnh 2 có hoạt tính kháng thể mạnh với TKMX tương ứng với phần chứa kháng thể IgY.
- So sánh tỷ lệ tương đối giữa đỉnh 1 và đỉnh số 2 cho thấy sản phẩm IgY thu được sau tủa phân đoạn với sulphat amoni 40% bão hoà còn chưa sạch.
3.1.2.5. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm IgY sau các bước tách chiết,
tinh sạch
Độ tinh sạch của chế phẩm IgY sau các bước tách chiết và tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion được đánh giá tiếp bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính. Kết quả điện di SDS-PAGE được trình bày trong Hình 3.10.
Hình 3.10: Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính các sản
phẩm sau mỗi bước tách chiết tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà.
Ghi chú:
1) Protein toàn phần tách bằng nước cất;
2) Protein sau kết tủa bằng sulphat amoni 40% bão hoà ; 3) Phân đoạn bám cột sắc ký trao đổi ion (đỉnh 2);
M) Protein marker;
Nhận xét:
- Protein toàn phần từ lòng đỏ trứng sau tách bằng nước cất chứa rất nhiều protein tạp. Các protein này được loại bỏ lần lượt bằng tủa phân đoạn với sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion. Qui trình tinh sạch này tương đối đơn giản, cho IgY có độ tinh sạch cao hơn, trên SDS-PAGE thành phần protein tạp ít.
- Phân tích bằng SDS – PAGE cho thấy sản phẩm thu được sau sắc ký là tinh sạch nhất. Tuy nhiên sản phẩm thu được sau tủa với sunphat amoni là tinh sạch và có hoạt tính cao hơn. Với kích thước khoảng 70 kDa và 42 kDa, phù hợp với kích thước chuỗi nặng (H) và chuỗi nhẹ (L) của IgY, khẳng định sản phẩm thu được là IgY.
3.1.2.6. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng
Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng được tính toán dựa trên sản lượng protein thu được sau mỗi bước tách chiết, tinh sạch so với tổng lượng protein có trong mẫu dịch pha loãng lòng đỏ trứng ban đầu. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng.
TT Các bước tách chiết thu được (mg/1 Lượng protein lòng đỏ trứng)
Hiệu suất (%)
Độ tinh sạch kháng thể
1 Dịch thu được sau tủa lipid bằng nước cất
1863,03 100 Tạp lẫn một số thành phần khác 2 Tủa sulphat amoni 202,01 10,84 Tương đối tinh
khiết 3 Sắc ký trao đổi ion 139,98 7,51 Tinh khiết
Nhận xét:
- Hiệu suất thu hồi protein tổng số trong đó có chứa IgY qua các bước có sự khác biệt lớn.
- Sau lọc, mặc dù thu được protein tổng số lớn nhưng kháng thể thu được có hoạt tính thấp do chứa nhiều protein tạp khác.
- Sản phẩm thu được sau tủa với muối sulphat amoni và sắc ký trao đổi ion với số lượng kháng thể thấp nhưng hoạt tính của kháng thể mạnh, độ tinh sạch cao hơn.
3.1.3. Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau quản khác nhau
Để kiểm tra chế phẩm kháng thể IgY thu được sau quá trình tách chiết, tinh sạch và việc bảo quản kháng thể như thế nào để kháng thể không mất đi hoạt tính ức chế đối với TKMX, cần khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm kháng thể IgY ở các điều kiện bảo quản khác nhau: Nhiệt độ phòng; 4ºC và - 20ºC. Độ ổn định của kháng thể IgY trong các điều kiện bảo quản khác nhau được khảo sát thông qua đánh giá hoạt tính kháng thể IgY kháng TKMX bằng phản ứng ELISA với hỗn hợp kháng nguyên siêu nghiền của 7 chủng TKMX đã dùng để gây miễn dịch. Kết quả được thể hiện trong các Hình 3.11 đến 3.13.
Hình 3.11: Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản
Hình 3.12: Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở 4°C.
