khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà
2.3.5.1. Chuẩn bị phiến nhựa làm phản ứng ELISA
Kháng nguyên TKMX được xử lý bằng phương pháp siêu nghiền với máy siêu âm sau đó ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4ºC, thu hoạch dịch nổi chứa protein siêu nghiền. Định lượng protein bằng phương pháp nhuộm mầu của Bradford với kít định lượng protein của hãng Bio-Rad cung cấp.
Kháng nguyên siêu nghiền được gắn vào giếng ELISA ở nồng độ 5μg/mL trong dung dịch NaHCO3 nồng độ 0,1M, pH 9,6 và ủ qua đêm ở 4ºC. Rửa plate 5 lần bằng PBS-T (0,15M NaCl; 0,02M NaH2PO4; 0,01%Tween 20, pH 7,4), sau đó che phủ các vị trí không gắn kháng nguyên bằng 150μl /giếng dung dịch albumin huyết thanh bò ( BSA) 1% ở 370
C trong 2 giờ. Rửa plate 5 lần với PBS-T sau đó bảo quản trong túi plastic gắn kín ở -20ºC cho đến khi sử dụng.
2.3.5.2. Tiến hành phản ứng ELISA
Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử: Chế phẩm chứa IgY (huyết thanh gà hoặc sản phẩm tách chiết từ lòng đỏ trứng gà) được pha loãng với các nồng độ khác nhau trong dung dịch PBS theo phương thức pha loãng bậc 2.
Bước 2: Tiến hành phản ứng.
- Cho vào các giếng với cùng thể tích 100μl /giếng.
- Ủ ở 37ºC trong 30 phút.
- Thêm vào mỗi giếng 100μl dung dịch cộng hợp kháng thể cừu kháng IgY gà gắn enzym peroxidase.
- Ủ ở 370
C trong 30 phút.
- Rửa bỏ kháng thể không gắn vào giếng.
- Cho vào mỗi giếng 100μl dung dịch cơ chất OPD nồng độ 0,5 mg/mL pha trong dung dịch cơ chất.
Bước 3: Đọc kết quả. Mật độ quang học của các giếng được đo bằng máy đọc DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ) ở bước sóng 450nm. Giá trị OD của các giếng ELISA tỷ lệ thuận với lượng kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên vi khuẩn đã được gắn vào giếng ELISA.