Hình 3.13: Hoạt tính IgY kháng trực khuẩn mủ xanh sau bảo quản ở -20°C.
Nhận xét:
- Kháng thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng hoạt tính giảm nhanh. Sau 3 ngày hoạt tính IgY giảm còn gần một nửa, sau 5 ngày hoạt tính của kháng thể giảm rõ rệt, gần như mất hết hoạt tính (Hình 3.11).
- Kháng thể bảo quản ở 4ºC, sau 2 tuần hoạt tính kháng thể hầu như không thay đổi. Các lần lấy mẫu tiếp theo, hoạt tính của kháng thể có chiều hướng giảm dần. Sau 16 tuần, hoạt tính kháng thể giảm còn khoảng 75% so với lần lấy mẫu đầu tiên. Điều này cho thấy: khi bảo quản kháng thể ở 4°C, kháng thể được giữ ổn định và còn giữ được hoạt tính tốt nhất trong khoảng từ 2 đến 3 tuần đầu (Hình 3.12).
- Kháng thể được bảo quản ở -20ºC hoạt tính không thay đổi nhiều. Thể hiện bằng các đường biểu diễn trên biểu đồ không có sự chênh lệch. Như vậy để bảo quản được ở thời gian dài, kháng thể cần phải được bảo quản ở điều kiện âm sâu (-20ºC) để giữ được hoạt tính mạnh (Hình 3.13).
3.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO
VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC
3.2.1. Hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh trên in vitro
3.2.1.1. Hoạt tính gây ngưng kết trực khuẩn mủ xanh
Hoạt tính gây ngưng kết trên lam kính vi khuẩn của dung dịch kháng thể IgY nồng độ 1,5 mg/mL với vi khuẩn sống từ khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn được thể hiện trong Hình 3.14 và Bảng 3.2.
Hình 3.14: Ngưng kết vi khuẩn trên lam kính. Nhận xét: Nhận xét:
Ở nồng độ được khảo sát, mặc dù dung dịch IgY có khả năng gây ngưng kết cả 7 chủng vi khuẩn được khảo sát nhưng hoạt tính gây ngưng kết cũng khác nhau giữa các chủng. Kháng thể có hoạt tính ngưng kết mạnh nhất đối với các chủng có ký hiệu P11 (6P11 và M27P11) và ngưng kết yếu hơn với các chủng 7P8, T1100P2, 36 P8.
Bảng 3.2: Hoạt tính ngưng kết từng chủng của trực khuẩn mủ xanh IgY
kháng trực khuẩn mủ xanh
Chủng số 6P11 M27P11 79P16 9HP13 1100P2 7P8 36P8
Hoạt tính
3.2.1.2. Hoạt tính ức chế trên trực khuẩn mủ xanh môi trường thạch đặc
Kết quả khảo sát khả năng ức chế TKMX với mô hình nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch đặc thông qua đánh giá sự hình thành của vòng kháng khuẩn được thể hiện trong Hình 3.15.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.15: Kháng thể IgY ức chế trực khuẩn mủ xanh trên môi trường đặc. Chú thích: Chú thích:
A) Chủng 27P11 (27 mm) B) Chủng 79P16 (28 mm)
Nhận xét:
- Kết quả này cho thấy sau khi ủ kháng thể TKMX sau 24 giờ giếng giếng nhỏ kháng thể kháng TKMX thì vi khuẩn bị ức chế không mọc, tạo ra vòng kháng khuẩn rõ (Hình 3.15 A, B, C). Điều này chứng tỏ chế phẩm IgY thu được cũng có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường thạch đặc.
- Kết hợp hai thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn và tạo vòng kháng khuẩn trên môi trường thạch đặc cho thấy bước đầu thử nghiệm in vitro đã cho thấy sản phẩm kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà có tác dụng ức chế đặc hiệu với TKMX.
3.2.2. Kết quả điều trị vết bỏng thực nghiệm trên thỏ nhiễm bằng chế trực khuẩn mủ xanh phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh trực khuẩn mủ xanh phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh
3.2.2.1. Kết quả gây bỏng thực nghiệm trên thỏ
Kết quả đánh giá tổn thương mô học các vết thương bỏng sau gây bỏng thực nghiệm 24 giờ được thể hiện trong Hình 3.16 (chi tiết được trình bày trong Phụ lục ảnh).
Hình 3.16: Tổn thương mô học vết thương sau gây bỏng thực nghiệm (10X)
Nhận xét chung:
- Mẫu mô được sinh thiết và xử lý làm tiêu bản đúng cách.
- Tổn thương của các vết thương bên phải và bên trái là tương tự nhau. - Các tế bào lớp biểu bì, chân bì, các nang lông,tuyến mồ hôi bị hoại tử, (tế bào trương to, nhân và bào tương bị thoái và đông vón đồng thời bắt màu hồng thuần nhất. Các tế bào sợi và sợi tạo keo ở lớp chân bì mất thớ sợi và bắt màu kiềm nhạt, các mao mạch máu dãn rộng nơi thành mạch máu bị hoại tử đông, mô liên kết ở vùng lân cận bị phù (các tế bào tách rời nhau). Trong lớp chân bì còn thấy hình ảnh phù nề
- Căn cứ hình ảnh Giải Phẫu Bệnh tổn thương của bỏng do cùng một tác nhân gây ra ở cùng một vị trí (da ở vùng lưng thỏ), tổn thương bỏng ở trên thuộc độ III sâu.
3.2.2.2. Kết quả gây nhiễm trực khuẩn mủ xanh lên vết thương bỏng
Kết quả lấy mẫu trước khi gây nhiễm không có vết bỏng nào có TKMX mọc, chứng tỏ điều kiện gây bỏng thực nghiệm không có tạp lẫn TKMX vào vết thương bỏng.
Sau khi gây nhiễm 24 giờ với số lượng 0,5x108
vi khuẩn/vết bỏng, cả 32/32 (100%) vết bỏng đều có TKMX phát triển. Tuy nhiên, số lượng TKMX ở một số vết thương thấp dưới 2x107
vi khuẩn/cm2
.
Những thỏ có ít nhất 1 vết thương có số lượng TKMX dưới 2x107
vi khuẩn/cm2
bị loại ra khỏi nhóm nghiên cứu, kết quả chỉ còn 13 thỏ với 26 vết thương gây nhiễm đạt yêu cầu với số lượng trung bình (1,79 ± 1,43)x109
/cm2 bề mặt vết bỏng. Tỷ lệ gây nhiễm thành công TKMX lên vết bỏng thực nghiệm đạt 13/16 thỏ (81%).
3.2.2.3. Số lượng trực khuẩn mủ xanh trên vết bỏng gây nhiễm trực
khuẩn mủ xanh trước và sau điều trị
Kết quả xét nghiệm số lượng TKMX trên vết bỏng gây nhiễm TKMX trước và sau điều trị bằng chế phẩm IgY kháng TKMX được trình bày trong Hình 3.17 và Bảng 3.3.
Hình 3.17: Biến động số lượng vi khuẩn trực khuẩn mủ xanh ở vết bỏng trước và sau điều trị.
Nhận xét:
- Số lượng vi khuẩn trung bình của TKMX ở nhóm các vết bỏng trước khi được điều trị bằng chế phẩm IgY là (1,76 ± 1,67)x109
/cm2 và trước điều trị bằng nước muối sinh lý là (1,82 ± 1,22)x109
/cm2 là tương đương nhau (p>0,05).
Bảng 3.3: Tỷ lệ % các loài vi khuẩn phân lập trên vết bỏng thỏ nhiễm trực
khuẩn mủ xanh chủng 6P11
(với liều gây nhiễm 0,5 x 108
vi khuẩn/mL) Thời điểm lấy mẫu (ngày thứ) Vết thương đối chứng (n = 13)
Vết thương điều trị bằng IgY (n = 13)
Loài vi khuẩn nhiTỷ lệ ễm Số lượng/cm2
Loài vi khuẩn nhiTỷ lệ ễm lượng/cmSố 2
2 P. aeruginosa 0/13 0 P. aeruginosa 0/13 0 S. aureus 10/13 <104 S. aureus 7/13 <104 3 P. aeruginosa 13/13 (1,82 ± 1,22) x109 P. aeruginosa 13/13 (1,76 ± 1,67) x109 S. aureus 8/13 <104 S. aureus 6/13 <104 S. epidermides 1/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 6 P. aeruginosa 13/13 (7,22 ± 8,95) x108 P. aeruginosa 13/13 (3,45 ± 7,37) x109 S. aureus 7/13 <104 S. aureus 6/13 <104 S. epidermides 1/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 9 P. aeruginosa 13/13 (1,50 ± 5,33) x109 P. aeruginosa 13/13 (1,80 ± 5,49)x105 S. aureus 6/13 <104 S. aureus 6/13 <104 S. epidermides 1/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 12 P. aeruginosa 11/13 (3,24 ± 7,45) x107 P. aeruginosa 5/13 (1,55 ± 5,54) x104 S. aureus 4/13 <104 S. aureus 5/13 <104 S. epidermides 2/13 <104 S. epidermides 8/13 <104
- Sau khi điều trị bằng thay băng và tẩm đắp kháng thể IgY kháng TKMX, số lượng TKMX ở các vết thương có xu hướng giảm dần và giảm rõ
rệt sau ngày thứ 6. Đến ngày thứ 9 sau điều trị một số vết thương đã không còn TKMX phát triển, đây cũng là thời điểm một số vết thương được biểu mô hóa và co kéo kín (Bảng 3.3).
- Ở nhóm đối chứng, các vết thương được thay băng và tẩm đắp nước muối sinh l ý, số lượng TKMX cao nhất vào ngày thứ 6 sau đó có xu hướng giảm dần. Tuy nhiên tốc độ giảm chậm hơn so với nhóm được điều trị bằng kháng thể IgY kháng TKMX. Điều này cho thấy, chế phẩm IgY có tác dụng ức chế TKMX trên các vết bỏng thực nghiệm nhiễm TKMX.
3.2.2.4. Chủng loại và số lượng các vi khuẩn khác ở vết bỏng
Kết quả xét nghiệm số lượng và chủng loại một số vi khuẩn khác trên vết bỏng gây nhiễm TKMX trước và sau điều trị bằng chế phẩm IgY kháng TKMX được trình bày trong Bảng 3.3.
Ngày thứ hai sau gây bỏng, ngay trước khi gây nhiễm TKMX, có 17/26 (65%) vết thương có tụ cầu vàng (S. aureus) mọc.
Kết quả xét nghiệm 1 ngày sau gây nhiễm với TKMX vẫn có 18/26 vết thương có tụ cầu vàng mọc đồng thời có thêm 3/26 vết thương có tụ cầu trắng (S. epidermides) mọc. Tuy nhiên, số lượng của các loại vi khuẩn này đều thấp dưới 104
vi khuẩn/cm2
diện tích vết bỏng.
Kết quả xét nghiệm các ngày 6, 9 và 12 sau điều trị vẫn thấy các vết thương có hai loại vi khuẩn này mọc. Mặc dù số lượng của các vi khuẩn này vẫn duy trì ở mức độ thấp dưới 104
vi khuẩn/cm2
bề mặt vết thương, nhưng các vi khuẩn xuất hiện đều cả ở các vết thương được điều trị bằng kháng thể IgY kháng TKMX và vết thương được điều trị bằng nước muối. Điều này cho thấy kháng thể IgY kháng TKMX không có tác dụng lên các loài vi khuẩn này.
3.2.2.5. Tổn thương mô học ở vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh được